Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUCs) am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center genehmigt.
1. Aspiration von Knochenmark (BM) Zellen aus dem Femur
- Anesthetize die Maus, die Oberschenkelknochenmarkpunktion mit Isofluran (1-4%) mit einer Genauigkeit Verdampfer verabreicht unterziehen wird. Narkosetiefe sollte alle 5-10 min durch die Beobachtung, dass es keine Veränderung der Atemfrequenz mit chirurgischen Manipulation und / oder Ohr, Zehen und Schwanz Prise verbunden überwacht werden während des gesamten Verfahrens. Anästhesie mit Isofluran induziert und auch während des gesamten Verfahrens mit Isofluran aufrechterhalten. Ein Bezugs vorprozessualer Dosis von Buprenorphin in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg subkutan alle 6-12 Stunden können verwendet werden, um Schmerzen, die mit dem Verfahren als adj zugeordnet verhindernUNCT zu der Carprofen.
- Anwenden Augensalbe für die Augen der Maus nach der Induktion der Anästhesie von Hornhaut Trocknen zu verhindern.
- Das Fell wird vorsichtig von einem Hautbereich etwa 150% größer als die Fläche des beabsichtigten Aspiration Seite abgeschnitten. Lose Fell mit einem feuchten Gaze entfernt. Bitte halten Sie die Maus auf einem umlauf warmem Wasser Pad oder andere sichere thermostatisch gesteuerte Oberfläche zu Unterkühlung während des Verfahrens zu verhindern.
- Desinfizieren Sie die gesamte Bein mit der Oberschenkelknochen, die Streben mit drei Sätzen von Wechsel Peelings (abwechselnd entweder mit einem PVP-Jod (Betadine) oder Chlorhexidin (Nolvasan) Peeling und 70% igem Alkohol oder 70% Ethanol getränkten Gaze Schwämme) unterzogen werden.
- Befeuchten Sie ein 0,5 ml Tuberkulin-Spritze (Volumen: 0,5 cm ³; Weite: 27,5 G) mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bevor Absaugen des BM. Füllen Sie die Spritze mit 200-500 ul PBS und sofort vertreiben die PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3 times.
- Halten Sie das Schienbein gebogen vom Oberschenkelknochen durch Drücken der Tibia entweder mit dem Ringfinger oder dem fünften Finger. Zu bestätigen, dass eine geeignete Anästhesieebene erreicht ist. Die Spritze wird mit dem Daumen und dem Zeigefinger gehalten wird. Dies ermöglicht die Kondylen ausgesetzt sein und erleichtert das Einführen der Nadel.
- Nach Benetzung der Spritze und stechen Sie die Nadel durch die Patellasehne, sodass die Nadel sicher zwischen den beiden Kondylen des Oberschenkelknochens eingelegt. Durch Halten der Diaphyse der Nähe der Epiphyse des Femurs mit dem Daumen und dem Zeigefinger wird die Nadel in den Schaft des Oberschenkelknochens leicht eingeführt.
- Schwenken der Nadel nach außen und oben, so daß sie parallel mit der Achse des Femurs ist. Diese Maßnahme erleichtert Abruf von Knochenmark Inhalte aus dem Femurschaft.
- Drehen Sie die Nadel im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn und schieben Sie sie langsam in die Oberschenkelmarkhöhle. Überprüfen Sie die korrekte Positionierung der Nadel durch leichtes Bewegen des syRinge seitlich.
- Ziehen Sie die Nadel Kolben zurück, wodurch Unterdruck, während Sie die Nadel hin und her in der BM Höhle. Hinweis: Das Volumen des angesaugten BM ungefähr 5 &mgr; l entspricht, die typischerweise 0,4-0,8 x 10 &sup6; mononukleare Zellen sein. Erfolgreiche Aspiration wird visuell durch das Auftreten von Blut in der Spitze der Nadel in der Basis der Spritze bestätigt werden. Wenn kein Blut in der Spritze gesehen ist es wahrscheinlich, daß ein kleiner Knochen oder Gewebefragment in der Nadel stecken. Dies kann von der Nadel durch Bewegen des Kolbens nach oben und unten in PBS (dies ist ein Grund, warum der Spritze sollte mit PBS vor dem Absaugen des BM vorgefüllt werden) entfernt werden. Wenn das Gewebe nicht aus der Spritze verdrängt werden, verwenden Sie eine neue Nadel und Spritze (wieder nass die Spritze mit 200-500 ul PBS).
- Sobald BM erfolgreich von der Oberschenkelknochen angesaugt, entfernen Sie die Nadel und Spritze aus dem Oberschenkelknochen und Maus.
- Bewegen saugten BM zu einem Mikrozentrifugenröhrchen prmit 500 ul PBS efilled. Für die meisten Anwendungen, die BM-Zellen sollten dann auf Eis bis zur weiteren Verarbeitung, wenn möglich gehalten werden.
- Nach Abschluss des Verfahrens, verwalten Analgetikum mit Carprofen 5 mg / kg subkutan. Entfernen Sie dann mit der Maus aus der Narkose und legen Sie auf einem Heizkissen, bis vollständig erholt. HINWEIS: Es sollte keine Komplikationen oder Stress erlebt nach der Aspiration Verfahren, wenn es richtig gemacht ist.
- Vor der Rückkehr Mäuse mit dem Gehäuse-Bereich, sicherzustellen, dass sie in der Lage, ambulate und Nahrung und Wasser zu erreichen sind. Beachten Sie die Mäuse auf Anzeichen von Stress oder Infektionen nach dem Eingriff in der nächsten 24 Stunden. Symptome sind: konstant Blutungen, Anämie, Lethargie. Wenn eines dieser Zeichen sind nach dem Eingriff zu sehen ist, sollte das Tier (e) eingeschläfert werden. Hinweis: BM Aspiration / Probenahme kann wiederholt werden, aber der Vorgang wiederholen sollte auf der gegenüberliegenden Oberschenkelknochen wiederholt Trauma der gleichen Bein verhindern, durchgeführt werden. Es gibt wenig Informationen über die frequency dass BM Aspiration durchgeführt werden. Oberschenkelknochenmarkpunktion ist in der Regel nicht häufiger als alle 2 Wochen wiederholt.
2. Beurteilung der Zellgehalt in Aspirated BM Cells
- Pellet-Zellen aus BM Aspiration und in ein Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min abgerufen bei 4 ° C oder RT.
- Saugt den Überstand und das Pellet in 500 &mgr; l von roten Blutkörperchen ACK-Lysepuffer ("Ammoniumchlorid-Kalium" Lysepuffer).
- Die Zellen in rot Zelllysepuffer Inkubation für 10 min und dann 1 ml PBS und Spin-Down der Mischung wieder bei 300 g für 5 min bei 4 ° C oder RT. Hinweis: Die roten Blutkörperchen lysiert Pellet besteht nun aus BM mononukleären Zellen. Diese können für FACS-Färbung, Zellzählung, Transplantation, Zytospin Analyse und / oder einer anderen Nutzung (wie BM-Zellen von Mäusen geerntet geopfert würde verwendet werden) resuspendiert werden.
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Representative Results
Oberschenkel BM Aspiration von einer Live-C57/B6 Maus wurde genutzt, um BM mononuklearen Zellen, gefolgt von herkömmlichen BM Ernte der gleichen Maus nach der Opfer zu erhalten. BM mononukleären Zellen durch die beiden Verfahren erhalten wurden dann mit (1) zytologische Analyse der BM-Zellen untersucht, (2) Bestimmen der relativen Häufigkeit von hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen (HSPCs) und (3) ex-vivo-Kultur von sortierten HSPCs. Im letzteren Experiment linien negativen Sca1 + c-Kit wurden + (LSK)-Zellen aus mononukleären Zellen von BM Absaugen als auch von herkömmlichen BM geernteten sortiert. 150 LSK Zellen von jedem Verfahren erhalten wurden dann in Methylcellulose halbfesten Medien mit myeloischer-Erythrozyten-Zytokine für 7 Tage in der technischen doppelte plattiert. Die in Fig. 1 A gezeigten Daten B veranschaulicht, daß ähnliche Arten und Anteile der Großzellen und HSPCs wurden durch morphologische gesehen und durchflusszytometrische Analyse unter Verwendung entweder Oberschenkel BM Aspiration oder herkömmliche BM Ernte.
Zur quantitativen Bestimmung der Prozentsatz der LSK und myeloischen Vorläuferzellen, die mit konventionellen Knochenmarkentnahme gegen Oberschenkelknochenmarkpunktion gesehen, verglichen wir den Prozentsatz der LSK-und MP-Subpopulationen als Frequenz der gesamten lebenden Zellen in drei unabhängigen Bestrebungen und konventionellen Mark Ernten. Diese Daten, die in Fig. 1C dargestellt, zeigt eine Abnahme der LSK und MP Subpopulationen von Knochenmark durch Absaugen gesammelt Oberschenkel verglichen mit konventionellen Markentnahme (obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war eine Population).
Sortierung von Zellen LSK gefolgt von ex vivo-Kultur in Methylcellulose-Kolonie führte zu ähnlichen Zahlen und Oberschenkelknochenmarkspunktion und herkömmliche BM geernteten Zelltypen (wie in Figur 1D dargestellt). Die beobachteten und aufgezählt Kolonietypen gehören CFU-GEMM (die Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten, megakaryocyte koloniebildende Einheit), CFU-GM (Granulozyten, Monozyten-Kolonie-bildende Einheit) und BFU-E (Erythrozyten-Burst-bildende Einheit).
Abbildung 1. Oberschenkelknochenmark (BM) Aspiration in lebenden Mäusen auf die Prüfung der Mark Inhalte ohne Opfer von Mäusen zu erleichtern. (A) Wright Giemsa Cytospins von mononuklearen Zellen durch BM Aspiration von lebenden Mäusen erhalten. Ca. 0,4-0,8 x 10 6 mononukleären Zellen können in jedem einzelnen Schenkel Aspiration gewonnen werden. Hier dargestellt sind in der Regel Knochenmark von Wildtyp-Inhalt 6 Wochen alten Mäusen durch C57/B6 Oberschenkel BM Aspiration (rechts) gegenüber herkömmlichen BM Zellisolation durch Opfer von Mäusen (links) (Maßstab entspricht 10 um). (B) Oberschenkel BM Aspiration bietet eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Beurteilungment des hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferfach wie hier dargestellt (Rechts: Zellen aus BM absaugen; links: Zellen, die durch die Ernte von Knochenmark von Mäusen geopfert). Lineage-negative Sca-1 + c-KIT + (LSK) Zellen, hämatopoetische Stammzellen sowie Linie-negative Sca-1-c-KIT + myeloischen Vorläuferzellen und ihre Subtypen wie von CD34 und FcyR Ausdruck analysiert wurden definiert (Eltern-Gate lebt , Linie-negativen Zellen). Prozentzahlen angegeben beziehen sich auf Prozent der Zellen im Tor. (C) Quantifizierung der LSK (Zellen, myeloischen Vorläufer (MP)-Zellen, gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (Linie-negative Sca-1-c-KIT + CD34 + FcyR Zwischen +), Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen (Lineage-negative Sca-1-c-KIT + CD34 + FcyR +) und Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläuferzellen (Linie-negative Sca-1-c-KIT + CD34-FcyR-), als einer Frequenz von lebenden Zellen von herkömmlichen Markentnahme (n = 3) und Oberschenkelknochenmarkpunktion (n = 3). Fehlerbalken stellen Standard deAbweichung. (D) Repräsentative Fotos von Methylcellulose-Kolonie-Assay-Ergebnisse eine Woche nach Plattierung von 150 LSK myeloischen Zellen in / erythroiden Methylcellulose (oben) und Zahl und Art der Kolonien mit LSK Zellen aus jedem Verfahren beobachtet enthalten. Die beobachteten und aufgezählt Kolonietypen umfassen CFU-GEMM (der Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten, Megakaryozyten-Kolonie-bildende Einheit), CFU-GM (Granulozyten, Monozyten-Kolonie-bildende Einheit) und BFU-E (Erythrozyten-Burst-bildende Einheit). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Serien BM Anspruch ist ein Routineverfahren entscheidend für die klinische Untersuchung von hämatologischen Erkrankungen beim Menschen. Die Fähigkeit, einen analogen seriellen Abtastung BM in Mäusen für die Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung und Bestandteile BM gesamten langwierigen Experimente ebenfalls sehr wertvoll. Dieses Verfahren ist nützlich für die Charakterisierung von HSPC, ohne Einbußen bei der Maus, sondern auch zum Nachweis der Anwesenheit von zusätzlichen Zelltypen im Knochenmark in Fällen, in denen der Inhalt des peripheren Bluts nicht repräsentativ für die Zellen, die sich im Knochenmark sein. Serien BM Aspiration ist sehr effektiv für diesen Zweck später bei der Überwachung der Anwesenheit von menschlichen Zellen in immunsupprimierte Mäuse xenotransplantiert zum Beispiel 3 verwendet. Da die 0,4-0,8 × 10 6 Zellen werden typischerweise mit jedem BM Aspiration abgerufen Diese Zellen können für eine Reihe von Zwecken, einschließlich zytologische Analyse (1A), Durchmesser verwendet werden,gnostischen Durchflusszytometrie (Abbildung 1B), durchflusszytometrische Zelltrennung gefolgt von weiter stromabwärts Verwendung von sortierten Zellen, einschließlich Kultur von Zellen (Abbildung 1C), Nukleinsäureextraktion, Proteinextraktion für Tests zur Charakterisierung von proteomischen begrenzte Zellzahlen ausgerichtet ist, und sogar noch weiter Transplantation der extrahierten Zellen. Gleichzeitig ist es wichtig zu beachten, dass die Anzahl von HSCs in jedem Schenkel Absaugen wiedergewonnen wird durch die Gesamtzahl der Zellen in dieser Prozedur abgerufen beschränkt. Zum Beispiel, wenn man die Definition der HSK als Linie-negative Sca1 + + CD150 + CKIT CD48-CD244-Zellen, die Häufigkeit der HSK etwa 10 HSCs/100 000 Zellen 7. Basierend auf dieser Frequenz ungefähr 40-80 HSCs erwartet, dass mit jedem Absaugvorgang abgerufen werden. Auch, wie in Fig. 1C angegeben, ist die Frequenz der LSK-und Vorläuferzellen niedriger, jedoch nicht statistische Signifikanz zu erreichen, in Knochen marrow-Zellen über Oberschenkelknochenmarkpunktion erhalten im Vergleich zu herkömmlichen Knochenmark Ernte. Wir glauben, dass diese relative Abnahme der LSK-und Vorläuferfrequenz mit Aspiration relativ zur chirurgischen Knochenmark Ernte gesehen wird, um eine Kontamination mit dem peripheren Blut, die mit Oberschenkelknochenmark-Aspiration tritt zusammen. Diese Einschränkungen des Oberschenkelknochenmarkpunktion bei der Bewertung von seltenen Zellpopulationen im Knochenmark zu beachten. Ein weiterer Hinweis ist, dass wir dieses Verfahren in der Regel in den Mäusen von 6 Wochen alt sind oder älter durchgeführt. Wir glauben, dass dieses Verfahren wäre zunehmend technisch anspruchs mit Mäusen weniger als 6 Wochen alt sind.
Diese Technik ist auch geeignet, die Chimärismus des BM beurteilen, im Gegensatz zu dem peripheren Blut im Rahmen einer laufenden Wettbewerbs Rekonstitutionsexperiment. In diesen Assays wird die Funktionspotential von HSC aus einer experimentellen Gruppe von Mäusen gegen eine Reihe bekannter Anzahl von HSC und geprüfte# 8217; s mit der Auslese wobei peripheren Blut Chimärismus sowie Chimärismus von HSC (siehe Review von Purton 8 et al.). Chimärismus des peripheren Blutes können aus der Chimärismus im BM Kontrast, wenn Störungen, die die blutbildenden Stammzellen Fach Ergebnis beeinträchtigt Differenzierung in reife HSPC der zirkulierenden Blutzellen. Da die definitive Hämatopoese nicht eingerichtet ist, bis mindestens 16 Wochen nach der Transplantation 9 und dieser Chimärismus kann auch nach längerer Zeit 10, Techniken, die früher Zugriff auf die HSPC Fach wie hier dargestellt ist, kann besonders nützlich sein, zu erleichtern ändern. In einem letzten Beispiel, wettbewerbsfähige Transplantation von BM Zellen von Mäusen mit homozygoter postnatale Löschung von Dnmt3a von Challen et al. Ergab reduziert Chimärismus von Dnmt3a-null-Mäusen im peripheren Blut, sondern eine paradoxe Zunahme der HSC Chimärismus von Dnmt3aHSC-Null in der BM-11. Dieses Ergebnis war, der eine Differenzierung Defekt Dnmt3a - / - HSC trotz einer Zunahme der Selbsterneuerung. Darüber hinaus wurde dieses Ergebnis nur in Zeit Opfer Empfänger transplantierten Mäusen seriell Wettbewerbstransplantationsversuche in Abständen von jeweils 16 Wochen. Daher Tests, die für die Probenahme von BM Zellen parallel mit peripheren Blut ohne Opfer der Mäuse erfordern, und ermöglicht kontinuierliche Beobachtung von Mäusen ermöglichen, sind sehr nützlich.
Wie bereits erwähnt, ist die Technik hier gezeigt ähnlich der für intrafemoral Injektion direkt in den Markhohlraum von Mäusen 2,3 Verwendete Technik. Direkteinspritz intrafemoral hat sich als sehr nützlich bei der Erleichterung der menschlichen Xenotransplantat-Untersuchungen an Mäusen, wo es sich gezeigt hat, eine verbesserte Verpflanzung im direkten Vergleich mit einer intravenösen Injektion 6,12,13 bereitzustellen. Diese Technik hat sich sogar erlauben,ed für die Identifikation von bisher unbekannten Klasse von schnell bevöl menschlichen Blutstammzellen.
Derzeit ist nicht bekannt, ob wiederholte Abtastung des BM in Mäusen durch denselben Femur beeinflusst die zelluläre Zusammensetzung des BM oder Anzahl der Markszellen bei wiederholter Bestrebungen abgerufen. Darüber hinaus wird die minimale Zeitdauer empfiehlt sich wiederholen Aspiration Verfahren aus dem gleichen Femurs führen nicht bekannt. Bei der Durchführung von wiederholten Oberschenkelknochenmark Bestrebungen in die gleiche Maus, wechseln den Oberschenkelknochen für BM Aspiration verwendet, und führen Sie die Serien BM saugt im Abstand von> 2 Wochen. Weitere Anstrengungen zum Verständnis der möglichen Auswirkungen konzentriert, soweit vorhanden, der serielle Oberschenkel BM Aspiration Verfahren in Mäusen in bestimmten Abständen von den Arten und der Anzahl der Zellen, die von BM oder Architektur des BM abgerufen werden benötigt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
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- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
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- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
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