Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51667
Automatic Translation
1, 1
1School of Physics, Georgia Institute of Technology

Summary

تقدم هذه الدراسة إجراء التجارب مفصلة لقياس ديناميكية حلقات من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل باستخدام جزيء واحد نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق). يصف البروتوكول أيضا كيفية استخراج كثافة الاحتمال حلقات يسمى عامل J.

Abstract

الانحناء من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsDNA و) ويرتبط مع العديد من العمليات البيولوجية الهامة مثل التعرف على الحمض النووي والبروتينات والحمض النووي في التعبئة والتغليف Nucleosomes لل. وقد تمت دراسة الديناميكا الحرارية من dsDNA والانحناء بطريقة تسمى سيكليزيشن التي تعتمد على الحمض النووي يغاز للانضمام تساهميا نهايات لزجة قصيرة من dsDNA و. ومع ذلك، يمكن أن تتأثر كفاءة ربط العديد من العوامل التي لا ترتبط dsDNA وحلقات مثل بنية الحمض النووي المحيطة نهايات لزجة انضم، ويغاز يمكن أن يؤثر أيضا على معدل حلقات اضحا من خلال آليات مثل الربط غير محددة. هنا، وتبين لنا كيفية قياس حركية dsDNA وحلقات من دون يغاز عن طريق الكشف عابرة تشكيل حلقة الحمض النووي عن طريق الحنق (الإسفار الرنين نقل الطاقة). هي التي شيدت جزيئات dsDNA وباستخدام بروتوكول بسيطة PCR القائم مع زوج الحنق ورابط البيوتين. يتم استخراج كثافة الاحتمال حلقات المعروفة باسم عامل J من معدل حلقات ومعدل الصلب بين اثنين disconnecتيد نهايات لزجة. عن طريق اختبار اثنين dsDNAs مع الانحرافات الجوهرية المختلفة، وتبين لنا أن العامل J حساسة لشكل جوهري من dsDNA و.

Introduction

فهم الخواص الميكانيكية للdsDNA وغير ذات أهمية أساسية في العلوم الأساسية والتطبيقات الهندسية. هيكل dsDNA وأكثر تعقيدا من سلم حلزوني على التوالي بسبب زوايا لفة، والميل، وتطور بين أزواج قاعدة المتعاقبة يمكن أن تختلف مع التسلسل. يمكن أن تسبب التقلبات الحرارية dsDNA والخضوع وسائط متنوعة من تقلبات بتكوين مثل الانحناء، واللف والتمدد. التحولات مثل ذوبان ومجعد يمكن أن يحدث أيضا في الظروف القاسية.

من بين هذه الاقتراحات، dsDNA والانحناء له الأثر البيولوجي أكثر ما يلفت الانتباه 1. ويرتبط dsDNA والانحناء مع القمع الجينات أو التنشيط من خلال جلب اثنين من مواقع بعيدة قريبة من بعضها البعض. كما أنها تلعب دورا هاما في التعبئة و التغليف الحمض النووي داخل نواة الخلية أو قفيصة الفيروسية. الانحناء تشوه dsDNA ويمكن تصور تجريبيا بواسطة عالية الدقة المجهر (AFM 2 و 3 TEM)، وthermodynamics وحركية يمكن دراستها بواسطة حلقات المقايسات، التي تربط كيميائيا المواقع جنبا إلى جنب من dsDNA و.

واحدة من هذه الاختبار هو تعتمد على يغاز سيكليزيشن 4. في هذا الاختبار، يتم circularized جزيئات dsDNA ومع "لزجة" (متماسكة) أو نهايات dimerized بواسطة يغاز الحمض النووي. من خلال مقارنة معدلات دائرة وتشكيل ديمر، يمكن للمرء الحصول على التركيز المولي الفعلي لنهاية واحدة من الحمض النووي في محيط الطرف الآخر، والذي يعرف باسم عامل J. هذا العامل J ما يعادل الأبعاد لكثافة احتمال العثور على واحدة نهاية من الحمض النووي على مسافة قصيرة من الطرف الآخر، وبالتالي يعكس المرونة من الحمض النووي. قياس عامل J بوصفها وظيفة من طول الحمض النووي يكشف خصائص كثيرة عن ميكانيكا الحمض النووي بما في ذلك طول استمرار 4،5.

فقد كان ينظر على نطاق واسع سلسلة مثل دودة (WLC) نموذج كنموذج البوليمر الكنسي للميكانيكيين dsDNA وبناء على نجاحها في تفسيراining منحنيات القوة والإرشاد في الحمض النووي التي تم الحصول عليها سحب تجارب 6، وتوقع بشكل صحيح العوامل J من dsDNAs أطول من 200 سنة مضت 7. ومع ذلك، باستخدام مقايسة سيكليزيشن على جزيئات dsDNA وقصيرة بقدر 100 سنة مضت، ويدوم كلوتير وقياس العوامل J أن تكون عدة أوامر من حجم أعلى من التنبؤ WLC نموذج 8. وبعد ذلك بعام، دو وآخرون. أنتج عوامل J بالاتفاق مع نموذج WLC باستخدام مقايسة سيكليزيشن مع تركيزات أقل من يغاز وعزا نتيجة الشاذة من مجموعة ويدوم لتركيزات عالية تستخدم يغاز 9. هذا الجدل تجسد تأثير لا مفر منه من يغاز الحمض النووي على حركية سيكليزيشن عند استخدام الفحص التقليدية 9. علاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر أيضا على الحمض النووي يغاز بنية الحمض النووي وصلابة عن طريق غير محددة 10،11 ملزمة.

للقضاء على المخاوف من المقايسات الفنية التي تعتمد على البروتين حلقات، أثبتنا مؤخرا البروتوكول الاضافيعين خالية مقايسة حلقات على أساس نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) 12. في هذه الطريقة، يتم الكشف عن التشكل يحلق بواسطة الحنق بين المانحين ومتقبل تعلق بالقرب من نهايات لزجة من جزيء الحمض النووي. يستخدم هدفا من نوع مجموع المجهر مضان التأمل الداخلي (TIRFM) لتسجيل مسارات حلقات عكسها والأحداث unlooping من جزيئات الحمض النووي واحد يجمد السطح لفترة طويلة من الزمن. يتميز هذا الأسلوب التجمع PCR القائم من جزيئات الحمض النووي لتوليد جزيئات الحمض النووي خالية من عدم التوافق، وهو تحسن حاسم على أسلوب مماثل من قبل Vafabakhsh وها 13. على جانب واحد جزيء من هذا البروتوكول يسمح قياس توزيعات بالإضافة إلى فرقة المتوسطات في حين أن الجانب الحنق يسمح احد لقياس ديناميكية حلقات الحمض النووي مرارا وتكرارا من نفس الجزيء، حتى في الظروف التي يمكن أن يضعف النشاط يغاز.

يظهر الإعداد TIRFM في الشكل رقم 1. A مخصصةيتم وضع تصميم المرحلة العينة على هيئة المجهر أوليمبوس IX61. يتم إدخال 532 نانومتر و 640 نانومتر ليزر من الجانب والتي تعكسها المرايا بيضاوي الشكل صغيرة 14 من زمن الهدف NA عالية لتحقيق زاوية حرجة من الإصابة في واجهة المياه ساترة. نلاحظ أن أكثر انتشارا النقل البري الدولي من خلال الهدف باستخدام المرايا مزدوج اللون أو الاجهزة النقل البري الدولي القائم على منظور يمكن أن تستخدم أيضا لهذا التطبيق الحنق. يتم تقسيم الصورة التي شكلتها مضان المجهر في الصور المانحة ومتقبل بواسطة مرآة مزدوج اللون. ثم يتم إعادة تصويرها، فهم على نصفين من EMCCD. وتستخدم مرشحات إضافية الانبعاثات تمريرة طويلة للحد من إشارة الخلفية.

التحكم في درجة الحرارة أمر ضروري للحصول على البيانات الحركية استنساخه. لمراقبة درجة الحرارة، ويتم فصل الهدف من الأنفية من الجسم المجهر لتقليل انتقال الحرارة، والماء من درجة الحرارة التي تسيطر عليها المبرد / سخان يعمم من خلال طوق النحاس أن يناسب بإحكامحول المعدنية الداخلية تحت سترة الهدف. هذا الإعداد هو قادرة على تحقيق التحكم في درجة الحرارة قوية على السطح ساترة بين 15 و 50 درجة مئوية (الشكل 2). في هذا العمل، والحفاظ على درجة حرارة العينة في 24 درجة مئوية.

ويقدم البروتوكول باتباع الإجراء خطوة بخطوة لبناء الحمض النووي، وتقدير شكل الحمض النووي، وتجربة واحدة جزيء، وJ تحديد عامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد dsDNA وعينة

  1. تصميم منحني السلطات الوطنية المعينة على الصعيد العالمي من خلال تكرار تسلسل 10 مير. على سبيل المثال، 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'هو الحمض النووي منحني 186-BP حيث X هو قاعدة اضافية عشوائية وتسلسل المرافقة تكرار تسلسل 10 مير هي متواليات محول.
    ملاحظة: في هذا المثال اثنين من 10 السائدة مع تفضيلات المعاكس لتشكيل جسيم نووي استنادا إلى دراسة الإشغال جسيم نووي على نطاق واسع من قبل كابلان وآخرون تم اختيار 15. منذ تكرار حلزونية من dsDNA وبالقرب من 10 سنة مضت، فإن أي انحراف صافي محور حلزونية من مير 10 تتراكم لإنتاج شكل مثل قوس دائري (الشكل 3A). منذ فترة حلزونية هو أقرب إلى 10.5 نقطة أساس، يتم إدراج قاعدة اضافية بعد كل اثنين يكرر للحفاظ على هيكل منحني كما مستو ممكن. هذه المتتاليات أقصر من 200 سنة مضت يمكن طلبها من الشركة أو المؤسسةو هذا العرض الجين خدمة التوليف. أنها مريحة لتطويق هذه المتتاليات مع تسلسل محول مشتركة للخطوات اللاحقة. وschematized الإجراء في الشكل 3B.
  2. أداء PCR مع التمهيدي 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) والتمهيدي 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). ملاحظة: يسمى التمهيدي 2 مع CY3 المانحة الحنق في نهاية 5 '. يتم عرض وصفة نموذجية PCR وبروتوكول ركوب الدراجات في الجدولين 1 و 2.
  3. أداء PCR مع التمهيدي 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) والتمهيدي 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). ملاحظة: يسمى التمهيدي 3 مع متقبل Cy5 الحنق من خلال العمود الفقري والبيوتين-رابط في نهاية 5 '. PCR صفة وبروتوكول ركوب الدراجات هي على النحو الوارد أعلاه.
  4. تنقية المنتجات PCR باستخدام طقم تنظيف PCR.
  5. مزيج المنتج CY3 المسمى والمنتج Cy5 المسمى في منطقة عازلة لتبادل حبلا (100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.0، 1 ملم EDTA) بتركيزات النهائي من 0.4 و# 181؛ M و 0.1 ميكرومتر، على التوالي. ملاحظة: الزائدة CY3 الحمض النووي يزيد من تركيز كلا الوجهين يحمل CY3 وCy5 نتيجة الصرف حبلا.
  6. فروع الصرف التي يحتضنها في 98.5 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والتبريد تدريجيا إلى 5 درجة مئوية مع معدل زيادة قدرها 0.1 درجة مئوية / ثانية، وتفرخ في 5   ° مئوية لمدة 2 ساعة.

2. جل الكهربائي لكشف dsDNA وتقوس

  1. صب جل بولي أكريلاميد 16،17 عن طريق خلط مادة الأكريلاميد وحلول مكرر الأكريلاميد في نسبة 29.2:0.8، 5٪ (ث / ت) في 1X تريس / البورات / EDTA (TBE) العازلة في درجة الحموضة 8.0. ملاحظة: 10 مل من محلول هلام يحتوي على: 1.217 مل 40٪ الأكريلاميد، 0.667 مل 2٪ مكرر الأكريلاميد، 1 مل TBE 10X، و 100 فوق كبريتات الأمونيوم L (APS) 10٪، 10 L TEMED، والباقي هو درهم 2 O. التصلب الكامل من هلام يستغرق حوالي 30 دقيقة.
  2. تحميل هلام بولي أكريلاميد مع عينات الحمض النووي والحمض النووي في سلم 1X العازلة تحميل (5٪ الجلسرين، 0.03٪ (ث / ت) برموفينول BLرق) وتشغيل هلام في 5-8 V / سم عند 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة أو حتى الجبهة صبغ تقترب من نهاية هلام.
  3. وصمة عار الجل باستخدام 1X TBE العازلة التي تحتوي على بروميد 0.5 جم / مل إيثيديوم لمدة 30 دقيقة. تحديد نطاقات الحمض النووي تحت إضاءة فوق البنفسجية. قارن بين مواقف الفرقة مع علامة الحجم (100 غليان الحمض النووي سلم) لحساب الأحجام واضح من جزيئات الحمض النووي. ملاحظة: منحني السلطات الوطنية المعينة التحرك عموما أبطأ من السلطات الوطنية المعينة على التوالي.

3. تدفق خلية التحضير

  1. حفر 6-7 أزواج من الثقوب على طول حافتي نقيض شريحة زجاجية (3'''' × 1) باستخدام الحفر الصحافة ولقم الثقب الماس. بعد الحفر، وفرك الشريحة في المياه المتدفقة لإزالة مسحوق الزجاج مرئية. ملاحظة: الثقوب بمثابة مداخل ومنافذ التروية. أثناء الحفر، والتبريد الشريحة مع الماء مهم لمنع التشقق.
  2. وضع الشرائح تستقيم في وعاء زجاجي وملئه بالماء. يصوتن لمدة 15 دقيقة ونقلها إلى أخرى عاء زجاجي ديdicated لتنظيف الأسيتون. ملء مع الأسيتون ويصوتن لمدة 15 دقيقة. شطف الشرائح مع الإيثانول باستخدام زجاجة رذاذ ثم بالماء. وضعها في جرة البولي بروبلين، وملء مع 5 هيدروكسيد البوتاسيوم M، ويصوتن لمدة 15 دقيقة. أخيرا، يصوتن الشرائح في الماء لمدة 15 دقيقة. تنظيف لل coverslips (رقم 1، 24 × 40 مم) باستخدام نفس البروتوكول. ملاحظة: الشرائح تنظيفها وcoverslips يمكن تخزينها في DH 2 O للاستخدام على المدى الطويل.
  3. مزيج 1 ملغ من البيوتين-PEG-سيلاني (MW 3400) مع 80 ملغ من MPEG-سيلاني (MW 2000) في 340 L 0.1 M الصوديوم بيكربونات الحل. تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الخليط للتخلص من الفقاعات. ملاحظة: إن functionalization السطح مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG) يساعد في تقليل ملزم غير محددة من الحمض النووي إلى السطح.
  4. وضع 80 L من الحل PEG على كل شريحة وخفض بلطف ساترة أكثر من ذلك. الانتظار لمدة 45 دقيقة. فصل ساترة من الشريحة مع ملاقط، شطف لهم مع كمية وفيرة من DH 2 O والسماح رتنحنح الجافة في الهواء الطلق.
  5. وضع شرائح رقيقة من الشريط المزدوج عصا عبر الشريحة لتشكيل قنوات. محاذاة ساترة أكثر من ذلك وتضغط بقوة ضد ساترة الشريحة لتشكيل قنوات السائل ضيقة. استخدام الايبوكسي 5 دقائق لختم حواف القنوات.

4. إعداد Trolox الحل

  1. وضع ~ 30 ملغ Trolox و 10 مل درهم 2 O في قارورة واستخدام شريط المغناطيس لاثارة ضجة الحل في الهواء الطلق لمدة 18 ساعة.
  2. تحديد الحل باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر وضبط درجة الحموضة إلى 7 بإضافة ~ 6 ميكرولتر من 1 M تريس قاعدة (الرقم الهيدروجيني 11). ملاحظة: Trolox هو كاشف المضادة للتطرف الذي يستخدم عادة في جزيء واحد يدرس 18. العمل antifading من Trolox يأتي من مشتقات أكسدة والتي هي موجودة في المتدهورة جزئيا حل Trolox 19. حل بسرعة Trolox في الميثانول أو ارتفاع درجة الحموضة تريس الحل يجب تجنبها بسبب الأكسدة غير فعالة.

5. واحدة مولالتصوير ecule

  1. ضخ 15 ميكرولتر من الحل NeutrAvidin (0.5 ملغ / مل) في القناة والانتظار لمدة 2 دقيقة قبل الشطف مع 100 ميكرولتر من العازلة T50 (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0).
  2. ضخ 50 ميكرولتر من عينة الحمض النووي (50-100 م) في القناة. الانتظار لمدة 5 دقائق ويشطف الحمض النووي غير منضم بعيدا مع 100 L العازلة T50. ملاحظة: سوف تربط جزيئات الحمض النووي على وجه التحديد إلى السطح من خلال التفاعل NeutrAvidin البيوتين.
  3. ملء القناة مع المخزن المؤقت التصوير الذي يحتوي على نظام الكسح الأكسجين 20 (100 ملي PCD، 5 ملي PCA، 1 ملم Trolox، و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم).
  4. تعيين EMCCD في وضع الإطار نقل لتيار 2 × 2 صورة اهمال (256 × 256) إلى الكمبيوتر عند 25 لقطة في الثانية.
  5. نضع الزيت الغمر على الهدف المجهر، وإصلاح الخلية تدفق على المسرح المجهر باستخدام مقاطع العينة. الخشنة ضبط التركيز من خلال النظر في نمط انعكاس الليزر على الحائط. غرامة ضبط التركيز باستخدام طريقة العرض المباشر لمضان ايمالأعمار على الشاشة.
  6. تبدأ الحصول على البيانات مع الليزر 532 نانومتر جرا. تحقق من عرض لايف وضبط التركيز إذا لزم الأمر. وقف الحصول على البيانات عندما photobleached معظم الجزيئات.
    ملاحظة: في هذا المرفق، يتم استخدام برنامج C مكتوبة بخط مختبر للسيطرة على المجهر وعرض صورا حية على الشاشة كما يتم حفظ إلى القرص الثابت.

6. معالجة الصور وتحليل البيانات

ملاحظة: تتم معالجة سلسلة من الساعة 256 × 256 الصور عن طريق رمز MATLAB لتوليد آثار مرة واحدة جزيء من CY3 وCy5 شدة. لإقران بكسل بين قناة وقناة المانحة متقبل للصورة انقسام الرأي، 6-7 أزواج من CY3 وCy5 البقع، كل زوج من نفس الجزيء فرقت بالتساوي على مجال الرؤية، يتم انتقاؤها يدويا، والتحول أفيني يتم حسابها باستخدام إحداثيات هذه البقع كما نقاط الربط.

  1. باستخدام برنامج نصي MATLAB، ننظر من خلال كل العصور واحدة جزيء يتتبع رالمعرض قبعة التحولات متعددة بين الإشارات المنخفضة والعالية الحنق. تحديد الدول يحلق وunlooped.
    ملاحظة: يتم تعريف إشارة الحنق كما كثافة Cy5 (لي) مقسوما على مجموع CY3 وCy5 شدة (لي + I D). الدولة يحلق له قيمة عالية في حين الحنق الدولة unlooped له قيمة الحنق منخفضة. الرسم البياني من الإشارات الحنق من جزيء واحد يتم توزيع bimodally بسبب حلقات عكسها وunlooping.
  2. العثور على العتبة التي تفصل بين توزيعات اثنين من خلال تحديد تقاطع بين اثنين من منحنيات جاوس المجهزة.
  3. حساب الكفاءة الحنق كما وتعيين الدول يحلق مع القيم العالية والحنق الدول unlooped مع القيم الحنق منخفضة.
  4. باستخدام برنامج نصي MATLAB، وتحليل العدد التراكمي للجزيئات (N (ر)) أن يحلق (أووصلت إلى حالة عالية الحنق) في هفوات زمنية مختلفة منذ بداية الحصول على البيانات. ملاحظة: منذ جزيء dsDNA ويمكن أن تبدأ في أي التشكل الدولة unlooped في بداية الحصول على البيانات، ومعدل الزيادة في عدد السكان يحلق يعكس متوسط ​​معدل المتوسط ​​حلقات على التشكل الأولي. استخراج حلقات معدل ك حلقة من المناسب N (ر) مع الدالة الأسية: إذا زيادات biphasically، فإنه يمكن تركيبها مع الدالة الأسية مزدوجة: في هذه الحالة، يتم الحصول ك حلقة من: ملاحظة: من الناحية النظرية، واحتمال البقاء على قيد الحياة أن البوليمر لم يحلق في الوقت t ليس وظيفة واحدة أو مزدوج الأسي 12. FITT الأسييستخدم جي كوسيلة عملية لاستخراج متوسط ​​الوقت حلقات.

7. تحديد عامل J

ملاحظة: عامل J يمثل كيف المركزة واحدة من نهاية dsDNA وحوالي الطرف الآخر. فإنه يمكن تحديده من خلال التحريف تركيز الجزء نهاية واحدة من الحمض النووي التي من شأنها أن تنتج نفس معدل التفاعل مع شريحة الطرف الآخر، حيث وصل سعر حلقات قياسها. تجريبيا، ويجمد جزء نهاية واحدة على السطح، ويتم عرض الجزء الطرف الآخر في تركيز معين ج. إذا كان معدل قياس الصلب بين طرفي هو ك يصلب، ثم يتم إعطاء العامل J 21 بواسطة . ثابت معدل الصلب (ك = ك يصلب يصلب / C) مستقلة عن تركيز التحقيق.

  1. تدفق 20 ميكرولتر من 30-50 من مساء البيوتين-Cy5 بنسبة ضئيلة (التمهيدي 3) طn لقناة NeutrAvidin المغلفة. شطف القناة مع 100 ميكرولتر T50 ليغسل oligos غير منضم.
  2. إعداد المخزن المؤقت التصوير كما هو موضح في الجزء 5 مع إضافة CY3 بنسبة ضئيلة (التمهيدي 2) في تركيز النهائي من 50 نانومتر. تدفق هذا المخزن المؤقت التصوير في القناة.
  3. مع الحفاظ على الليزر 532 نانومتر على، تتحول لفترة وجيزة ليزر 640 نانومتر إلى تحديد مواقع محددة سطح oligos Cy5. إيقاف تشغيل الليزر 640 نانومتر، وبدء مراقبة إشارة الحنق.
    ملاحظة: عند التهجين بنسبة ضئيلة من CY3 إلى Cy5 جزئية محددة السطح، وسوف Cy5 مضان تنشأ من الحنق.
  4. باستخدام برنامج نصي MATLAB، وتحليل عدد من الجزيئات التي تبدأ في دولة غير منضمة (منخفض الكثافة Cy5) ولكن تتحول لاحقا إلى صلب الدولة (كثافة عالية Cy5) بوصفها وظيفة من الوقت من آثار شدة Cy5.
  5. رسم هذا العدد من الجزيئات مقابل الوقت صلب. تناسب هذا المنحنى مع الدالة الأسية واحد ( (ك يصلب).
  6. تكرار هذه التجربة في تركيزات مختلفة CY3 بنسبة ضئيلة (60، 100، 180 نانومتر) لتأكيد الخطي بين معدل الصلب وتركيز المتفاعلة. استخراج معدل الدرجة الثانية الصلب ثابتة (ك يصلب ) من المنحدر.
  7. حساب معامل J من ، حيث k هو معدل حلقة حلقات يقاس في نفس حالة العازلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تتكون جزيئات الحمض النووي المستخدمة في الدراسة حلقات من المنطقة المزدوجة من تسلسل متغير وطول واحد يتدلى الذين تقطعت بهم السبل التي هي مكملة لبعضها البعض. ويتدلى، والتي هي 7 قاعدة طويلة، يمكن أن يصلب مع بعضها البعض لالتقاط حالة يحلق. كل عبء يحتوي إما CY3 أو Cy5 مرتبط في العمود الفقري الحمض النووي من خلال الكيمياء amidite. يرتبط Cy5-عبء أيضا مع البيوتين-TEG (15 ذرة رباعي جلايكول الإثيلين هل) لتجميد السطحية (انظر الشكل 4A). ويمكن إدراج كل هذه التعديلات في dsDNA وبعد بروتوكول PCR القائم (بروتوكول 1 والشكل 3B). طول اختيار وتسلسل يتدلى تعمل بشكل جيد لإنتاج الأحداث الحنق كشف وعكسها في الظروف التجريبية العادية. على حلقات وحركية unlooping من الحلقة DNA حساسة لدرجة الحرارة المحيطة، وبالتالي، تحكم في درجة الحرارة أمر ضروري لاستنساخ. مثل هذا كنتروليمكن إدراجها بسهولة في روزينمولر المجهر (الشكل 2).

باستخدام TIRFM، تقلبات CY3 (المانحة) وCy5 (متقبل) إشارات من يجمد سطح الجزيئات dsDNA وشوهدت (الشكل 4B) المضادة للالمترابطة. في ولاية يحلق، والمسافة بين اثنين من الأصباغ أصغر من 5NM، الذي من شأنه أن يؤدي إلى ارتفاع إشارة Cy5 وانخفاض إشارة CY3 بسبب كفاءة عالية الحنق (أرقام 4A و 4C). أجريت عدة تجارب لإثبات أن تحكم الدولة الحنق عالية يمثل الدولة يحلق. زيادة عمر الدولة الحنق عالية مع زيادة طول المتراكمة، الأمر الذي يوحي بأن الدولة الحنق عالية واستقرت من قبل الاقتران بين قاعدة يتدلى اثنين. انخفض عمر الدولة الحنق عالية أيضا مع تناقص طول الحمض النووي، والذي من المتوقع بسبب زيادة الطاقة حلقة الحرة باعتباره حلقة يصبح أصغر 12. استنادا إلى هذه الأدلة، والحنق ستا العالية والمنخفضةيمكن تعيين الاحصائيين إلى الدول يحلق وunlooped، على التوالي.

لاختبار تأثير انحناء لا يتجزأ من dsDNA وعلى حلقات، تم تشييد اثنين dsDNAs 186 نقطة أساس مع الانحرافات المختلفة، والتي تتم تسمية 'مباشرة' (S-DNA) و "المنحني" (C-DNA) على أساس انحناء بهم. وتكرار تسلسل 10 مير هو TTTATCATCC لC-DNA وTGACAGCAAC لS-DNA. تم فحص انحناء الشاملة لكل من هذه dsDNAs بواسطة PAGE (بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام)، وهو الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقدير dsDNA وانحناء 16،22 الشكل 5 يدل على أن S-DNA يعمل بالمثل على الحمض النووي من نفس الحجم في سلم الحمض النووي (قارن حارة 1 و 2 لين في الشكل 5). من ناحية أخرى، يظهر الحمض النووي C حجم أكبر واضح مقارنة مع نظيرتها في سلم الحمض النووي (~ 1.2 أكبر من حجمه الحقيقي، انظر حارة 1 وحارة 3). هذه الملاحظة تشير إلى أن C-DNA تمتلك مكعب الجوهرية أكبرrvature من الحمض النووي S.

ويبين الشكل 6 مضان ممثل وقت التتبع من C-الحمض النووي (الشكل 6A) والمقابلة الحنق التتبع (الشكل 6B). مقارنة مع S-DNA (أرقام 4B و 4C)، والحمض النووي C تنتج أكثر الأحداث الحنق عالية خلال الفترة الزمنية نفسها؛ والحمض النووي C حلقات 4 مرات أكثر تواترا من الحمض النووي S خلال نفس الوقت اكتساب (الشكل 7). هذه النتيجة توضح أن انحناء لا يتجزأ من الحمض النووي يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على حلقات ديناميكية.

لاستخراج عامل J من معدل حلقات، واحد يحتاج إلى قياس معدل الدرجة الثانية ثابت تركيز مستقلة عن التهجين بين اثنين يتدلى قطع. ويرد تحقيق مثل هذا القياس في الشكل 8A. تهجين بنسبة ضئيلة CY3 إلى Cy5 بنسبة ضئيلة يجمد تنتج رشقات نارية كثافة Cy5 بسبب الحنق. من شركة طيران الشرق الأوسط متعددةsurements مع تركيزات مختلفة CY3-بنسبة ضئيلة (انظر الشكل 8B)، يمكن للمرء أن استخراج بطريقة قوية إحصائيا. في تجربتنا، تم تحديد معدل ثابت الصلب بين oligos اثنين في 500 ملي مول كلوريد الصوديوم لتكون 0.45 ± 0.04 × 10 6 م -1 -1 ثانية. تم حساب عامل J بقسمة معدل حلقات (ك حلقة) من ثابت الدرجة الثانية معدل الصلب (ك 'يصلب). كان 61 ± 3 نانومتر لS-DNA و 265 ± 48 نانومتر ل-C الحمض النووي. العامل J من S-DNA (الشكل 9) هو في اتفاق عادل مع القياسات السابقة مطولا مماثلة 7.

الشكل 1

الشكل 1. من نوع الهدف TIRFM. A) الإثارة البصرية. وموازى ل532 نانومتر و 640 نانومتر الليزر بشكل منفصل إلى similقطر ع، اندمجت في نفس المسار عن طريق مرآة مزدوج اللون، وركز على مرآة بيضاوية صغيرة وضعت تحت فتحة الظهر الهدف. من المهم استخدام عدسة الوني للتركيز على تقليل انحراف لوني. B) البصريات المجهر. الموقف الجانبي للمرآة مصغرة لابد من تعديلها بدقة بحيث يمكن أن تعكس شعاع الليزر من خلال هدف في حين وقف الحد الأدنى من الانبعاثات مضان. لذلك، فإنه يجب أن يتم تنظيمها على مرحلة الترجمة الصغيرة. مرآة أخرى على الجانب الآخر يعكس الليزر المنتهية ولايته لمنعها من دخول البصريات الكشف. في الطائرة الصورة خارج الجسم المجهر، يتم وضع شق قابل للتعديل لاقتصاص الصورة إلى نصف حجم منطقة الكشف عن اتفاقية مكافحة التصحر. يتم تقسيم الانبعاثات مضان بواسطة مرآة مزدوج اللون في قناتين، والعدسات التتابع تشكيل الصورة الثانية على اتفاقية مكافحة التصحر مع التكبير 01:01. واحدة من المرايا التي تعكس يتم استدارة قليلا لتعويض المانحةوالصور متقبل. وتستخدم ممر الموجة وlongpass مرشحات للحد من الخلفية في القنوات المانحة ومتقبل، على التوالي. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. السيطرة على درجة الحرارة لإجراء التجارب جزيء واحد. درجة الحرارة مجموعة (T ق) هو القراءة على الماء المبرد / سخان. يتم قياس درجة الحرارة الفعلية (T أ) من قبل الحرارية الاتصال السطح العلوي للساترة على المجهر. مؤامرة من درجات الحرارة الفعلية مقابل ست درجات الحرارة مجموعة مختلفة (المربعات السوداء) يظهر الخطي ممتازة (أخضر متقطع سطر). يظهر متانة وحدة تحكم عن طريق القياسات بصورة عشوائية في أوقات لاحقة (الماس الحمراء). أقحم هو صورة من درجة حرارة المشتركntrolling الوحدة والهدف في التجمع النهائي. الخط الأحمر يمثل المنحدر من الوحدة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الشكل 3. الحمض النووي التصميم. أ) منحني dsDNA و. يتم تمثيل dsDNA و10 مير باعتبارها جزء أنبوب منحني، واثنين من فروع احد كخطوط متقطع. محور حلزونية من أي DNA 10 مير ليست مباشرة تماما، وبالتالي كل سلسلة من هذه 10 مير سوف يؤدي إلى الميل المتزايد من محور حلزونية في نفس الاتجاه. يمكن استغلال هذا التأثير لتوليد مستو، جزيء superhelical. ب) إعداد PCR القائم من dsDNA و. وترد السلطات الوطنية المعينة واحد الذين تقطعت بهم السبل كخط أفقي. لا يصور بها انحناء الفعلية هنا. الجزء المركزي في الأسود يمثل جزء فريد من جزء الحمض النووي. هو مبين في الرمادي الفاتح هي متواليات محول مشتركة بين جميع السلطات الوطنية المعينة المستخدمة في هذه الدراسة. التمهيدي 1 و 4 يصلب لمحولات الأمامي والخلفي على التوالي. هو المسمى التمهيدي 2 مع CY3 في نهاية 5'. 3 التمهيدي لديه علامة البيوتين في نهاية 5'وCy5 مرتبطة داخليا. المناطق الزرقاء ضوء التمهيدي 2 و 3 تحتوي على تسلسل التكميلية التي تعمل نهايات لزجة كما. يستخدم إما البلازميد أو الحمض النووي الجيني الذي يحتوي على سلسلة من الفائدة كقالب في اثنين من تفاعلات PCR منفصلة. ويتم إنتاج dsDNA والمسمى CY3 باستخدام التمهيدي 1 و 2، ويتم إنتاج الحمض النووي البيروكسيديز Cy5 المسمى باستخدام التمهيدي 3 و 4. هذان المنتجات PCR يتم تسخينها وتبريدها معا لتبادل حبلا. وشكلت أربعة dsDNAs مختلفة، منها واحد فقط يحتوي على CY3، Cy5، والبيوتين. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

دائما "> الرقم 4
الشكل 4. مخطط التجريبية. A) واحدة جزيء الحنق التجربة. ويجمد جزيئات dsDNA والمسمى مع CY3 (الأخضر) على جانب واحد وCy5 (الأحمر) من جهة أخرى على PEG (البولي ايثيلين جلايكول) المغلفة السطح. حلقات عكسها وunlooping من dsDNAs يؤدي إلى الحنق عالية (يحلق) وانخفاض الحنق (unlooped) الدول، على التوالي. ب) نموذجي واحدة جزيء الوقت ضئيلة من الجهات المانحة (الخضراء) ومتقبل (الحمراء) كثافة مضان. ويتم تحديد الدول الحنق العالية والمنخفضة كما يذكر يحلق وunlooped، على التوالي. وأشار أيضا هي المرة الأولى التي تستخدم حلقات لحساب معدل حلقات. (أقحم) ويبين التكبير في الشكل المضادة للارتباط من CY3 وCy5 شدة. C) تتبع الوقت من الكفاءة المحسوبة من شدة الحنق المانحة ومتقبل يتتبع في B. الشكل 4B و ترونج> 4C أخذت من الحمض النووي على التوالي (S-DNA) كما هو موضح في النص الرئيسي. هو الحنق منخفضة عند 0.2 بسبب الإثارة المباشرة لCy5 بواسطة الليزر 532 نانومتر، ويؤكد وجود Cy5 نشطة fluorescently. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
الرقم 5. بولكرلميد الكهربائي للهلام (29.2:0.8 الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد، 5٪ في TBE العازلة، ودرجة الحموضة 8.0) من السلطات الوطنية المعينة الاصطناعية. من اليسار إلى اليمين، الممرات تحتوي على 1 كيلو بايت علامة، و186 سنة مضت DNA مستقيم وغليان 186 الحمض النووي المنحني. ويتم تكييف هذا الرقم جزئيا من منشور السابقة 12 مع إذن. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 6
الرقم 6. آثار الممثل من الحمض النووي المنحني (C-DNA) (A) وتتبع الحنق المقابلة لها (B). مقارنة بين كثافة والحنق بين آثار S-DNA (أرقام 4B و 4C) وC-DNA (أرقام 6A و6B) يبين بوضوح أن الحمض النووي المنحني الحلقات بشكل متكرر أكثر من الحمض النووي على التوالي في نفس حالة العازلة. (أقحم) ويوضح الشكل التكبير في مكافحة الارتباط من CY3 وCy5 شدة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 7
الرقم 7. ويعني مرات الأولى من حلقات على التوالي والسلطات الوطنية المعينة المنحني. كل رتم استخراج IME من ~ 500 الجزيئات في 5 مجالات مختلفة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) المحسوبة من 3 تجارب مستقلة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 8
الرقم 8. تحديد معدل ثابت من الصلب بنسبة ضئيلة التهجين. أ) عرض تخطيطي لقياس معدل الصلب. ويجمد Cy5 التمهيدي على السطح، وCY3 التمهيدي موجود في 50-180 نانومتر. ملزمة وغير ملزم من التمهيدي CY3 في 50 نانومتر تحدث عكسية وتؤدي إلى رشقات نارية متقبل للكشف، التي تظهر في أقحم. B) معدل الصلب يعتمد خطيا على تركيز بنسبة ضئيلة الحرة. المنحدر من خط ثابت يمثل الدرجة الثانية معدل الصلب (ك 'annea ل). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 9
الرقم 9 العوامل J من السلطات الوطنية المعينة المستقيمة والمنحنية المحسوبة في نانومتر تم تحديد عامل J استنادا الى اثنين من قياسه:. معدل حلقات من الحلقة dsDNA ووثابت معدل الصلب ليتدلى التكميلية الحرة اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

ثمانية: 25px؛ العرض: 351px؛ "> الماء
عنصر Volume/50 رد فعل ميكرولتر تركيز النهائي
36 ميكرولتر
5X العازلة phusion 10 ميكرولتر 1X
10 ملي dNTPs 1 ميكرولتر 200 ميكرومتر كل
التمهيدي إلى الأمام (25 ميكرومتر) 1 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر
التمهيدي العكسي (25 ميكرومتر) 1 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر
Phusion بداية ساخنة الحمض النووي بوليميريز (2 U / ميكرولتر) 0.5 ميكرولتر 0.02 U / ميكرولتر
الحمض النووي القالب 0.5 ميكرولتر ~ 1 نانوغرام

الجدول 1. PCR مزيج التفاعل. تم تحسين بروتوكول لالبلمرة Phusion الحمض النووي. وينبغي أن يضاف العناصر في هذا النظام.

"> 95 ° C
الخطوة دورة درجة الحرارة وقت عدد دورات
تمسخ الأولي 30 ثانية 1
تمسخ 95 ° C 5 ثانية 30
الصلب 60 ° C 10 ثانية
تمديد 72 ° C 15 ثانية / كيلو بايت
التمديد النهائي 72 ° C 5 دقائق 1
4 & #176؛ C عقد

الجدول 2. تعليمات الدراجات PCR. يتم تحديد درجة حرارة الصلب على أساس درجات الحرارة ذوبان الاشعال. هو الأمثل لتمديد الوقت بوليميريز Phusion الحمض النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

واستخدمت مقايسة بسيطة جزيء واحد يعتمد على الحنق لدراسة حركية حلقات من السلطات الوطنية المعينة من الأشكال الجوهرية المختلفة. يمكن السلطات الوطنية المعينة منحني بتكرار تسلسل 10 مير في مرحلة مع الفترة حلزونية من 10.5 نقطة أساس على استعداد، ويمكن تقدير الانحرافات الخاصة بهم باستخدام PAGE. وقد صممت هذه dsDNAs مع نهايات لزجة للسماح الاستقرار حلقة عابرة. استخرجنا معدل حلقات من الارتفاع الهائل في عدد الجزيئات يحلق مع مرور الوقت. يتم استخدام معدل ثابت الصلب بين قطع شرائح نهاية لزجة لتحديد ما يعادل تركيز كثافة الاحتمال حلقات، والذي يعرف باسم عامل J.

في الحمض النووي سيكليزيشن مقايسة على أساس يغاز، وقياس الحمض النووي احتمال إغلاق حساسة للتركيز يغاز، وعامل J يمكن المبالغة المفرطة إذا يغاز هو 9. غير محدد ملزم من الحمض النووي ليغاز الحمض النووي يمكن أن تؤثر أيضا على 10 حلقات. علاوة على ذلك، ligasنشاط البريد يعتمد على الملح ويضمحل مع مرور الوقت. وبالتالي فإنه من الصعب دراسة حلقات الحمض النووي في ظروف دون المستوى الأمثل للنشاط يغاز. في المقابل، حلقات الفحص القائم على الحنق هو خال من كل هذه المخاوف.

لدينا بروتوكول تجريبي مشابه لتلك التي Vafabakhsh وها 13 ما عدا اثنين من الجوانب الهامة التي تستحق المناقشة. Vafabakhsh وها 13 شيدت من قبل جزيئات dsDNA وligating عدة oligos الاصطناعية. على الرغم من أن الخطأ (الإدراج أو الحذف أو الاستبدال) سعر لكل النوكليوتيدات في التركيب بنسبة ضئيلة لا تكاد تذكر (و 0.181٪) 23، وجزء من تسلسل الحمض النووي غير المرغوب فيه يزيد خطيا مع طول بنسبة ضئيلة. وبالتالي، عينة دوبلكس 100-BP بواسطة هذا البروتوكول أعدت يمكن أن تحتوي على ما يصل إلى 33٪ ~ الدوبلكس ناقصة مما قد يؤدي إلى ارتفاع معدل 24 حلقات. في المقابل، يستخدم بروتوكول لدينا البلمرة سلسلة من ردود الفعل (PCR) لتجميع جزيئات dsDNA و، التي لديها أعلى بكثير من الدقة تشي الحمض النوويmosynthesis 25. وفقا لبيانات الشركة المصنعة، فإن البلمرة عالية الدقة كنا توليد جزيء DNA الصحيح 100 نقطة أساس في 99.8٪ احتمال بعد 30 دورات PCR التضخيم.

الفارق الأساسي أخرى بين الدراستين هو مخطط تجميد السطح. في دراستنا، هي التي تعلق جزيئات الحمض النووي إلى السطح من خلال غاياتهم، في حين أنه في البروتوكول من قبل Vafabakhsh وها 13، وترد أنها من خلال قاعدة الداخلية. وكان من المتوقع أن يعتمد على تأثير الحبس وحده، وهو dsDNA ودبس داخليا يمكن حلقة بشكل متكرر أكثر من dsDNA ومجانا، وتصل إلى خمسة أضعاف تبعا لموقع تعلق الداخلية 26. لذلك، عند قياس عامل J بوصفها وظيفة من الحمض النووي طول كفاف، يمكن أن تعلق الداخلية إدخال تقلب غير متوقع. فمن الممكن أيضا أن قاعدة تعديلها مع رابط لديها أضعف قدرة قاعدة الاقتران، والتي يمكن أن تؤدي إلى معدل حلقات العالي. ومع ذلك، despITE هذه الاختلافات واضحة، والبروتوكولين إنتاج عوامل J مماثلة عند 100 نقطة أساس (~ 3 ~ 2 نانومتر مقابل نانومتر).

هذه حلقات الفحص القائم على الحنق يبشر بالخير لدراسة مجموعة واسعة من الظواهر المتعلقة حلقات dsDNA وبما في ذلك أثر عدم التطابق، النكات أو فجوات على dsDNA وحلقات 27، وتأثير البروتينات من الحمض النووي ملزمة للdsDNA وحلقات، ودرجة الحرارة اعتماد dsDNA والمرونة. أن هذه المواضيع يكون من الصعب معالجة مع سيكليزيشن التقليدية القائمة على يغاز. يمكن أيضا حلقات الفحص القائم على الحنق أن تستخدم لقياس عامل J مقابل طول كفاف، والتي هي العلاقة القياسية لاختبار نماذج البوليمر. ومع ذلك، فإن البروتوكول قدمنا ​​هنا ليست مناسبة تماما لدراسة حلقات من dsDNA وأقصر من 100 سنة مضت. تحت هذا الطول، يصبح dsDNA وحلقات بطيئة للغاية، وبالتالي سوف تتأثر معدل تقاس عمليات أخرى غير مقصودة مثل photobleaching من. يمكن للمرء أن تسريع حركية حلقات الواضح من قبلناجي تركيز عالية من الملح ([نا +]> 500 ملم)، ولكن أهميتها الفسيولوجية مثل هذا القياس يصبح موضع تساؤل. وبالتالي، فإن التحقيق في dsDNA والانحناء في مقاييس الطول أقل من 100 نقطة أساس الاستفادة من النهج متعامد لفحوصات القائم على سيكليزيشن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر جيمس واترز، وادز ورث غيبل وبو برودواتر لقراءة نقدية للمخطوطة. نشكر أيضا أربعة المراجعين المجهولين لتوفير تعليقات مفيدة. نحن نعترف الدعم المالي من معهد جورجيا للتكنولوجيا، وجائزة صندوق ويلكوم بوروز الوظيفي في واجهة العلمي، ومنحة شبكة البحوث طالب من جبهة الخلاص الوطني الفيزياء نظم المعيشة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Small DNA FRAG Extract Kit-100PR VWR 97060-558
Acrylamide 40% solution 500 ml VWR 97064-522
Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml VWR 97063-948
GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp Fermentas SM0241
Mini Vertical PAGE System VWR 89032-300
Syringe filter 0.2 μm CS50 VWR A2666
Trolox Sigma-Aldrich 238813-1G triplet state quencher
Protocatechuic acid (PCA) Sigma-Aldrich 08992-50MG oxygen scavenging system
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) Sigma-Aldrich P8279-25UN oxygen scavenging system
mPEG-silane, MW 2,000 1 g Laysan Bio MPEG-SIL-2000-1g
Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 Laysan Bio Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein Invitrogen A2666
Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs F-540L
Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit IBI Scientific IB47020
Premium plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-1
VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 VWR 48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater Fisher Scientific temperature control
Objective Cooling Collar Bioptechs 150303 temperature control
KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage Semprex KMI53
High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW Edmund optics NT66-968 Cy3 excitation
CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector Coherent 1139604 Cy5 excitation
650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter Semrock FF650-Di01-25x36 splitting dichroic
LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm Semrock LM01-552-25 combining dichroic
Brightline Fluorescence Filter 593/40 Semrock FF01-593/40-25 Cy3 emission filter
635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm Semrock BLP01-635R-25 Cy5 emission filter
EMCCD iXon+ Andor Technology DU-897E-CS0-#BV
IX51 inverted microscope frame Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF Olympus
Immersion oil type-F for fluorescence microscopy Olympus IMMOIL-F30CC
2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated  Edmund optics 54-092 miniature mirror
1/4" Travel Single-Axis Translation Stage Thorlabs MS-1 translation of miniature mirror
Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm Thorlabs AC254-200-A focusing lens
Adjustable Mechanical Slit Thorlabs VA100
Dielectric Mirror Thorlabs BB1-E02
Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm Thorlabs AC254-100-A relay lens
Lens Mount for Ø1" Optics Thorlabs LMR1
Dichroic Filter Mount Thorlabs FFM1
Fixed Cage Cube Platform Thorlabs B3C
Kinematic Mount for Ø1" Optics Thorlabs KM100
N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm Thorlabs LA1422-A collimating lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm Thorlabs LA1222-A telescope lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm Thorlabs LA1433-A telescope lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
  2. Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
  3. Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
  4. Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
  5. Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
  6. Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  7. Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
  8. Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
  9. Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
  10. Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
  11. Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
  12. Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
  13. Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
  14. Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
  15. Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
  16. Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
  17. Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
  18. Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
  19. Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
  20. Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  21. Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
  22. Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
  23. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
  24. Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
  25. Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
  26. Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
  27. Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).

Tags

علم الأحياء الجزيئية، العدد 88، حلقات الحمض النووي، J عامل، جزيء مفرد، الحنق، جل التحول والتنقل، وانحناء الحمض النووي، مثل دودة سلسلة
دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le, T. T., Kim, H. D. Studying DNA… More

Le, T. T., Kim, H. D. Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (88), e51667, doi:10.3791/51667 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter