Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Resumo

Este estudo apresenta um procedimento experimental detalhado para medir a dinâmica de loop de DNA de cadeia dupla usando uma única molécula de fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET). O protocolo também descreve como extrair a densidade de probabilidade looping chamado o factor de J.

Resumo

Dobrando de ADN de cadeia dupla (dsDNA) está associado com muitos processos biológicos importantes, tais como o reconhecimento de DNA-proteína e embalagem de ADN em nucleossomas. A termodinâmica da dobragem ADNcd foi estudado por um método chamado de ciclização que se baseia na ADN-ligase para se juntar covalentemente extremidades pegajosas curtas de um ADNcd. No entanto, a eficiência ligadura pode ser afetada por vários fatores que não estão relacionados com dsDNA looping, como a estrutura do DNA em torno das extremidades pegajosas unidas e ligase também pode afetar a taxa de looping aparente através de mecanismos como a ligação não específica. Aqui, vamos mostrar como medir dsDNA cinética looping sem ligase por detectar a formação transitória laço DNA por FRET (Fluorescence Resonance Energy Transferência). moléculas de dsDNA são construídos utilizando um protocolo baseado em PCR simples, com um par de FRET e um ligante de biotina. A densidade de probabilidade looping conhecido como o factor de J é extraído a partir da taxa de looping e a taxa de hibridação entre duas desconexãoted extremidades pegajosas. Ao testar dois dsDNAs com diferentes curvaturas intrínsecas, mostra-se que o factor de J é sensível à forma intrínseca do dsDNA.

Introdução

Compreender as propriedades mecânicas do dsDNA é de fundamental importância em ciências básicas e aplicações de engenharia. A estrutura do dsDNA é mais complicado do que uma escada helicoidal reto porque os ângulos de rolo, de inclinação e torção entre pares de bases sucessivas pode variar de acordo com seqüência. Flutuações térmicas podem causar dsDNA se submeter a diversos modos de flutuações conformacionais tais como flexão, torção e alongamento. Transições, como fusão e dobras também pode ocorrer em condições extremas.

Entre esses movimentos, dsDNA flexão tem o impacto biológico mais perceptível ^1. dsDNA flexão está associa....

Protocolo

1. Preparação dsDNA Amostra

1. Projete DNAs globalmente curvas repetindo uma seqüência de 10-mer. Por exemplo, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'é um ADN curvo 186 pb, em que X é uma base aleatória adicional e a sequência que flanqueia a sequência de 10-mer de repetição são sequências de adaptador.
   NOTA:. Neste exemplo, dois 10-mers com preferências opostas à formação nucleosome com base em um estudo de larga escala ocupação nucleosome por Kaplan et al ¹⁵ foram escolhidos. Uma vez que a repetição helicoidal de ADNcd é perto de 1....

Resultados

As moléculas de ADN utilizadas para o estudo de looping consistem de uma região dúplex de sequência variável, e o comprimento e saliências em cadeia simples que sejam complementares uma da outra. As saliências, que são 7 bases de comprimento, pode emparelhar com o outro para capturar o estado anelada. Cada saliência contém ou Cy3 ou Cy5 que está ligado na espinha dorsal do DNA através da química amidite. O Cy5 saliência está também relacionada com biotina-TEG (15 átomos-Tetra-Etileno Glicol espaçador) para a imobilizaçã.......

Discussão

Um ensaio de uma única molécula simples baseado em FRET foi utilizado para estudar a cinética de looping de ADN de diferentes formas intrínsecas. DNAs curvos podem ser preparados por uma sequência de repetição de 10-mer em fase com o período helicoidal de 10,5 pb, e suas curvaturas pode ser estimada utilizando PAGE. Estes dsDNAs são projetados com extremidades pegajosas para permitir a estabilização laço transitória. Foram extraídos a taxa de looping do aumento exponencial do número de moléculas em loop ao longo do temp.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de extrato de DNA FRAG pequeno-100PR	VWR	97060-558
Solução de acrilamida a 40% 500 ml	VWR	97064-522
Solução de bis-acrilamida a 2% (p/v) 500 ml	VWR	97063-948
GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1.000 bp	Fermentas	SM0241
Mini sistema de PÁGINA vertical	VWR	89032-300
Filtro de seringa 0,2 μ m CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	supressor de estado tripleto
Ácido protocatecuico (PCA)	Sigma-Aldrich	08992-50MG	sistema de eliminação de oxigênio
Protocatecuato 3,4-Dioxigenase (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	sistema de eliminação de oxigênio
mPEG-silano, MW 2.000 1 g	Laysan Bio	MPEG-SIL-2000-1g
Biotina-PEG-Silano, MW 3.400	Laysan Bio	Biotina-PEG-SIL-3400-1g
Avidina, NeutrAvidina Proteína de ligação à biotina	Invitrogen	A2666
Phusion Hot Start DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs	F-540L
Gel / PCR Kit de extração de fragmentos de DNA	IBI Scientific	IB47020
Lâminas de microscópio de vidro liso premium	Fisher Scientific	12-544-1
VWR micro vidro de cobertura, retangular, nº 1	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Chiller/Heater Recirculante	temperatura	Fisher Scientific
Objective Cooling Collar	Bioptechs	150303	controle de temperatura
KMI53 Biological Micrômetro Estágio de Medição	Semprex	KMI53
Laser DPSS de Alto Desempenho 532 nm 50 mW	Óptica Edmund	NT66-968	Cy3 excitação
CUBE Fibra Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fibra, Conector FC/APC	Coerente	1139604	Cy5 excitação
650 nm BrightLine Dicroic Beamsplitter	Semrock	FF650-Di01-25x36	divisão dicróica
LaserMUX Beam Combiner, reflete 514.5, 532 e Lasers de 543,5 nm, 25 mm	Semrock	LM01-552-25	combinando
de fluorescência dicróico Brightline 593/40	Semrock	FF01-593/40-25	Filtro de emissão Cy3
635 nm Filtro passa-longo EdgeBasic LWP, 25 mm	Semrock	BLP01-635R-25 Filtro de	emissão Cy5
EMCCD iXon+	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
IX51 estrutura de microscópio invertida	Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Óleo TIRF	Olympus
tipo-F para microscopia de fluorescência	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 mm Diâmetro 45° Lente de Haste Revestida de Alumínio	Espelho miniatura Edmund optics	54-092	1
/4" Curso Estágio de Tradução de Eixo Único	Thorlabs	MS-1	tradução de espelho miniatura
Ø Gibão Acromático de 1", ARC: 400-700 nm, f=200 mm	Lente de foco	Thorlabs	AC254-200-A
Fenda Mecânica Ajustável	Thorlabs	VA100
	Thorlabs	BB1-E02
Ø Gibão Acromático de 1", f = 100 mm	Thorlabs	AC254-100-A	lente de relé
Montagem de Lente para Ø Óptica de 1"	Thorlabs	LMR1
Montagem de Filtro Dicróico	Thorlabs	FFM1
de Cubo de Gaiola Fixa	Thorlabs	B3C
Montagem Cinemática para Ø Lente	Thorlabs	KM100
N-BK7 da Optics de 1", Ø 1", f = 40 mm	Thorlabs	LA1422-A	lente colimadora
N-BK7 Lente Plano-Convexa, Ø 6.0 mm, f = 15 mm	Lente telescópica	Thorlabs	LA1222-A
N-BK7 Lente Plano-Convexa, Ø Lente	telescópica	Thorlabs	LA1433-A

Controle de filtro Óleo de imersão Espelho Dielétrico Plataforma Plano-Convexa de 6,0 mm, f = 150 mm