Protocol
Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se realizaron de conformidad con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering.
1. Aspiración de médula ósea (MO) Las células del Fémur
- Se anestesia el ratón que se someterá a la aspiración de médula ósea femoral con isoflurano (1-4%), administrado con un vaporizador de precisión. Profundidad de la anestesia debe ser monitoreado cada 5-10 minutos durante todo el procedimiento por la observación de que no hay ningún cambio en la frecuencia respiratoria asociada con la manipulación quirúrgica y / o la oreja, dedo del pie, y de pinzamiento del rabo. La anestesia se indujo con isoflurano y también mantiene durante todo el procedimiento con isoflurano. Una dosis previa al procedimiento preventivo de la buprenorfina a una dosis de 0,05-0,1 mg / kg por vía subcutánea cada 6-12 h se puede utilizar para prevenir el dolor asociado con el procedimiento como un adjUNCT al Carprofeno.
- Aplicar pomada oftálmica a los ojos del ratón después de la inducción de la anestesia para evitar el secado de la córnea.
- La piel es cuidadosamente cortados por un área de piel de aproximadamente 150% mayor que el área de la zona de la aspiración previsto. Piel floja se elimina con una gasa húmeda. Por favor, mantenga el ratón sobre un relleno aislante de agua caliente que circula u otra superficie con control termostático de seguridad para prevenir la hipotermia durante el procedimiento.
- Desinfectar la pierna entera que contiene el fémur, que se someterá a la aspiración con tres conjuntos de matorrales alterna (alternando con ya sea un povidona-yodo (Betadine) o una de clorhexidina (Nolvasan) de fregado y 70% de alcohol isopropílico o 70% de etanol empapado esponjas de gasa).
- Moje un 0,5 ml de tuberculina jeringa (volumen: 0,5 cc; calibre: 27,5 G) con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), antes de aspirar el BM. Llene la jeringa con 200-500 l de PBS y expulsar inmediatamente a la PBS. Repita este procedimiento 2-3 times.
- Mantenga la inclinación de la tibia del fémur empujando la tibia, ya sea con el dedo anular o el dedo meñique. Confirme que un plano anestésico adecuado se ha alcanzado. La jeringa se lleva a cabo utilizando el pulgar y el dedo índice. Esto permite que los cóndilos a estar expuestos y facilita la inserción de la aguja.
- Después de humedecer la jeringa, insertar la aguja a través del tendón rotuliano de manera que la aguja está alojada de forma segura entre los dos cóndilos del fémur. Por la celebración de la diáfisis cerca de la epífisis del fémur con el pulgar y el dedo índice, la aguja se inserta en el eje del fémur fácilmente.
- Girar la aguja hacia fuera y hacia arriba de manera que es paralelo con el eje del fémur. Esta acción facilita la recuperación de los contenidos de la médula ósea del eje del fémur.
- Gire la aguja hacia la derecha y hacia la izquierda mientras empuja lentamente en la cavidad medular femoral. Confirmar la colocación correcta de la aguja moviendo suavemente el SYRinge lateralmente.
- Tire suavemente el émbolo de la aguja hacia atrás, creando una presión negativa, mientras se mueve la aguja de un lado a otro dentro de la cavidad del BM. Nota: El volumen de aspirado de BM será de aproximadamente 5 l que típicamente corresponde a 0,4-0,8 x 10 6 células mononucleares. El éxito de aspiración será confirmada visualmente por la aparición de sangre en la parte superior de la aguja en la base de la jeringa. Si no hay sangre se ve en la jeringa es probable que un fragmento de hueso o tejido pequeña se ha quedado atascado en la aguja. Esto puede ser retirado de la aguja moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo en PBS (esta es una razón por la jeringa debe ser previamente llenada con PBS antes de aspirar el BM). Si el tejido no puede ser desalojado de la jeringa, use una nueva aguja y jeringa (de nuevo mojar la jeringa con 200-500 l de PBS).
- Una vez que BM se aspira con éxito del fémur, retire la aguja y la jeringa del fémur y el ratón.
- Mueva aspirado BM a un pr tubo de microcentrífugaefilled con 500 l de PBS. Para la mayoría de las aplicaciones, las células de la MO entonces deben mantenerse en hielo hasta su procesamiento posterior, si es posible.
- Tras la finalización del procedimiento, administrar analgésico con carprofeno 5 mg / kg por vía subcutánea. A continuación, retire del ratón de la anestesia y colocar en un cojín calentado hasta que se recupere completamente. NOTA: No debe haber ninguna complicación o sufrimiento experimentado tras el procedimiento de aspiración si se hace correctamente.
- Antes de devolver los ratones con el área de vivienda, aseguran que son capaces de deambular y llegar a los alimentos y el agua. Observar los ratones en busca de signos de malestar o procedimiento después de la infección en la siguiente 24 horas. Las señales incluyen: sangrado constante, anemia, letargo. Si alguno de estos síntomas son vistos después del procedimiento, el animal (s) debe ser sacrificado. Nota: la aspiración BM / muestreo se puede repetir, pero la repetición del procedimiento se debe realizar en el fémur opuesto para evitar traumatismos repetidos en la misma pierna. Hay poca información disponible sobre la frequency que la aspiración BM se puede realizar. Aspiración de médula ósea femoral generalmente se repite con más frecuencia de cada 2 semanas.
2. Evaluación del contenido celular en células de aspirado BM
- Precipitar las células recuperadas de BM aspiración y colocar en un tubo de microcentrífuga por centrifugación a 300 g durante 5 min a 4 ° C o RT.
- Aspirar el sobrenadante y luego resuspender el sedimento en 500 l de ACK sangre roja tampón de lisis celular ("amonio-cloruro de potasio" tampón de lisis).
- Se incuban las células en tampón de lisis de glóbulos rojos durante 10 min y a continuación, añadir 1 ml de PBS y centrifugar la mezcla de nuevo a 300 xg durante 5 min a 4 º C o temperatura ambiente. Nota: El pellet lisado de glóbulos rojos ahora consiste en células mononucleares de BM. Estos pueden ser resuspendidas para la tinción de FACS, el recuento de células, trasplante, análisis de citospina y / o cualquier otro uso (tal como se utilizarían las células BM recogidas de ratones sacrificados).
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Representative Results
Femoral BM aspiración de un ratón C57/B6 vivo se utilizó para obtener células mononucleares de BM seguido de la cosecha BM convencional del mismo ratón después del sacrificio. Células mononucleares BM obtenidos por los dos métodos fueron analizadas mediante (1) el análisis citológico de células de la MO, (2) determinar la frecuencia relativa de células madre / progenitoras hematopoyéticas (HSPCs), y (3) el cultivo ex vivo de HSPCs ordenados. En el experimento, Sca1 de linaje negativo última + c-KIT + células (TSI) fueron ordenados a partir de células mononucleares obtenidas por la BM aspiración así como de la cosecha BM convencional. 150 células LSK obtenidos por cada método se sembraron en medios semi-sólidos de metilcelulosa que contienen citoquinas-mieloides eritroide durante 7 días en duplicado técnica. Los datos mostrados en la Figura 1 A, B ilustra que los tipos y proporciones similares de células a granel y HSPCs fueron vistos por morfológica y análisis citométrico de flujo utilizando ya sea la aspiración BM femoral o de la cosecha BM convencional.
Con el fin de determinar cuantitativamente el porcentaje de TSI y células progenitoras mieloides visto con la cosecha de médula ósea convencional frente a la aspiración de médula ósea del fémur, se comparó el porcentaje de LSK y MP subpoblaciones como una frecuencia de células vivas totales en 3 aspiraciones independientes y cosechas ósea convencionales. Estos datos, que se muestra en la Figura 1C, revela una disminución en LSK y MP subpoblaciones de la médula ósea recogidos por aspiración del fémur en comparación con la cosecha de médula ósea convencional (aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa para cualquier población).
Clasificación de células LSK seguido por cultivo ex vivo en metilcelulosa resultó en números de colonias y tipos de células obtenidos por aspiración de médula ósea femoral y la cosecha BM convencional similar (como se muestra en la Figura 1D). Los tipos de colonias observadas y enumerados incluyen CFU-GEMM (el de granulocitos, eritrocitos, monocitos, megakaryunidad ocyte formadoras de colonias), CFU-GM (granulocitos, monocitos unidad formadora de colonias) y BFU-E (eritroide explosión de formación de unidad).
Figura 1. Médula ósea femoral (BM) de aspiración en los ratones vivos para facilitar el examen de los contenidos de médula sin sacrificio de los ratones. (A) Wright Giemsa tiñe cytospins de células mononucleares obtenidas a través de BM aspiración de ratones vivos. Aproximadamente 0,4-0,8 x 10 6 células mononucleares se pueden obtener en cada aspiración femoral individual. Aquí se presentan de médula típicamente contenidos de tipo salvaje de 6 semanas de edad ratones C57/B6 obtenidos por aspiración BM femoral (derecha) frente al convencional de aislamiento de células BM a través del sacrificio de los ratones (izquierda) (barra de escala representa 10 micras). (B) Femoral BM aspiración proporciona un número adecuado de células para evaluarción del compartimiento madre / progenitoras hematopoyéticas como se ilustra aquí (Derecha: células de BM aspirado; izquierda: células obtenidas por extracción de médula ósea de ratones sacrificado). Células de linaje negativo Sca-1 + c-KIT + (TSI) que contiene células madre hematopoyéticas, así como de linaje negativo Sca-1-c-KIT + progenitores mieloides y sus subtipos definidos por CD34 y expresión FcγR se analizaron (puerta de los padres vive , células de linaje negativo). Los porcentajes mostrados se refieren a porcentaje de células dentro de la puerta. (C) Cuantificación de TSI (células, () células MP progenitoras mieloides, células progenitoras mieloides comunes (de linaje negativo Sca-1-c-KIT + CD34 + FcγR intermedio +), células progenitoras de granulocitos y macrófagos células progenitoras-megacariocitos eritroide (linaje negativa Sca-1-c-KIT + CD34-FcγR-), como una frecuencia de células vivas de la cosecha ósea convencional (n (linaje negativo Sca-1-c-KIT + CD34 + FcγR +), y = 3) y aspiración de médula ósea femoral (n = 3). Las barras de error representan las normas deÓ NDELAPOBREZA. (D) fotografías representativas de ensayo de colonias de metilcelulosa resultados una semana después de la galjanoplastia de 150 células LSK en mieloide / eritroide contiene metilcelulosa (arriba) y los números y tipos de colonias observadas utilizando células LSK de cada método. Los tipos de colonias observadas y enumerados incluyen CFU-GEMM (el de granulocitos, eritrocitos, monocitos, megacariocitos unidad formadora de colonias), CFU-GM (el de granulocitos, monocitos unidad formadora de colonia), y BFU-E (eritroide unidad de formación de ráfaga). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
De serie aspiración BM es un procedimiento de rutina crítica para investigación clínica de los trastornos hematológicos en seres humanos. La capacidad de realizar un muestreo en serie análoga de BM en ratones para la caracterización de la composición celular y componentes de la BM a lo largo de largos experimentos es también muy valiosa. Este procedimiento es útil para la caracterización de HSPC de sin sacrificar el ratón, sino también para detectar la presencia de tipos de células adicionales en el BM en casos en los que el contenido de la sangre periférica pueden no ser el reflejo de las células que residen en la BM. De serie aspiración BM se ha usado muy efectivamente para este fin más adelante en el seguimiento de la presencia de células humanas en ratones inmunodeficientes xenoinjertados por ejemplo 3. Dado que 0,4-0,8 x 10 6 células se recuperan típicamente con cada aspiración BM, estas células se pueden utilizar para un número de propósitos incluyendo análisis citológico (Figura 1A), de diámetrocitometría de flujo gnóstico (Figura 1B), la separación de flujo citométrico de células seguido por el uso adicional aguas abajo de células clasificadas incluyendo el cultivo de las células (Figura 1C), la extracción de ácido nucleico, la extracción de proteínas para los ensayos dirigidos a la caracterización proteómica del número de células limitados, y aún más el trasplante células de extraído. Al mismo tiempo, es importante tener en cuenta que el número de las HSC recuperados en cada aspiración femoral está limitado por el número total de células recuperadas en este procedimiento. Por ejemplo, teniendo en cuenta la definición de las HSC como Sca1 de linaje negativo + cKit + CD150 + CD48-CD244-células, la frecuencia de las CMH es de aproximadamente 10 HSCs/100, 000 células 7. Basado en esta frecuencia, se espera que aproximadamente el 40-80 CMH para ser recuperado con cada procedimiento de aspiración. También, como se señala en la Figura 1C, la frecuencia de TSI y células progenitoras es inferior, aunque no alcanzó significación estadística, en Marro huesow células obtenidas a través de la aspiración de la médula ósea del fémur en comparación con la cosecha de médula ósea convencional. Creemos que esta disminución relativa de LSK y frecuencia progenitor visto con la aspiración en relación con la cosecha de la médula ósea quirúrgica está relacionada con la contaminación con sangre periférica que ocurre con la aspiración de médula ósea femoral. Deben tenerse en cuenta Estas limitaciones de aspiración de médula ósea femoral en la evaluación de las poblaciones de células raras en la médula ósea. Una nota adicional es que hemos llevado a cabo por lo general este procedimiento en ratones de 6 semanas de edad o más. Creemos que este procedimiento sería cada vez más difícil técnicamente con los ratones de menos de 6 semanas de edad.
Esta técnica también es muy adecuado para evaluar el quimerismo de la BM a diferencia de la sangre periférica en el contexto de un experimento de reconstitución competitiva en curso. En estos ensayos, el potencial funcional de HSC a partir de un conjunto experimental de ratones se prueba con un conjunto conocido número de HSC y# 8217; s con siendo la lectura quimerismo sangre periférica, así como quimerismo de HSC (véase la revisión de Purton et al 8.). El quimerismo de la sangre periférica puede contrastar desde el quimerismo en el BM, si las perturbaciones que afectan a la hematopoyéticas resultado compartimento de células madre en la alteración de la diferenciación de HSPC de convertirse en células sanguíneas circulantes maduros. Dado que la hematopoyesis definitiva no se ha establecido hasta por lo menos 16 semanas después del trasplante 9 y que quimerismo pueden cambiar después de periodos incluso más largos de tiempo 10, técnicas que faciliten el acceso anterior al compartimiento de HSPC tal como se ilustra aquí pueden ser particularmente útiles. En un ejemplo reciente, el trasplante de células de la MO competitiva de los ratones con deleción homocigótica postnatal de Dnmt3a por Challen et al. Revelaron reducida quimerismo de ratones Dnmt3a nulos en la sangre periférica, sino un aumento paradójico de HSC quimerismo de Dnmt3aNulo de HSC en el BM 11. Este resultado es indicativo de un defecto de diferenciación de Dnmt3a - / - HSC de pesar de un aumento en la auto-renovación. Por otra parte, este resultado se observó sólo en el sacrificio temporizada de ratones trasplantados receptores en experimentos de trasplante competitivos de serie a intervalos de cada 16 semanas. Por lo tanto los ensayos que permiten la toma de muestras de células BM en paralelo con la sangre periférica sin necesidad de sacrificio de los ratones y que permite la observación continua de los ratones son muy útiles.
Como se mencionó anteriormente, la técnica mostrada aquí es similar a la técnica utilizada para la inyección intrafemoral directamente en el espacio de la cavidad ósea de ratones 2,3. Intrafemoral inyección directa ha demostrado ser muy útil para facilitar los estudios de xenoinjertos humanos en ratones en los que se ha demostrado que proporcionan una mejor injerto en comparación directa con la inyección intravenosa 6,12,13. Esta técnica aún se permitiráed para la identificación de la clase hasta ahora desconocida de poblar rápidamente las CMH humanas.
Actualmente no se sabe si el muestreo repetido de la BM en ratones a través de la misma fémur influye en la composición celular de la BM o el número de células de la médula recuperados con aspiraciones repetidas. Por otra parte, no se conoce la cantidad mínima de tiempo conveniente para llevar a cabo procedimientos de aspiración de la repetición de la misma fémur. Al realizar las aspiraciones de médula ósea femoral repetidas en el mismo ratón, alternar el fémur utilizado para BM aspiración y realizar aspirados BM de serie a intervalos de> 2 semanas. Otros esfuerzos se centraron en la comprensión de los efectos potenciales, en su caso, de procedimientos de aspiración de serie femorales BM en ratones a intervalos específicos en los tipos y el número de células recuperadas de BM o la arquitectura de la BM se necesitan.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
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