Protocol
이 프로토콜에 설명 된 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 실시하고, 메모 리얼 슬로안 - 케터링 암 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUCs)에 의해 승인되었다.
대퇴골에서 골수의 1. 흡인 (BM) 세포
- 정밀 기화기 투여 이소 플루 란 (1-4 %)과 대퇴 골수 흡인을 받게 될 것이다 마우스를 마취. 마취 심도가 수술 조작 및 / 또는 귀, 발가락, 테일 핀치와 관련된 호흡에 변화가없는 것을 관찰함으로써 절차 내내 매 50-10 분을 모니터해야한다. 마취는 이소 플루 란으로 유도하고 또한 이소 플루 란과 절차를 통해 유지된다. 0.05-0.1 밀리그램의 부 프레 노르 핀 투여 량의 선제 사전 절차 용량 / kg 피하 매 6-12 시간은 ADJ로 절차와 관련된 통증을 방지하는데 사용될 수있다Carprofen에 unct.
- 각막 건조를 방지하기 위해 마취의 마우스 다음 유도의 눈 안과 연고를 적용합니다.
- 모피는 신중하게 의도 열망 사이트의 면적보다 약 150 % 더 큰 피부의 영역에서 잘립니다. 느슨한 모피는 촉촉한 거즈 패드로 제거됩니다. 절차를 수행하는 동안 저체온증을 방지하기 위해 순환 온수 패드 또는 다른 안전한 온도 조절 장치로 통제 된 표면에서 마우스를 보관하십시오.
- (포비돈 요오드 (베타 딘) 또는 클로르헥시딘 (Nolvasan) 스크럽 70 % 이소 프로필 알코올이나 70 % 에탄올을 적신 거즈 스폰지 하나와 교류) 교류 수술의 세 가지 세트로 포부를 받게 될 것이다 대퇴골을 포함하는 전체 다리를 소독.
- BM을 흡입하기 전에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 :; : 0.5 ㎖ 투베르쿨린 주사기 (27.5 G 게이지 0.5 cc의 볼륨)을 적 십니다. PBS의 200 ~ 500 ㎕ 씩 주사기를 입력하고 즉시 PBS를 추방. 이 절차 2-3t를 반복IME를.
- 반지 손가락 또는 다섯 번째 손가락 하나와 경골을 눌러 대퇴골에서 경골의 굴곡을 유지합니다. 적절한 마취 비행기가 달성되었는지 확인합니다. 주사기는 엄지와 집게 손가락을 사용하여 유지된다. 이는 관절 구가 노광 될 수 있도록하고 바늘의 삽입을 용이하게한다.
- 바늘이 대퇴골 두 관절 구 사이에 단단히 박혀되도록 주사기를 적시 한 후, 슬개를 통해 바늘을 삽입합니다. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 대퇴골 골단 부근 골간을 유지함으로써, 바늘이 쉽게 대퇴골의 샤프트에 삽입된다.
- 이 대퇴골 축과 평행이되도록 외측으로 상향 바늘 스위블. 이 작업은 대퇴골 축에서 골수 내용의 검색을 용이하게한다.
- 대퇴 골수 구멍으로 천천히 누르면서 시계 반대 방향으로 바늘을 시계 방향으로 돌려. 온화 싸이 이동하여 바늘의 정확한 위치 확인옆으로 ringe.
- 앞뒤로 BM 캐비티 내에서 바늘을 이동하는 동안 부드럽게, 부정 압력을 생성, 다시 바늘 플런저를 잡아 당깁니다. 주 : 흡입 된 BM의 부피는 일반적으로 0.4-0.8 × 106 단핵 세포에 상당 약 5 μL 것이다. 성공 열망은 주사기의 기지에있는 바늘의 위쪽에있는 혈액의 모양을 시각적으로 확인 될 것이다. 피가 주사기에서 볼 경우 그것은 작은 뼈 또는 조직 조각이 바늘에 걸린 가능성이 높습니다. 이것은 (이것은 주사기 BM 흡입 전에 PBS로 채워져해야 하나의 이유이다) PBS에 상하 플런저를 이동함으로써 바늘로부터 제거 될 수있다. 조직이 주사기로부터 빠질 수없는 경우, 새로운 바늘과 주사기 (다시 PBS의 200-500 μL와 주사기를 젖은 상태) 사용.
- BM이 성공적으로 대퇴골에서 흡입되면, 대퇴골 및 마우스에서 바늘과 주사기를 제거합니다.
- 의 미세 튜브 홍보에 흡입 된 BM 이동PBS 500 μL와 efilled. 대부분의 응용 프로그램, BM 세포는 추가 처리를 가능하면 때까지 얼음에 보관해야합니다.
- 절차의 완료 후, 5 ㎎ / ㎏ 피하 carprofen으로 진통을 관리 할 수 있습니다. 그 후 마취에서 마우스를 제거하고 완전히 회복 될 때까지 가열 패드에 배치합니다. 참고 : 만약 제대로 흡입 절차에 따라 경험 합병증이나 고통이 없어야합니다.
- 주택 지역에 마우스를 반환하기 전에, 그들은 음식과 물을 ambulate 및 도달 할 수 있는지. 다음 24 시간에 고통이나 감염 후 절차의 징후 쥐를 관찰합니다. 증상은 다음을 포함한다 : 지속적인 출혈, 빈혈, 혼수를. 이러한 징후는 포스트 절차를 보이는 경우, 동물 (들) 안락사한다. 주 : BM 흡입 / 샘플링을 반복 할 수 있지만 반복 절차는 동일 다리 반복 외상을 방지하기 위해 대향 대퇴골을 수행하여야한다. FR에 대한 가능한 약간의 정보가있다equency 그 BM 열망을 수행 할 수 있습니다. 대퇴 골수 흡입은 일반적으로 더 자주 매 2 주 이상 반복되지 않습니다.
으로 발음 BM 세포의 세포 내용의 2. 평가
- 4 O를 C 또는 RT에서 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 미세 원심 분리 튜브에 BM 열망과 장소에서 검색 펠렛 세포.
- 뜨는을 대기음 후 ACK 적혈구 세포 용해 버퍼 ( "암모늄, 염화 칼륨,"용해 버퍼) 500 μL에 펠렛을 재현 탁.
- 10 분 동안 적혈구 용해 완충액에 세포를 부화 후 PBS 1 ㎖를 추가하고 4 입출력 C 또는 RT에서 5 분 동안 300 XG에 다시 혼합물을 스핀 다운. 참고 : 적혈구 용해 펠릿 지금 BM 단핵 세포로 구성되어 있습니다. 이들은 FACS 염색, 세포 계수, 이식, cytospin 분석 및 / 또는 기타 사용 (희생 생쥐에서 수확 BM 세포를 사용하는 것처럼)에 재현 탁 할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
라이브 C57/B6 마우스의 대퇴골 BM 흡입은 희생 후의 같은 종래의 마우스 BM 수확 하였다 BM 단핵 세포를 수득하는 데에 이용 하였다. 이 방법에 의해 얻어진 BM 단핵 세포이어서, BM 세포 (1) 세포 학적 분석에 의해 분석 (2) 조혈 줄기 / 전구 세포의 상대적인 주파수 (HSPCs)를 결정하고, 소트 HSPCs (3) 체외 배양 하였다. 후자의 실험, 혈통 부정적인 SCA1 + C-KIT에서 + (LSK) 세포는 BM 흡인에 의해뿐만 아니라 기존의 BM 수확 단핵 세포에서 분류되었다. 각각의 방법에 의해 얻어진 150 LSK 세포는 다음 기술 중복 7 일 동안 골수 - 적혈구 사이토 카인을 포함하는 메틸 반 고체 미디어 도금했다. 그림 1에 나타낸 데이터, B는 대량 세포와 HSPCs의 유사한 유형 및 비율이 형태 학적으로 볼 대퇴 BM 흡인 또는 기존의 BM 수확 중 하나를 사용하여 유세포 분석 흐름되었다는 것을 보여줍니다.
정량적으로 대퇴 골수 흡인 대 기존의 골수 수확으로 볼 LSK 및 골수 전구 세포의 비율을 결정하기 위해, 우리는 3 독립 열망과 기존의 골수 수확 총 살아있는 세포의 주파수로 LSK와 MP 모집단의 비율을 비교했다. 그림 1C에 표시이 데이터는, 기존의 골수 수확에 비해 대퇴 흡인에 의해 수집 된 골수에서 LSK와 MP 모집단의 감소를 보여 (이 차이는 통계 학적 인구에 상당한 아니었지만).
메틸 셀룰로오스의 생체 배양 한 다음 LSK 세포의 정렬 (그림 1D 참조) 식민지 번호와 대퇴 골수 흡인 및 기존의 BM 수확하여 얻은 세포 유형과 유사한 결과. 식민지 유형 관찰 열거는 CFU-GEMM (과립구, 적혈구, 단핵구, megakary 포함ocyte 집락 형성 단위), CFU-GM (과립구, 단핵구 콜로니 형성 단위), 및 BFU-E (적혈구 파열 형성 단위).
마우스의 희생없이 골수 내용의 검사를 용이하게하기 위해 살아있는 쥐 그림 1. 대퇴 골수 (BM) 흡인. (A) 라이트 지엠 사 (Giemsa) 라이브 생쥐의 BM 흡입을 통해 얻은 단핵 세포의 cytospins 스테인드. 약 0.4-0.8 × 106 단핵 세포는 각각 대퇴 흡인에 획득 될 수있다. 일반적으로 마우스의 희생을 통해 기존의 BM 세포 분리 대 대퇴 BM 흡인 (오른쪽)에 의해 얻어진 야생형 6 주 이전 C57/B6 마우스의 내용을 골수됩니다 여기에 표시 (왼쪽) (스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다). (B) 대퇴 BM 포부 평가를위한 세포의 적절한 수를 제공합니다조혈 줄기 / 전구 함, 표준 여기에 그림과 같이 (오른쪽 : BM 대기음의 세포, 왼쪽 : 희생 마우스의 골수 채취하여 얻은 세포). CD34 및 FcγR 발현을 분석 하였다에 의해 정의 된 조혈 줄기 세포를 포함뿐만 아니라 혈통 부정적인 무서-1-C-KIT + 골수 전구 세포와 그 하위 리니지 음성 무서-1 + C-KIT + (LSK) 세포 (부모 게이트 살고있다 혈통 부정적인 세포). 퍼센트 (%)는 게이트 내에서 세포의 퍼센트를 참조하십시오. LSK의 (C) 정량 (세포, 골수 전구 (MP) 세포, 일반적인 골수 전구 세포 (혈통 부정적인 무서-1-C-KIT + CD34 + FcγR 중간 +), 과립구 - 대 식세포 전구 세포 (혈통 부정적인 무서-1-C-KIT + CD34 + FcγR +) 및 거핵 세포 - 적혈구 전구 세포 (혈통 부정적인 무서-1-C-KIT + CD34-FcγR-), 기존의 골수 수확에서 살아있는 세포의 주파수로 (N = 3), 대퇴 골수 흡인 (N = 3). 오차 막대는 표준 드를 나타냅니다메틸 식민지 분석의 viation. (D) 대표 사진 주일간 메틸 셀룰로오스 (위)와 숫자와 식민지 유형의 각 방법에서 LSK 세포를 사용하여 관찰을 포함하는 골수 / 적혈구에있는 150 LSK 세포의 도금 후 발생합니다. 관찰 열거 식민지 유형 CFU-GEMM (과립구, 적혈구, 단핵구, 거핵 세포 집락 형성 단위), CFU-GM (과립구, 단핵구 콜로니 형성 단위), 및 BFU-E (적혈구 파열 형성 단위) 등이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
직렬 BM 열망은 인간의 혈액 학적 장애의 임상 연구에 중요한 일상적인 절차입니다. 긴 실험을 통하여 세포의 구성 및 BM의 성분의 특성에 마우스에서 BM의 유사한 일련의 샘플링을 수행 할 수있는 능력 역시 매우 중요합니다. 이 절차는 마우스를 희생하지 않고 또한 말초 혈액의 내용이 BM에 거주하는 세포의 반사되지 않을 수 인스턴스에서 BM있는 추가적인 세포 유형의 존재를 검출하기위한 HSPC의 특성화에 유용하다. 직렬 BM 열망은 인간 세포의 존재, 예를 들어 3 면역 억제 마우스에 이종 이식 모니터링이 나중에 목적을 위해 매우 효과적으로 사용되어왔다. 0.4-0.8 × 106 세포는 일반적으로 각 BM 흡인으로 검색되는 것을 감안할 때, 이러한 세포는 세포 학적 분석 (도 1a)을 포함한 다수의 목적, 디아 위해 이용 될 수있다영지 유동 세포 계측법 (도 1b), 세포 (도 1c)의 배양 등 정렬 된 셀의 하류 사용 뒤에 유세포 세포 분리, 핵산 추출, 제한된 세포 수의 단백체 특성에 맞도록 분석을위한 단백질을 추출하고, 더욱 이식 흐름 의 세포를 추출. 동시에, 각 대퇴 흡인에서 검색된 조혈 모세포의 수가이 절차에서 검색된 셀의 전체 개수에 의해 제한된다는 것을주의하는 것이 중요하다. 예를 들어, 혈통 부정적인 SCA1 + CKIT + CD150 + CD48-CD244-세포로 조혈 모세포의 정의를 고려하고, 조혈 모세포의 주파수는 약 10 HSCs/100, 000 세포 7입니다. 이 주파수에 기초하여, 약 40-80 조혈 각 흡입 절차 검색된 것으로 예상된다. 도 1C에 명시된 바와 같이 또한, LSK 및 전구 세포의 빈도는 뼈 MARRO에서, 통계적인 중요성에 도달하지이라도 낮다대퇴 골수 흡인을 통해 얻은 w 세포는 기존의 골수 수확과 비교. 우리는 수술 골수 수확에 대한 열망 상대적으로 볼이 상대 LSK의 감소 및 전구 주파수가 대퇴 골수 흡인 발생 말초 혈액의 오염과 관련되어 생각합니다. 골수에서 희귀 세포 집단을 평가 대퇴 골수 흡인의 이러한 제한에 유의해야한다. 하나의 추가 메모는 우리가 일반적으로 6 세의 주 또는 그 이상 마우스에서이 절차를 수행 한 것입니다. 우리는이 절차 나이 6 주 미만 쥐 점점 더 기술적 도전이 될 것이라고 생각합니다.
이 기술은 또한 잘 진행 경쟁 재구성 실험 문맥에서 말초 혈 반대로 BM의 키메라를 평가하기 위해 적응된다. 이러한 분석에서, 쥐의 실험 세트에서 HSC의의 기능 잠재력은 HSC & 세트 알려진 숫자에 대해 테스트한다# 8217;의 판독이 (Purton 등 8의 검토를 참조하십시오.) 말초 혈액 키메라 것뿐만 아니라 HSC의의 키메라와. 말초 혈액의 키메라는 BM에서 키메라에서 대조 수 있다면 성숙한 순환 혈액 세포로 HSPC의 손상의 분화 조혈 줄기 세포 구획 결과에 영향을주는 교란. 이식 9 그 키메라 다음 적어도 16 주 동안 10 시간의 더 긴 기간, 등 여기에 그림과 같이 특히 유용 할 수있다 HSPC 실에 대한 이전의 접근을 용이하게 기술 한 후 변경 될 때까지 최종 조혈이 설정되지 않은 것을 감안할 때. 최근의 한 예에서, Challen 등. 말초 혈액에서 Dnmt3a 널 마우스에서 밝혀 감소 키메라하지만 Dnmt3a의 HSC의 키메라의 역설적 증가 Dnmt3a의 동형 접합 출생 후 삭제를 가진 마우스에서 BM 세포의 경쟁 이식널 HSC의 BM 11. 자기 갱신의 증가에도 불구하고 HSC의 - / -이 결과는 Dnmt3a의 차별화 결함 지시했다. 또한,이 결과는 모든 16주 간격으로 직렬 경쟁력 이식 실험 만받는 이식 생쥐의 정해진 희생 보였다. 따라서 쥐의 희생을 요구하고 마우스의 지속적인 관찰을 허용하지 않고 말초 혈액과 병렬로 BM 세포의 샘플링을 허용 분석은 매우 유용하다.
앞서 언급 한 바와 같이, 여기에 설명 된 기술은 직접 마우스 2,3의 골수 공동 공간에 intrafemoral 주입에 사용되는 기술과 비슷합니다. 직접 intrafemoral 주사는 정맥 주사 6,12,13과 직접 비교하여 개선 된 생착을 제공하기 위해 표시되었습니다 생쥐에서 인간의 이종 이식 연구를 촉진하는데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 이 기술도 가능했다빠른 속도로 인간의 조혈 모세포를 채우는 이전에 알려지지 않은 클래스의 식별을위한 ED.
현재 그것은 같은 대퇴골을 통해 생쥐의 BM의 반복 샘플링 BM 또는 반복 열망 검색 골수 세포의 수의 세포 구성에 영향을 미치는 여부를 알 수 없습니다. 또한 같은 대퇴골에서 반복 흡입 절차를 수행하는 것이 좋습니다 최소한의 시간을 알 수 없습니다. 같은 마우스 반복 대퇴 골수 포부를 수행 할 때, BM 흡입에 사용되는 대퇴골을 번갈아> 이주의 간격으로 일련 BM 흡인을 수행합니다. 어떤 경우에 더 노력 종류와 BM 또는 BM의 구조에서 검색 한 세포의 수에 특정 간격으로 마우스의 시리얼 대퇴 BM 흡입 절차, 잠재적 영향을 이해에 초점을 맞춘이 필요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
