Protocol
Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono state condotte in conformità con le Linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUCs) al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Aspirazione del midollo osseo (BM) Cellule del femore
- Anestetizzare il mouse che subirà femorale aspirazione del midollo osseo con isoflurano (1-4%), somministrato con un vaporizzatore di precisione. Profondità dell'anestesia deve essere controllata ogni 5-10 minuti durante tutta la procedura osservando che non vi è alcun cambiamento nella frequenza respiratoria associata manipolazione chirurgica e / o l'orecchio, punta e coda pinch. L'anestesia viene indotta con isoflurano e inoltre mantenuto durante tutta la procedura con isoflurano. Una dose pre-procedurale preventivo di buprenorfina alla dose di 0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea ogni 6-12 ore può essere utilizzato per prevenire il dolore associato alla procedura come aggUNCTAD al Carprofene.
- Applicare pomata oftalmica agli occhi del topo dopo induzione di anestesia per evitare l'essiccazione della cornea.
- La pelliccia viene accuratamente ritagliato da una zona di pelle circa il 150% più grande dell'area del sito aspirazione previsto. Pelliccia sciolto viene rimosso con una garza umida. Si prega di tenere il mouse su un tappetino acqua calda circolante o altro cassaforte superficie controllo termostatico per evitare l'ipotermia durante la procedura.
- Disinfettare tutta la gamba contenente il femore, che sarà oggetto di aspirazione con tre serie di scrub alternati (alternati sia con un povidone-iodio (Betadine) o clorexidina (clorexidina) scrub e il 70% di alcool isopropilico o etanolo al 70% imbevuto spugne garza).
- Bagnate un 0,5 ml tubercolina siringa (volume: 0,5 cc; calibro: 27,5 G) con sterile tampone fosfato salino (PBS) prima di aspirare il BM. Riempire la siringa con 200-500 ml di PBS ed espellere immediatamente la PBS. Ripetere questa procedura 2-3 tIME.
- Mantenere la tibia piegato dal femore spingendo la tibia o con il dito anulare o il quinto dito. Verificare che un aereo anestetico adatto è stato raggiunto. La siringa viene tenuto con il pollice e il dito indice. Questo permette ai condili esposto e facilita l'inserimento dell'ago.
- Dopo la bagnatura dei siringa inserire l'ago attraverso il tendine rotuleo modo che l'ago è presentata in modo sicuro tra i due condili del femore. Mantenendo il diafisi vicino alla epifisi del femore con il pollice e l'indice, l'ago viene inserito facilmente nel pozzo del femore.
- Ruotare l'ago verso l'esterno e verso l'alto in modo da essere parallela all'albero del femore. Questa azione facilita il recupero del contenuto di midollo osseo dall'albero femore.
- Girare l'ago in senso orario e antiorario mentre si spinge lentamente nella cavità midollare del femore. Confermare il corretto posizionamento dell'ago spostando delicatamente il syRinge lateralmente.
- Estrarre delicatamente il pistone dell'ago, creando una pressione negativa, mentre si muove l'ago avanti e indietro all'interno della cavità BM. Nota: Il volume di BM aspirato sarà di circa 5 ml, che in genere corrisponde a 0,4-0,8 x 10 6 cellule mononucleari. Aspirazione successo sarà confermata visivamente dalla comparsa di sangue nel superiore dell'ago nella base della siringa. Se nessun sangue è visto nella siringa è probabile che un piccolo frammento osseo o tessuto viene bloccato nell'ago. Questo può essere rimosso dall'ago spostando lo stantuffo su e giù in PBS (questa è una delle ragioni per cui la siringa deve essere riempito con PBS prima aspirazione del BM). Se il tessuto non poter essere rimosse dalla siringa, utilizzare un nuovo ago e siringa (bagnare nuovamente la siringa con 200-500 ml di PBS).
- Una volta BM viene aspirato con successo dal femore, rimuovere l'ago e la siringa dal femore e il mouse.
- Spostare aspirato BM per un pr provetta per microcentrifugaefilled con 500 microlitri di PBS. Per la maggior parte delle applicazioni, le cellule BM devono poi essere tenuti in ghiaccio fino a ulteriore lavorazione, se possibile.
- A seguito del completamento della procedura, somministrare analgesici con carprofene 5 mg / kg per via sottocutanea. Quindi rimuovere mouse dalla anestesia e mettere su un tappetino riscaldato fino pienamente recuperato. NOTA: Non ci dovrebbero essere complicazioni o disagio vissuto seguendo la procedura di aspirazione, se fatto correttamente.
- Prima di tornare topi per la zona abitativa, verificare che siano in grado di deambulare e raggiungere cibo e acqua. Osservare il mouse per segni di sofferenza o di procedura di post infezione nella prossima 24 ore. I segni includono: emorragia costante, anemia, letargia. Se uno qualsiasi di questi segni sono visti procedura di post, l'animale (s) deve essere eutanasia. Nota: BM aspirazione / campionamento può essere ripetuto ma la procedura di ripetizione deve essere eseguita sul femore opposto per evitare traumi ripetuti alla stessa gamba. Ci sono poche informazioni disponibili in merito alla frequency che l'aspirazione BM può essere eseguita. Femorale aspirazione del midollo osseo è generalmente ripetuta non più spesso di una volta ogni due settimane.
2. Valutazione del contenuto cellulare in cellule Aspirato BM
- Cellule pellet recuperati da BM di aspirazione e posto in una provetta per microcentrifuga per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C o RT.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di ACK rosso sangue tampone di lisi cellulare ("ammonio-cloruro di potassio" tampone di lisi).
- Incubare le cellule in tampone di lisi dei globuli rossi per 10 min e poi aggiungere 1 ml di PBS e centrifugare la miscela di nuovo a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C o RT. Nota: Il pellet lisato globuli rossi ora consiste di cellule mononucleate BM. Questi possono essere risospese per FACS colorazione, conteggio delle cellule, il trapianto, l'analisi cytospin e / o di ogni altro uso (come sarebbero stati utilizzati cellule midollari raccolte da topi sacrificati).
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Representative Results
Femorale BM aspirazione di un topo C57/B6 vivo è stato utilizzato per ottenere cellule mononucleate BM seguono convenzionale raccolto BM del mouse stesso dopo il sacrificio. Cellule mononucleate BM ottenuti con i due metodi sono stati poi analizzati mediante (1) analisi citologica delle cellule BM, (2) determinare la frequenza relativa di cellule staminali / progenitrici ematopoietiche (HSPCs), e (3) ex vivo di cultura HSPCs ordinati. Nel secondo esperimento, lignaggio negativo SCA1 + c-KIT + (LSK) sono state filtrate da cellule mononucleate ottenute da BM aspirazione nonché dal convenzionale raccolto BM. 150 celle LSK ottenuti da ciascun metodo sono stati poi placcato in mezzi semi-solidi metilcellulosa contenenti citochine mieloidi-eritroide per 7 giorni in duplicato tecnico. I dati mostrati nella Figura 1 A, B illustra che simili tipi e le proporzioni di cellule sfusi e HSPCs stati visti da morfologica e analisi citofluorimetrica utilizzando aspirazione BM femorale o convenzionale raccolto BM.
Al fine di determinare quantitativamente la percentuale di LSK e cellule progenitrici mieloidi visto con convenzionale prelievo di midollo osseo rispetto femorale aspirazione del midollo osseo, abbiamo confrontato la percentuale di LSK e MP sottopopolazioni come frequenza del totale cellule vive in 3 aspirazioni indipendenti e raccolti osseo convenzionali. Questi dati, visualizzati in Figura 1C, rivela una diminuzione LSK e MP sottopopolazioni di midollo osseo raccolte tramite aspirazione femorale rispetto ai tradizionali raccolto osseo (sebbene questa differenza non era statisticamente significativa per qualsiasi popolazione).
Ordinamento di cellule LSK seguite da ex vivo coltura in metilcellulosa provocato simili numeri di colonie e tipi cellulari ottenute da femorale aspirato midollare e convenzionale raccolto BM (come mostrato nella Figura 1D). I tipi di colonie osservate ed elencati comprendono CFU-GEMM (granulociti, eritrociti, monociti, megakaryocyte-unità formanti colonie), CFU-GM (granulociti, monociti colonie gruppo di formatura), e BFU-E (eritroide scoppio-forming unit).
Figura 1. Femorale midollo osseo (BM) di aspirazione in topi vivi per facilitare l'esame del contenuto osseo senza sacrificio di topi. (A) Wright Giemsa macchiato cytospins di cellule mononucleate ottenute attraverso BM aspirazione di topi vivi. Circa 0,4-0,8 x 10 6 cellule mononucleate possono essere ottenuti in ciascun aspirazione femorale. Indicato qui sono tipicamente midollare contenuti di tipo selvatico 6 settimane i topi vecchio C57/B6 ottenuti tramite aspirazione BM femorale (a destra) contro convenzionale isolamento delle cellule BM attraverso il sacrificio di topi (a sinistra) (barra della scala rappresenta 10 micron). (B) femorale BM aspirazione fornisce un adeguato numero di cellule per valutaremento del vano staminali / progenitrici ematopoietiche come illustrato qui (Destra: cellule da BM aspirato; Sinistra: cellule ottenute dal prelievo di midollo da topi sacrificati). Lineage-negativo Sca-1 + c-Kit + (LSK), le cellule contenenti cellule staminali ematopoietiche così come lignaggio negativo Sca-1-c-KIT + progenitori mieloidi e dei loro sottotipi come definito da CD34 e di espressione FcγR sono stati analizzati (cancello principale sta vivendo , lignaggio negativi celle). Le percentuali indicate si riferiscono alla percentuale di cellule all'interno del cancello. (C) Quantificazione delle LSK (cellule progenitrici mieloidi MP) cellule (, progenitori mieloidi comuni (lignaggio negativo Sca-1-c-KIT + CD34 + FcγR intermedio +), cellule progenitrici granulociti-macrofagi cellule progenitrici megacariociti-eritroide (lignaggio negativo Sca-1-c-KIT + CD34-FcγR-), come una frequenza di cellule vive di convenzionale raccolto osseo (n (lignaggio negativo Sca-1-c-KIT + CD34 + FcγR +), e = 3) e femorale aspirazione del midollo osseo (n = 3). barre di errore rappresentano de normaviata. (D) fotografie rappresentativi di metilcellulosa saggio colonia risultati una settimana dopo la placcatura di 150 cellule LSK in mieloide / eritroide contenente metilcellulosa (sopra) e il numero ed i tipi di colonie osservate utilizzando cellule LSK da ciascun metodo. I tipi di colonie osservate ed elencati comprendono CFU-GEMM (granulociti, eritrociti, monociti, megacariociti unità formanti colonie), CFU-GM (granulociti, monociti colonie gruppo di formatura), e BFU-E (eritroide unità burst-forming). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Serial BM aspirazione è una procedura di routine fondamentale per indagine clinica dei disturbi ematologici negli esseri umani. La possibilità di eseguire un campionamento seriale analogo di BM in topi per la caratterizzazione della composizione cellulare e costituenti di BM tutta esperimenti lunghi è anche molto importante. Questa procedura è utile per la caratterizzazione di HSPC, senza perdere il mouse ma anche per rilevare la presenza di tipi cellulari aggiuntivi nel BM nei casi in cui il contenuto del sangue periferico possono non essere riflettente delle cellule residenti nel BM. Serial BM aspirazione è stato utilizzato molto efficacemente per questo scopo più avanti per individuare la presenza di cellule umane xenotrapiantati in topi immunocompromessi per esempio 3. Dato che 0,4-0,8 x 10 6 cellule sono tipicamente recuperato con ogni aspirazione BM, queste cellule possono essere utilizzati per diversi scopi tra cui l'analisi citologica (Figura 1A), diacitometria a flusso gnostico (Figura 1B), il flusso di separazione citometria cellulare seguito da un ulteriore uso a valle di cellule smistate tra cui coltura di cellule (Figura 1C), estrazione degli acidi nucleici, estrazione di proteine per saggi orientati verso la caratterizzazione proteomica del numero di cellule limitato, e ancora di più il trapianto estratto di cellule. Allo stesso tempo, è importante notare che il numero di CSE recuperati in ogni aspirazione femorale è limitato dal numero totale di cellule recuperate in questa procedura. Per esempio, considerando la definizione di CSE come lignaggio negativo SCA1 CKIT + + CD150 + CD48-CD244 cellule, la frequenza di CSE è di circa 10 HSCs/100, 000 cellule 7. Sulla base di questa frequenza, circa 40-80 CSE dovrebbe essere recuperato con ogni procedura di aspirazione. Inoltre, come osservato nella Figura 1C, la frequenza di LSK e cellule progenitrici è inferiore, pur non raggiungendo la significatività statistica, in Marro ossow cellule ottenute tramite femorale aspirazione del midollo osseo rispetto ai tradizionali prelievo di midollo osseo. Crediamo che questa relativa diminuzione di LSK e frequenza progenitore visto con aspirazione rispetto alla chirurgia prelievo di midollo osseo è legata alla contaminazione con il sangue periferico che si verifica con femorale aspirazione del midollo osseo. Queste limitazioni di femorale aspirato midollare nella valutazione popolazioni di cellule rare nel midollo dovrebbe essere osservato. Una nota aggiuntiva è che abbiamo tipicamente svolto questa procedura in topi di 6 settimane di età o più anziani. Riteniamo che questa procedura sarebbe sempre più tecnicamente impegnativo con i topi meno di 6 settimane di età.
Questa tecnica è adatto anche per valutare il chimerismo del BM rispetto al sangue periferico nel contesto di un esperimento ricostituzione competitiva in corso. In questi saggi, il potenziale funzionale di HSC di da una serie sperimentale di topi è testato contro un determinato numero noto di HSC &# 8217; s con la lettura essendo periferico chimerismo sangue così come chimerismo di HSC (v. recensione di Purton et al 8.). Chimerismo del sangue periferico può contrastare dal chimerismo nel BM se perturbazioni influenzano il risultato compartimento di cellule staminali ematopoietiche nel differenziamento alterata di HSPC di in cellule del sangue circolanti mature. Dato che ematopoiesi definitivo non è stabilito fino ad almeno 16 settimane dopo il trapianto di 9 e che chimerismo possono cambiare dopo periodi anche lunghi di tempo 10, le tecniche che facilitano in precedenza l'accesso al vano HSPC come illustrato qui può essere particolarmente utile. In un esempio recente, il trapianto di cellule midollari competitivo da topi con delezione omozigote post-natale di dnmt3a da Challen et al. Rivelato chimerismo ridotto da topi dnmt3a-null nel sangue periferico, ma un aumento paradossale in HSC chimerismo di dnmt3a-Null HSC è nel BM 11. Questo risultato è indicativo di un difetto di differenziazione di dnmt3a - / - HSC del malgrado un aumento di auto-rinnovamento. Inoltre, questo risultato è stato visto solo in sacrificio a tempo di beneficiari topi trapiantati in esperimenti di trapianto competitivi seriali ad intervalli di ogni 16 settimane. Pertanto saggi che permettono di campionamento di cellule BM in parallelo con sangue periferico senza richiedere sacrificio dei topi e permette l'osservazione permanente dei topi sono molto utili.
Come accennato in precedenza, la tecnica dimostrata qui è simile alla tecnica utilizzata per l'iniezione intrafemoral direttamente nello spazio cavità osseo di topi 2,3. L'iniezione diretta intrafemoral ha dimostrato di essere molto utile nel facilitare studi xenotrapianto umani in topi in cui è stato dimostrato di fornire una migliore attecchimento in confronto diretto con iniezione endovenosa 6,12,13. Questa tecnica ha anche permettereed per l'identificazione del finora sconosciuto classe di rapida compilazione CSE umane.
Attualmente non è noto se campionamento ripetuto della BM nei topi attraverso la stessa femore influenza la composizione cellulare del BM o numero di cellule di midollo recuperati con aspirazioni ripetute. Inoltre, la quantità minima di tempo consigliabile eseguire le procedure di aspirazione ripetute dal medesimo femore non è noto. Durante l'esecuzione di ripetute aspirazioni femorali midollo osseo nel mouse stesso, alternare il femore utilizzato per BM aspirazione ed eseguire aspirati BM seriali ad intervalli di> 2 settimane. Ulteriori sforzi sono concentrati sulla comprensione dei potenziali effetti, se del caso, di serie femorali procedure di aspirazione BM in topi a intervalli specifici sul tipo e numero di cellule recuperate da BM o architettura della BM sono necessari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
