Protocol
Bu protokolü açıklanan tüm hayvan prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber uyarınca yapılmıştır ve Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUCs) tarafından onaylanmıştır.
Femur Kemik İliği 1. Aspirasyon (BM) Hücreler
- Hassas bir buharlaştırıcı ile uygulanan izofluran (% 1-4) ile femur kemik iliği aspirasyonu geçirecek fare anestezisi. Anestezi derinliği cerrahi manipülasyon ve / veya kulak, ayak ve kuyruk tutam ile ilişkili solunum hızında herhangi bir değişiklik olmadığını gözlemleyerek işlem boyunca her 5-10 dk izlenmelidir. Anestezi izofluran ile indüklenen ve izofluran ile işlem boyunca korunur. 0.05-0.1 mg bir dozda buprenorfin bir rüçhan işlem öncesi doz / kg deri altından, her 6-12 saatte bir adj tarif edilen prosedür ile bağlantılı ağrıyı önlemek için kullanılabilirCarprofen için UNCT.
- Kornea kurumasını önlemek için anestezi fare aşağıdaki indüksiyon gözleri oftalmik merhem sürün.
- Kürk dikkatli bir şekilde amaçlanan aspirasyon sitenin alanından daha yaklaşık olarak% 150 daha büyük bir deri bölgesinden kırpılır. Gevşek kürk nemli bir gazlı bezle kaldırılır. İşlem sırasında hipotermi önlemek için dolaşan sıcak su yastığı veya başka güvenli bir termostatik kontrol yüzeyi üzerinde fareyi tutun lütfen.
- (Povidon-iyot (Betadinede) veya klorheksidin (Nolvasan) çalılık ve% 70 izopropil alkol veya% 70 etanol batırılmış gazlı bez ve sünger ile ya dönüşümlü) alternatif scrubs üç set ile aspirasyon geçirecek femur içeren tüm bacak dezenfekte edin.
- BM aspirasyon önce steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile:,: 0.5 ml tüberkülin şırınga (27.5 G ölçer 0.5 cc hacim) ıslatın. PBS 200-500 ul şırınga doldurun ve hemen PBS kovmak. Bu işlem 2-3 t tekrarlayınimes.
- Yüzük parmağı veya beşinci parmak biriyle tibia iterek femur tibia bükük tutun. Uygun anestezi uçak elde edildiğini teyit. Şırınga başparmak ve işaret parmağı kullanılarak yapılır. Bu kondil maruz sağlar ve iğnenin yerleştirilmesini kolaylaştırır.
- İğne femur iki kondillerin arasında güvenli bir şekilde açılmış, böylece şırınga ıslatma sonra patellar tendon boyunca iğne takın. Baş parmak ve işaret parmağı ile femur epifiz yakın gövdesini tutarak, iğne kolayca femur şaft içine sokulur.
- Bu femur şaft ile paralel olacak şekilde dışarı ve yukarı doğru iğne çevirin. Bu eylem, femur milinden kemik iliği içeriğinin alma kolaylaştırır.
- Femoral kemik iliği boşluğuna yavaşça iterken saat yönünün iğne saat yönünde çevirin ve. Nazikçe sy hareket ettirerek iğnenin doğru konumlandırılmasını onaylayınyanal Ringe.
- Ileri ve geri BM boşluğu içinde iğne hareket ederken nazikçe, negatif basınç oluşturarak, geri iğne pistonu çekin. Not: BM aspire hacmi, tipik olarak 0.4-0.8 x 10 6, tek çekirdekli hücreler karşılık gelen yaklaşık 5 ul olacaktır. Başarılı aspirasyon şırınganın tabanında iğnenin üst kan görünümü görsel olarak teyit edilecektir. Kan şırıngaya görülür ise küçük bir kemik veya doku parçası iğne kalmış olması muhtemeldir. Bu, (bu, şırınga BM aspire önce PBS ile doldurulmuş olmalıdır bir nedeni de budur), PBS içinde yukarı ve aşağı hareket eden piston ile iğne kaldırılabilir. Doku şırınga yerinden olamaz, yeni bir iğne ve şırınga (tekrar PBS 200-500 ul şırınga ıslak) kullanın.
- BM başarıyla femur aspire edildikten sonra, femur ve fareden iğne ve şırınga çıkarın.
- Bir mikrofuge'de tüp pr aspire BM Taşı500 ul PBS ile efilled. Bir çok uygulama için, BM Hücreler daha sonra daha fazla işlem mümkünse kadar buz üzerinde tutulmalıdır.
- İşlemin tamamlanmasından sonra, 5 mg / kg deri altından karprofen ile analjezik yönetmek. Sonra anestezi fareyi kaldırmak ve tamamen iyileşti kadar ısıtılmış bir yastık üzerine yerleştirin. NOT: düzgün yapılmazsa eğer aspirasyon prosedürü izleyerek deneyimli hiçbir komplikasyon veya sıkıntı olmamalıdır.
- Konut alanına fareler dönmeden önce, yiyecek ve su yürümelerine ve ulaşabiliyorlar sağlamak. Sonraki 24 saat içinde sıkıntı ya da enfeksiyon sonrası prosedür belirtileri fareler gözlemleyin. Belirtileri şunlardır: sürekli kanama, anemi, uyuşukluk. Bu belirtilerden herhangi sonrası prosedürü görülürse, hayvan (lar) ötenazi olmalı. Not: BM aspirasyon / numune tekrar edilebilir, ancak tekrar prosedür aynı bacağa tekrar travma önlemek için karşı femur üzerinde gerçekleştirilmelidir. Fr ile ilgili çok az bilgi vardırequency ki BM aspirasyon yapılabilir. Femoral Kemik iliği aspirasyonu genellikle artık daha sık her 2 haftadan daha tekrarlanır.
Emişli BM hücrelerinde hücresel İçerik 2. Değerlendirilmesi
- 4 o C ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile bir mikrofüj tüpüne BM aspirasyon ve yerden alınan Pelet hücreleri.
- Süpernatan aspire ve ACK alyuvar lisiz tamponu ("amonyum-klorür, potasyum-" lizis tamponu) içinde 500 ul pelletini.
- 10 dakika boyunca, kırmızı hücre lisis tamponu hücreleri inkübe edin ve daha sonra PBS içinde 1 ml ekleyin ve o 4 C ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hızında tekrar karışımı aşağı doğru döndürün. Not: Kırmızı kan hücresi lize topağı hemen BM mononükleer hücrelerden oluşur. Bu FACS boyaması, hücre sayımı, transplantasyon, sitospin analiz ve / veya herhangi bir başka kullanım (öldürülür farelerden toplanan BM hücrelerinin kullanılacak gibi) için yeniden süspanse edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı bir C57/B6 fare femur BM aspirasyon kurban etme işleminden sonra, aynı fare BM geleneksel hasat ardından BM mononükleer hücreleri elde etmek için kullanılmıştır. Her iki yöntem ile elde edilen BM mononükleer hücreleri daha sonra, BM hücrelerinin (1), sitolojik analizi ile analiz (2) hematopoietik kök / progenitör hücrelerin nispi frekansı (HSPCs) belirlenmesi ve sıralanmış HSPCs (3) ex vivo kültür edilmiştir. Ikinci deney, soy-negatif SCA1 + c-KIT In + (LSK'ya) hücreleri BM aspirasyon ile hem de BM geleneksel hasat elde edilen mononükleer hücrelerden kriteri edilmiştir. Her iki yöntemle elde edilen 150 sol seçim Hücreler daha sonra, teknik iki kopya halinde 7 gün için myeloid-eritroid sitokinler ihtiva eden metil yan-katı ortam içinde kaplandı. Şekil 1 A'da gösterilen veriler, B hücreleri ve toplu HSPCs benzer türleri ve oranlar morfolojik tarafından görülür ve femoral BM aspirasyon veya geleneksel BM hasat kullanarak akış sitometri analizi olduğunu göstermektedir.
Kantitatif femoral kemik iliği aspirasyonu karşı konvansiyonel kemik iliği hasat görülen LSK ve miyeloid progenitör hücrelerin yüzdesini belirlemek için, biz 3 bağımsız özlemleri ve konvansiyonel iliği hasat toplam canlı hücrelerin frekansı olarak LSK'ya ve MP alt gruplarının yüzdesini karşılaştırıldı. Şekil 1C görüntülenen Bu veriler, konvansiyonel kemik iliği hasat ile karşılaştırıldığında femur aspirasyon tarafından toplanan kemik iliğinden LSK'ya ve MP alt popülasyonlar bir azalma ortaya (bu fark istatistiksel olarak herhangi bir nüfus için anlamlı olmasa da).
Metilselülozda ex vivo kültür ardından sol seçim hücre Sıralama (Şekil 1D 'de gösterildiği gibi) koloni sayıları ve femoral kemik iliği aspirasyon ve geleneksel hasat BM ile elde edilen hücre tipleri benzer sonuçlandı. Koloni tipleri gözlenen ve numaralandırılan CFU-GEMM (granülosit, eritrosit, monosit, megakary dahilocyte koloni oluşturan birim), CFU-GM (granülosit, monosit koloni oluşturan birim) ve BFU-E (eritroid patlama oluşturan birim).
Farelerin kurban olmadan iliği içeriğinin incelenmesini kolaylaştırmak için canlı farelerde Şekil 1. Femoral kemik iliği (BM) aspirasyon. (A) Wright Giemsa canlı farelerde BM aspirasyon yoluyla elde edilen mononükleer hücrelerin cytospins lekeli. Yaklaşık 0.4-0.8 x 10 6 tek-çekirdekli hücreleri, her bir femoral aspirasyon elde edilebilir. Genellikle farelerin kurban yoluyla geleneksel BM hücre izolasyonu karşı femoral BM aspirasyon (sağda) ile elde Yabanitip 6 haftalık C57/B6 farelerin içeriğini iliği Burada gösterilen (sol) (ölçek çubuğu 10 mikron) temsil etmektedir. (B) Femoral BM aspirasyon değerlendirilmesi için hücrelerin yeterli bir sayıda sağlarhematopoetik kök / progenitör bölmesinin ment burada gösterildiği gibi (Sağ: BM aspirat hücreleri; Sol: feda farelerden alınan kemik iliği hasat yoluyla elde edilen hücreler). CD34 ve FcyR ifadesi incelendi tarafından tanımlanan hematopoetik kök hücreleri ihtiva gibi soy-negatif Sca-1-c-KIT + miyeloid öncüleri ve bunların alt tipleri soy-negatif Sca-1 + c-KIT + (LSK'ya) hücreleri (ana kapı yaşayan , soy-negatif hücreleri). Gösterilen yüzdeler geçitinde hücrelerin yüzde bakınız. Sol seçim bölgesinin (C) miktarının (hücreler, miyeloid progenitör (MP) hücreleri, ortak miyeloid progenitorlar (soy-negatif Sca-1-c-KIT + CD34 + FcyR ara +), granülosit-makrofaj progenitör hücrelerin (soy-negatif Sca-1-c-KIT + CD34 + FcyR +) ve megakaryosit-eritroid progenitör hücrelerinin (soy-negatif Sca-1-c-KIT + CD34-FcyR-), geleneksel iliği hasat canlı hücre frekansı (n = 3) ve femur kemik iliği aspirasyonu (n = 3). Hata çubukları Standard de temsilmetilselüloz koloni tahlil sapması. (D) Temsilcisi fotoğraflar bir hafta metilselüloz (yukarıda) ve numaraları ve koloni tipleri her yöntemi LSK'ya hücreleri kullanılarak gözlenen içeren miyeloid / eritroid 150 LSK'ya hücrelerin sonra kaplama sonuçlanır. Gözlenen ve numaralandırılmış koloni türleri CFU-GEMM (granülosit eritrosit, monosit, megakaryosit koloni oluşturan birim), CFU-GM (granülosit, monosit koloni oluşturan birim) ve BFU-E (eritroid patlama oluşturan birim) içerir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Seri BM aspirasyon insanlarda hematolojik hastalıkların klinik araştırma için kritik bir rutin bir işlemdir. Uzun deneyler boyunca hücresel bileşiminde ve BM bileşenlerinin karakterizasyonu için farelerde DM'nin benzer bir seri örnekleme gerçekleştirme yeteneği aynı şekilde çok değerlidir. Bu prosedür, fare ödün vermeden, aynı zamanda periferik kan içeriği BM yaşayan hücrelerin yansıtıcı olmayabilir durumda BM ek hücre tiplerinin varlığını tespit etmek için HSPC en karakterizasyonu için yararlıdır. Seri BM aspirasyon insan hücrelerinin varlığını örnek 3 için immün sistemi zayıf farelere zenograftlanmış izlenmesi, daha sonra, bu amaç için çok etkili bir şekilde kullanılmıştır. 0.4-0.8 x 10 6 hücre tipik haliyle her bir dengeleme aspirasyon ile alınır olduğu göz önüne alındığında, bu hücrelerin sitolojik analizi (Şekil 1A) gibi amaçlarla, bir dizi dia için kullanılabilirdiyagnostik akış sitometrisi (Şekil 1 B), hücre (Şekil 1C) kültürü gibi sıralanmış hücrelerin daha fazla alt kullanımı takip sitometrik hücre ayırma, bir nükleik asit çıkarma, sınırlı hücre sayıları proteomik karakterizasyonu yönelik deneyleri için protein ekstraksiyonu ve daha da akış nakli hücreleri ekstre edilmiştir. Aynı zamanda, her femoral aspirasyonu alınan HKH'lerin sayısı bu prosedürde alınan hücrelerin toplam sayısı ile sınırlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Örneğin, soy-negatif SCA1 + cKIT + CD150 + CD48-CD244-HSC hücreleri gibi tanımında dikkate alınarak, HKH'lerin frekans yaklaşık 10 HSCs/100, 000 hücre 7'dir. Bu frekansta dayanarak, yaklaşık 40-80 HKH'lerin her aspirasyon prosedürü ile alınabilir bekleniyor. Şekil 1C'de da belirtildiği gibi, sol seçim ve progenitör hücrelerin sıklığı kemik Marro olarak, istatistiksel olarak anlamlı olmasa da ulaşan, düşükfemoral kemik iliği aspirasyonu ile elde edilen w hücreler, geleneksel kemik iliği hasat ile karşılaştırıldı. Biz cerrahi kemik iliği hasat aspirasyon akrabası ile görülen bu göreli LSK azalma ve progenitör frekans femoral kemik iliği aspirasyonu ile oluşur periferik kanla bulaşma ilgili olduğuna inanıyorlar. Kemik iliğinde az hücre popülasyonu değerlendirmek için femoral kemik iliği aspirasyon Bu sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Bir ek not biz genellikle 6 yaş haftalık veya daha yaşlı farelerde bu işlemi gerçekleştirdik olmasıdır. Biz bu işlem 6 haftalıkken daha az fare ile giderek teknik açıdan zor olacağına inanıyorum.
Bu teknik, ayrıca sürekli bir rekabet deneyinin yeniden oluşturma bağlamında periferal kana karşı DM'nin şimerizmi belirlemek için uygundur. Bu analizlerde, farelerin deneysel kümesinden HSC ait fonksiyonel potansiyel HSC ve bir dizi bilinen bir dizi karşı test edilir# 8217; s okuma (Purton ark tarafından 8 Değerlendirmenizi görmek.) Periferik kan kimerizmi olmanın yanı sıra HSC yılların kimerizmi ile. Periferik kan Kimerizm BM de kimerizmine gelen kontrast eğer olgun dolaşan kan hücrelerine HSPC en düşüklüğüne ayrımında hematopoetik kök hücre bölmesi sonucu etkileyen tedirginlikler. Transplantasyon 9 ve kimerizmin sonra en az 16 hafta süre 10 arasında daha uzun bir süre, örneğin burada gösterildiği gibi özellikle faydalı olabilir HSPC bölmesine erişimi kolaylaştırmak için daha önce teknikleri sonra değişebilir kadar kesin hematopoez oluşturulmamıştır olduğu göz önüne alındığında. Bir son örnekte, Challen et al. Periferik kanda Dnmt3a boş farelerden ortaya indirgenmiş kimerizmin ancak Dnmt3a HSC kimerizmin paradoksal bir artış ile Dnmt3a homozigot doğum sonrası eksiği olan farelerden alınan BM hücrelerinin rekabet nakliNull HSC adlı BM 11. Kendini yenileme artışa rağmen HSC bulunuyor - / - Bu sonuç Dnmt3a bir farklılaşma kusur göstergesi oldu. Ayrıca, bu sonuç, her 16 haftada bir seri rekabetçi nakli deneylerinde tek alıcı nakledilen farelerin kurban zaman ayarlı görüldü. Bu nedenle, farelerin kurban gerektiren ve farelerin devam eden gözlem izin vermeden periferik kan paralel olarak BM hücrelerinin örnekleme için izin deneyler oldukça yararlıdır.
Daha önce de belirtildiği gibi, burada ortaya konan teknik doğrudan farelerin 2,3 ilik boşluğu alanı içine intrafemoral enjeksiyon için kullanılan tekniğe benzer. Doğrudan enjeksiyon intrafemoral bu damar içi enjeksiyon 6,12,13 ile doğrudan karşılaştırıldığında geliştirilmiş bütünleşmesini sağlamak üzere gösterilmiştir farelerde insan ksenograft çalışmaları kolaylaştıran çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu teknik bile izin varHızla insan HSClerin doldurmamak daha önce bilinmeyen sınıfının belirlenmesi için ed.
Şu anda, aynı femur boyunca farelerde DM'nin tekrar örnekleme BM ya da tekrar tekrar beklentileri ile alınan kemik iliği hücreleri sayısında hücresel bileşimi etkileyip etkilemediği bilinmemektedir. Ayrıca, aynı femur tekrar aspirasyon işlemleri gerçekleştirmek için tavsiye zaman minimum tutar bilinmemektedir. Aynı fare tekrar femoral kemik iliği hedeflerine gerçekleştirirken, BM aspirasyon için kullanılan alternatif femur ve> 2 haftalık aralıklarla seri BM aspiratlar gerçekleştirin. Varsa daha fazla çaba türleri ve BM ya da BM mimarisi alınan hücrelerin sayısını belirli aralıklarla farelerde seri femoral BM aspirasyon prosedürlerinin, potansiyel etkilerini anlamaya odaklanmıştır ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
