Protocol
Toutes les procédures d'animaux décrits dans le présent protocole ont été menées en conformité avec les lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. D'aspiration de la moelle osseuse (BM) Les cellules de la cuisse
- Anesthésier la souris qui va subir fémorale aspiration de la moelle osseuse à l'isoflurane (1-4%) administré avec un vaporisateur de précision. Profondeur de l'anesthésie doit être surveillée tous les 5-10 minutes tout au long de la procédure en faisant observer qu'il n'y a pas de changement de la fréquence respiratoire associée à la manipulation chirurgicale et / ou de l'oreille, orteil, et pincement de la queue. L'anesthésie est induite par l'isoflurane et a également maintenu tout au long de la procédure à l'isoflurane. Une dose de pré-procédure de préemption de la buprénorphine à une dose de 0,05-0,1 mg / kg par voie sous cutanée toutes les 6-12 heures peut être utilisé pour prévenir la douleur associée à la procédure comme un adjl'équipe de pays de l'Carprofen.
- Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de la souris après l'induction de l'anesthésie pour éviter le dessèchement de la cornée.
- La fourrure est soigneusement coupée à partir d'une zone de peau d'environ 150% supérieure à la surface du site d'aspiration prévue. Fourrure en vrac est enlevé avec un tampon de gaze humide. S'il vous plaît garder la souris sur un tapis de l'eau chaude circulant ou autre surface thermostatique sécurité pour éviter l'hypothermie au cours de la procédure.
- Désinfecter la jambe entière contenant le fémur qui fera l'objet aspiration avec trois ensembles de gommages alternance (en alternance avec soit une povidone-iode (Bétadine) ou une chlorhexidine (Nolvasan) gommage et 70% d'alcool isopropylique ou éthanol à 70% imbibé de compresses de gaze).
- Mouiller une seringue 0,5 ml de tuberculine (volume: 0,5 cm; jauge: 27,5 G) avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) avant d'aspirer la BM. Remplir la seringue avec 200-500 ul de PBS et d'expulser immédiatement le PBS. Répétez cette procédure 2-3 times.
- Gardez la pente tibiale du fémur en appuyant sur le tibia soit avec la bague au doigt ou le cinquième doigt. Assurez-vous que le plan anesthésique approprié a été atteint. La seringue est tenue à l'aide du pouce et de l'index. Ceci permet aux condyles d'être exposés et facilite l'insertion de l'aiguille.
- Après avoir mouillé la seringue, insérer l'aiguille dans le tendon rotulien de sorte que l'aiguille est introduite en toute sécurité entre les deux condyles du fémur. En maintenant la diaphyse à proximité de l'épiphyse du fémur avec le pouce et l'index, l'aiguille est insérée dans le corps du fémur facilement.
- Faire pivoter l'aiguille vers l'extérieur et vers le haut de sorte qu'elle est parallèle à l'axe du fémur. Cette action facilite l'extraction du contenu de la moelle osseuse à partir de l'axe du fémur.
- Mettez l'aiguille dans le sens horaire et anti-horaire tout en poussant lentement dans la cavité de la moelle osseuse du fémur. Confirmer le bon positionnement de l'aiguille en déplaçant doucement le syRinge latéralement.
- Tirez doucement sur le piston de l'aiguille en arrière, créant une pression négative, tout en déplaçant l'aiguille d'avant en arrière dans la cavité BM. Remarque: le volume aspiré de la BM sera d'environ 5 pi qui correspond typiquement à 0,4 à 0,8 x 10 6 cellules mononucléaires. Aspiration retenu doit être confirmée visuellement par l'apparition de sang dans la partie supérieure de l'aiguille dans le fond de la seringue. En l'absence de sang est vu dans la seringue, il est probable que d'un petit fragment de l'os ou du tissu est coincé dans l'aiguille. Ceci peut être retiré de l'aiguille en déplaçant le piston vers le haut et vers le bas dans le PBS (c'est une des raisons pourquoi la seringue doit être prérempli avec du PBS avant d'aspirer la BM). Si le tissu ne peut être délogé de la seringue, utiliser une nouvelle aiguille et la seringue (nouveau mouiller la seringue avec 200-500 ul de PBS).
- Une fois BM est aspiré avec succès du fémur, retirez l'aiguille et la seringue du fémur et de la souris.
- Déplacez aspiré BM à un pr tube de centrifugeuseefilled avec 500 ul de PBS. Pour la plupart des applications, les cellules BM devraient ensuite être conservé sur de la glace jusqu'à ce que le traitement ultérieur si possible.
- Après l'achèvement de la procédure, le carprofène administrer un analgésique à 5 mg / kg par voie sous cutanée. Ensuite, retirer la souris de l'anesthésie et les déposer sur un coussin chauffant jusqu'à ce que complètement rétabli. REMARQUE: Il devrait y avoir aucune complication ou détresse vécue en suivant la procédure d'aspiration si c'est fait correctement.
- Avant de retourner la souris pour le domaine du logement, de s'assurer qu'ils sont capables de déambuler et d'atteindre la nourriture et de l'eau. Observez la souris pour des signes de détresse ou de la procédure après l'infection dans le 24 heures suivant. Les signes comprennent: saignement constant, l'anémie, de la léthargie. Si l'un de ces signes apparaît procédure de post, l'animal (s) devrait être euthanasié. Remarque: BM aspiration / d'échantillonnage peut être répété, mais la procédure de répétition doit être effectuée sur le fémur opposée pour empêcher un traumatisme répété de la même jambe. Il ya peu d'informations disponibles sur le frequency BM que l'aspiration peut être effectuée. Fémorale aspiration de la moelle osseuse est généralement répété pas plus souvent que toutes les 2 semaines.
2. L'évaluation de contenu cellulaire dans les cellules aspiration BM
- cellules à granules extraites de BM aspiration et placer dans un tube de centrifugeuse par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 o C ou RT.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul de sang rouge ACK lyse cellulaire tampon ("ammonium chlorure de potassium" tampon de lyse).
- Incuber les cellules dans un tampon de lyse des globules rouges pendant 10 minutes, puis ajouter 1 ml de PBS et centrifuger à nouveau le mélange à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C ou à la température ambiante. Remarque: Le culot lysées de globules rouges se compose désormais de cellules mononucléaires BM. Ceux-ci peuvent être remises en suspension de coloration FACS, le comptage des cellules, la transplantation, l'analyse de cytospin et / ou toute autre utilisation (comme les cellules BM récoltées à partir de souris sacrifiées seraient utilisés).
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Representative Results
Fémorale BM aspiration d'une souris C57/B6 direct a été utilisé pour obtenir des cellules mononucléées BM suivie par la récolte de la BM conventionnel de la même souris, après sacrifice. Cellules mononucléaires BM obtenus par les deux méthodes ont ensuite été analysées par (1) l'analyse cytologique des cellules de MO, (2) la détermination de la fréquence relative des cellules souches / progénitrices hématopoïétiques (HSPCs), et (3) la culture ex vivo de HSPCs triées. Dans l'expérience ci, lignée négative Sca1 + + c-KIT (LSK) les cellules ont été triées à partir de cellules mononucléaires obtenues par aspiration BM, ainsi que de récolte de BM classique. 150 cellules LSK obtenus par chaque méthode ont ensuite été étalées dans les médias semi-solides méthylcellulose contenant des cytokines myéloïdes érythroïde pendant 7 jours en double technique. Les données de la Figure 1 A, B illustre le fait que les types et les proportions similaires de cellules et HSPCs en vrac ont été vus par morphologique et l'analyse par cytométrie de flux en utilisant soit de l'aspiration ou BM fémorale récolte BM classique.
Afin de déterminer quantitativement le pourcentage de LSK et les cellules progénitrices myéloïdes vu de récolte de moelle osseuse conventionnelle contre fémorale aspiration de moelle osseuse, nous avons comparé le pourcentage de LSK et MP sous-populations en tant que fréquence de cellules vivantes totales dans les trois aspirations indépendants et des récoltes de moelle classiques. Ces données, affichées dans la Figure 1C, montre une diminution de la LSK MP et les sous-populations à partir de la moelle osseuse recueillies par aspiration du fémur par rapport à la récolte de moelle classique (bien que cette différence ne soit pas statistiquement significatif pour toute la population).
Tri des cellules LSK suivis par ex vivo culture en méthylcellulose entraîné similaire le nombre de colonies et de types cellulaires obtenus par ponction de moelle osseuse fémorale et la récolte BM classique (comme le montre la figure 1D). Les types de colonies observées et énumérées comprennent CFU-GEMM (granulocytes, érythrocytes, monocytes, megakaryocyte unité formant des colonies), CFU-GM (les granulocytes, les monocytes unité formant colonie), et BFU-E (burst-érythroïdes formant unité).
Figure 1. Fémorale moelle osseuse (BM) aspiration dans des souris vivantes pour faciliter l'examen du contenu de la moelle sans sacrifice de la souris. (A) Wright Giemsa cytospins de cellules mononucléaires obtenus par BM aspiration de souris vivantes tachée. Environ 0,4 à 0,8 x 10 6 cellules mononucléées peuvent être obtenus dans chaque individu aspiration fémorale. Montré ici sont généralement à moelle contenu de 6 semaines vieilles souris C57/B6 de type sauvage obtenus par aspiration de BM fémorale (à droite) par rapport à l'isolement classique de cellules BM par le sacrifice de la souris (gauche) (barre d'échelle représente 10 um). (B) fémorale BM aspiration fournit un nombre suffisant de cellules pour évaluerment du compartiment souches / progénitrices hématopoïétiques comme illustré ici (à droite: cellules de BM aspiration; Gauche: les cellules obtenues par prélèvement de moelle osseuse de souris sacrifiées). Lineage négatif Sca-1 + c-KIT + (LSK), les cellules contenant des cellules souches hématopoïétiques ainsi que la lignée négatif Sca-1-c-KIT + progéniteurs myéloïdes et leurs sous-types tels que définis par le CD34 et l'expression FCyR ont été analysés (porte de parent vit , les cellules de la lignée négatif). Les pourcentages indiqués se réfèrent à pour cent des cellules dans la porte. (C) Quantification de LSK (cellules, souches myéloïdes) cellules (MP, les progéniteurs myéloïdes communs (lignée négatif Sca-1-c-KIT + CD34 + FCyR intermédiaire +), les cellules progénitrices de granulocytes-macrophages (lignée négatif Sca-1-c-KIT + CD34 + FCyR +) et les cellules progénitrices mégacaryocytes érythroïde (lignée négatif Sca-1-c-KIT + CD34-FCyR-), comme une fréquence de cellules vivantes de la récolte de moelle classique (n Les barres d'erreur = 3) et fémorale aspiration de la moelle osseuse (n = 3). représentent de normeviation. (D) des photographies représentatives essai de colonie méthylcellulose résultats une semaine après le placage de 150 cellules LSK dans myéloïde / érythroïde contenant de la méthylcellulose (ci-dessus) et le nombre et les types de colonies observées en utilisant des cellules LSK de chaque méthode. Les types de colonies observées et énumérés comprennent les CFU-GEMM (les granulocytes, des érythrocytes, des monocytes, l'unité de formation de colonies de mégacaryocytes), CFU-GM (les granulocytes, les monocytes unité formant colonie), et BFU-E (érythroïde unité salve de formation). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Serial aspiration BM est une procédure de routine critique à l'investigation clinique des troubles hématologiques chez les humains. La possibilité d'effectuer un échantillonnage de série analogue de BM dans les souris pour la caractérisation de la composition cellulaire et constituants de BM à travers de longues expériences est également très précieux. Cette procédure est utile pour la caractérisation de HSPC, sans sacrifier de la souris, mais également pour la détection de la présence de types de cellules supplémentaires dans le BM dans les cas où le contenu du sang périphérique peuvent ne pas être représentative des cellules résidant dans la BM. Serial aspiration BM a été utilisé de façon très efficace à cet effet ultérieurement dans la surveillance de la présence de cellules humaines dans des souris xénogreffées immunodéprimés, par exemple, 3. Étant donné que 0,4 à 0,8 x 10 6 cellules sont typiquement récupérés à chaque aspiration BM, ces cellules peuvent être utilisées pour un certain nombre de raisons, y compris une analyse cytologique (Figure 1A), diagnostic cytométrie de flux (figure 1B), le débit de séparation par cytométrie de cellules suivie d'une utilisation ultérieure en aval de cellules triées y compris la culture des cellules (Figure 1C), l'extraction d'acide nucléique, l'extraction de protéine pour les dosages orientés vers caractérisation protéomique du nombre de cellules limitées, et même plus loin transplantation des cellules extraites. Dans le même temps, il est important de noter que le nombre de cellules souches hématopoïétiques récupérées dans chaque aspiration fémorale est limitée par le nombre total de cellules récupérées dans cette procédure. Par exemple, compte tenu de la définition des cellules souches hématopoïétiques comme + CKIT + CD150 + CD244-CD48-cellules de lignée négative SCA1, la fréquence des CSH est de l'ordre de 10 HSCs/100, 7 000 cellules. Sur la base de cette fréquence, d'environ 40 à 80 CSH devrait être récupérées avec chaque procédure d'aspiration. En outre, comme il est indiqué sur la figure 1C, la fréquence de LSK et les cellules progénitrices est plus faible, mais n'atteignant pas la signification statistique, en Marro osseusew cellules obtenues par fémorale aspiration de la moelle osseuse comparées avec prélèvement de moelle osseuse conventionnelle. Nous croyons que cette diminution relative de LSK et la fréquence de l'ancêtre vu avec aspiration par rapport au prélèvement de moelle osseuse chirurgicale est liée à la contamination par le sang périphérique qui se produit avec fémorale aspiration de la moelle osseuse. Ces limitations de fémoral aspiration de moelle osseuse pour évaluer les populations de cellules rares dans la moelle devraient être notés. Une note supplémentaire est que nous avons généralement effectué cette procédure chez des souris de 6 semaines d'âge ou plus vieux. Nous croyons que cette procédure serait de plus en plus techniquement difficile avec des souris de moins de 6 semaines d'âge.
Cette technique est également bien adapté pour évaluer le chimérisme de la BM, par opposition à du sang périphérique dans le cadre d'une expérience de reconstitution compétitive en cours. Dans ces essais, le potentiel fonctionnel de HSC de partir d'un ensemble expérimental de souris est testé contre un ensemble connu nombre de HSC et# 8217; s avec la lecture étant périphérique chimérisme de sang ainsi que le chimérisme de HSC de (voir la revue de Purton et al 8.). Chimérisme du sang périphérique peut opposer à partir du chimérisme dans le BM si les perturbations qui affectent le résultat du compartiment de cellules souches hématopoïétiques dans la différenciation des facultés de HSPC en cellules matures du sang circulant. Étant donné que l'hématopoïèse définitive n'est pas établie jusqu'à au moins 16 semaines après la transplantation 9 et que le chimérisme peuvent changer après des périodes encore plus longues de temps 10, des techniques qui facilitent un accès plus rapide au compartiment CSPS tel qu'illustré ici peuvent être particulièrement utiles. Dans un exemple récent, la transplantation de cellules BM concurrentiel des souris homozygotes suppression post-natal de Dnmt3a par Challen et al. Révélé réduite chimérisme de souris Dnmt3a nulles dans le sang périphérique, mais une augmentation paradoxale de la HSC chimérisme de Dnmt3aNul HSC est dans le BM 11. Ce résultat est le signe d'un défaut de différenciation de Dnmt3a - / - HSC de malgré une augmentation de l'auto-renouvellement. De plus, ce résultat a été observé seulement au sacrifice chronométré de souris transplantées bénéficiaires dans des expériences de transplantation de série compétitifs à des intervalles de 16 semaines. Par conséquent, des dosages qui permettent d'échantillonnage de cellules de MO en parallèle avec le sang périphérique sans qu'il soit nécessaire de sacrifier les souris et permettant l'observation continue des souris sont tout à fait utiles.
Comme mentionné précédemment, la technique illustrée ici est similaire à la technique utilisée pour l'injection intrafemoral directement dans l'espace de la cavité de la moelle de souris 2,3. Injection directe intrafemoral s'est avérée très utile pour faciliter les études de xénogreffes humaines chez la souris où il a été montré pour fournir une meilleure prise de greffe en comparaison directe avec injection intraveineuse 6,12,13. Cette technique a même permettreed pour l'identification de la classe jusque-là inconnue de peupler rapidement CSH humaines.
Actuellement, on ne sait pas si un échantillonnage répété de la BM chez la souris par l'intermédiaire du même fémur influence la composition cellulaire de la BM ou le nombre de cellules de la moelle récupérées avec des aspirations répétées. En outre, le montant minimum de temps conseillé d'effectuer les procédures d'aspiration de répétition du même fémur n'est pas connue. Lors de la réalisation des aspirations de moelle osseuse du fémur répétées de la même souris, alterner le fémur utilisé pour effectuer BM aspiration et aspire en série à des intervalles de BM> 2 semaines. D'autres efforts ont porté sur la compréhension des effets potentiels, le cas échéant, des procédures d'aspiration série fémorales de BM chez la souris à des intervalles spécifiques sur les types et le nombre de cellules extraites de BM ou de l'architecture de la BM sont nécessaires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
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- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
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- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
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- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
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