Summary
Deze studie geeft een gedetailleerde experimentele procedure om looping dynamiek van dubbelstrengs DNA meten met behulp van single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Het protocol beschrijft ook hoe de looping kansdichtheid genaamd de J-factor halen.
Abstract
Buigen van dubbelstrengs DNA (dsDNA) is geassocieerd met vele belangrijke biologische processen zoals DNA-eiwit herkenning en DNA verpakking in nucleosomen. Thermodynamica van dsDNA buiging is bestudeerd door een methode genaamd ringvorming die gebaseerd is op DNA ligase covalent treden korte kleverige uiteinden van dsDNA. Echter, kan ligatie efficiëntie worden beïnvloed door vele factoren die niet gerelateerd zijn aan dsDNA looping zoals de DNA-structuur rond de sloot sticky ends, en ligase kan ook invloed hebben op de schijnbare looping tarief via mechanismen zoals niet-specifieke binding. Hier laten we zien hoe dsDNA looping kinetiek meten zonder ligase door het detecteren van tijdelijke DNA lusvorming door FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA-moleculen zijn opgebouwd volgens een eenvoudige PCR-gebaseerde protocol met een FRET-paar en een biotine linker. De lus kansdichtheid bekend als de J-factor wordt uit de looping snelheid en de annealing-verhouding tussen twee scheidersted sticky ends. Door het testen van twee dsDNAs met verschillende intrinsieke krommingen, tonen we dat de factor J gevoelig is voor de eigen vorm van de dsDNA.
Introduction
Inzicht in de mechanische eigenschappen van dsDNA is van fundamenteel belang in de basiswetenschappen en technische toepassingen. De structuur van dsDNA is ingewikkelder dan een rechte spiraalvormige ladder omdat roll, tilt, en draai hoeken tussen opeenvolgende baseparen kan variëren met de volgorde. Thermische fluctuaties veroorzaken dsDNA tot diverse vormen van conformationele schommelingen zoals buigen, draaien en strekken ondergaan. Overgangen zoals smelten en knikken kan ook in extreme omstandigheden.
Onder deze moties, dsDNA buigen is de meest opvallende biologische gevolgen 1. dsDNA buigen is geassocieerd met gen repressie of activatie doordat twee verre plaatsen dicht bij elkaar. Het speelt ook een belangrijke rol in DNA verpakking in de celkern of virale capside. Buigvervorming van dsDNA kan experimenteel worden gevisualiseerd door hoge-resolutie microscopie (AFM 2 en 3 TEM) en de ThermodynAmics en kinetiek kan worden bestudeerd door looping assays, die chemisch verbinden naast elkaar plaatsen van de dsDNA.
Een dergelijke bepaling is ligase-afhankelijke cyclisatie 4. In deze assay worden dsDNA moleculen met 'sticky' (cohesieve) uiteinden circulair of gedimeriseerd door DNA ligase. Door het vergelijken van de percentages cirkel en dimeervorming kan men een effectieve molaire concentratie van een uiteinde van het DNA in de nabijheid van het andere uiteinde, die bekend staat als de J factor verkrijgen. Deze J factor dimensioneel gelijk aan de waarschijnlijkheidsverdeling van het vinden van een uiteinde van het DNA op een korte afstand van het andere uiteinde, en reflecteert dus de flexibiliteit van het DNA. Het meten van de J als functie van DNA lengte onthult vele kenmerken DNA mechanica waaronder de persistentielengte 4,5.
De worm-achtige keten (WLC) model is algemeen beschouwd als de canonieke polymeer model voor dsDNA monteurs op basis van zijn succes in toelichtingining de kracht-extensie curves verkregen DNA trekken experimenten 6, en het correct voorspellen van de J factoren van dsDNAs langer dan 200 bp 7. Bij gebruikmaking van de ringvorming kwantitatieve analyse van dsDNA-moleculen zo kort als 100 bp, Cloutier en Widom gemeten J factoren die enkele orden van grootte hoger dan de WLC modelvoorspelling 8 zijn. Een jaar later, Du et al.. geproduceerd J factoren in overleg met de WLC model met behulp van de ringsluiting assay met lagere concentraties van ligase en krijgen het afwijkende resultaat uit de Widom groep hoge ligase gebruikte concentraties 9. Deze controverse is een voorbeeld van de onvermijdelijke invloed van DNA-ligase op cycliseringsreactie kinetiek bij gebruik van de conventionele test 9. Bovendien kan DNA-ligase ook invloed hebben DNA-structuur en stijfheid door specifieke binding 10,11.
Om de technische bezwaren van eiwit-afhankelijke looping assays elimineren, we onlangs aangetoond een protein-free looping assay gebaseerd op Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Bij deze werkwijze worden een lus conformaties gedetecteerd door FRET tussen de donor en acceptor bevestigd nabij de kleverige uiteinden van een DNA-molecuul. Een objectieve type totale interne reflectie fluorescentie microscoop (TIRFM) wordt gebruikt om trajecten van reversibele looping en unlooping gebeurtenissen uit het oppervlak geïmmobiliseerde enkel DNA moleculen gedurende lange tijd nemen. Deze werkwijze heeft PCR gebaseerde assemblage van DNA moleculen aan-mismatch vrij DNA moleculen, een cruciale verbetering over eenzelfde methode Vafabakhsh Ha en 13 genereren. De single-molecule aspect van dit protocol maakt meting van de uitkeringen in aanvulling op gemiddelden ensemble terwijl de FRET aspect maakt het mogelijk om DNA looping dynamiek herhaaldelijk meten van hetzelfde molecuul, zelfs in omstandigheden die ligase activiteit kan schaden.
De TIRFM opstelling is weergegeven in figuur 1. Een aangepasteOntworpen specimen stadium wordt geplaatst over een Olympus IX61 microscoop lichaam. 532 nm en 640 nm lasers worden ingebracht van de zijkant en worden gereflecteerd door kleine elliptische spiegel 14 in de hoge NA doel kritische invalshoek bereiken op het dekglaasje-water grensvlak. Wij merken op dat meer verspreid via-doelstelling TIR met behulp van dichroïsche spiegels of prisma-gebaseerde TIR instellingen kunnen ook worden gebruikt voor deze FRET toepassing. De fluorescentie beeld gevormd door de microscoop wordt opgesplitst in donor-en acceptor beelden door een dichroïsche spiegel. Ze worden vervolgens opnieuw afgebeeld op twee helften van een EMCCD. Aanvullende emissiefilters long pass gebruikt om achtergrondsignaal verminderen.
De temperatuurregeling is essentieel voor het verkrijgen van reproduceerbare kinetische gegevens. Voor de temperatuurregeling, wordt het doel gescheiden van het neusstuk van de microscoop lichaam om warmte-overdracht, en water uit een temperatuur gecontroleerde chiller / verwarming te minimaliseren wordt gecirculeerd door een messing kraag die goed pastrond het interieur metaal onder de doelstelling jas. Deze opstelling kan robuuste temperatuurregeling bij het dekglaasje oppervlak tussen 15 en 50 ° C (Figuur 2) te bereiken. In dit werk werd het monster temperatuur op 24 ° C.
Het volgende protocol toont de stap-voor-stap procedure voor DNA constructie schatting van DNA vorm, single-molecule experiment en J factor bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DsDNA Monsterbereiding
- Ontwerpen wereldwijd gebogen DNA door het herhalen van een 10-meer sequentie. Bijvoorbeeld, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'is een 186-bp DNA gebogen waarbij X een willekeurig extra basis en de sequentie flankerende het herhalende 10-meer sequentie adaptersequenties.
Opmerking. In dit voorbeeld twee 10-meren met tegengestelde voorkeuren nucleosoom vorming basis van een grootschalig nucleosoom bezetting studie van Kaplan et al. 15 gekozen. Sinds de spiraalvormige herhaling van dsDNA is bijna 10 bp, zal de netto afbuiging van de spiraalvormige as van de 10-meer accumuleren tot een vorm zoals een cirkelvormige boog (figuur 3A) te produceren. Sinds de spiraalvormige periode dichter bij 10,5 bp, wordt een extra base ingevoegd na elke twee herhalingen aan de gebogen structuur houden zo vlak mogelijk. Deze sequenties korter dan 200 bp kan van companie worden bestelds dat aanbod gensynthese service. Het is handig om deze sequenties gemeenschappelijke adaptersequenties voor daaropvolgende stappen flankeren. De procedure is schematisch in figuur 3B. - Voer PCR met Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) en Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). OPMERKING: Primer 2 is gelabeld met de FRET donor Cy3 aan het 5'-uiteinde. Een typische PCR recept en fietsen protocol opgenomen in de tabellen 1 en 2.
- Voer PCR met Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) en Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). OPMERKING: Primer 3 wordt gelabeld met de acceptor FRET Cy5 door de ruggengraat en de biotine-linker aan het 5'-uiteinde. PCR recept en fietsen protocol zijn zoals hierboven.
- Zuiveren de PCR producten met behulp van een PCR cleanup kit.
- Meng de Cy3-gemerkte product en de Cy5-gelabelde product in een buffer strenguitwisseling (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) bij eindconcentraties van 0,4 &# 181, M en 0,1 uM, respectievelijk. OPMERKING: De overmaat Cy3-DNA verhoogt de concentratie van de duplex die zowel Cy3 en Cy5 als gevolg van strenguitwisseling.
- Uitwisseling strengen door incuberen bij 98,5 ° C gedurende 2 min, geleidelijk afkoelen tot 5 ° C met een helling van 0,1 ° C / sec, en incubatie bij 5 ° C gedurende 2 uur.
2. Gelelektroforese te detecteren dsDNA Curvature
- Giet de polyacrylamidegel 16,17 door mengen acrylamide en bis-acrylamide oplossingen op 29.2:0.8 verhouding, 5% (w / v) in 1 x Tris / boraat / EDTA (TBE) buffer bij pH 8,0. Opmerking: 10 ml geloplossing bevat: 1.217 ml 40% acrylamide, 0,667 ml 2% bis-acrylamide, 1 ml 10X TBE, 100 L ammoniumpersulfaat (APS) 10%, 10 L TEMED, en de rest is dH 2 O. Volledige stolling van de gel ongeveer 30 minuten.
- Laad de polyacrylamide gel met DNA-monsters en DNA ladder in 1X laadbuffer (5% glycerol, 0,03% (w / v) broomfenolblauw blue) en laat de gel bij 5-8 V / cm bij 4 ° C gedurende 45 minuten of totdat de kleurstof front benaderingen het einde van de gel.
- Vlekken op de gel met 1X TBE buffer die 0,5 g / ml ethidiumbromide gedurende 30 minuten bevat. Identificeer de DNA-banden onder UV-belichting. Vergelijk band posities met de grootte marker (100 bp DNA-ladder) aan de schijnbare grootte van de DNA-moleculen te berekenen. OPMERKING: Gebogen DNA bewegen over het algemeen langzamer dan rechte DNA's.
3. Flow Cell Preparation
- Boor 6-7 paren van gaten aan twee tegenover elkaar gelegen randen van een glasplaatje (3'' x 1'') met behulp van een kolomboormachine en diamant boren. Na het boren, wrijf de glijbaan in stromend water om zichtbare glaspoeder verwijderen. OPMERKING: De gaten dienen als perfusie-en uitlaten. Tijdens het boren koelen de dia met water is belangrijk om scheuren te voorkomen.
- Plaats de dia's rechtop in een glazen pot en vul deze met water. Ultrasone trillingen gedurende 15 minuten en breng ze in een andere glazen pot dedicated voor aceton reinigen. Vul het met aceton en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten. Spoel de glaasjes met ethanol met behulp van een spray fles en daarna met water. Plaats ze in een beker van polypropyleen, vul het met 5 M kaliumhydroxide, en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten. Tenslotte ultrasone trillingen de objectglaasjes in water gedurende 15 minuten. Reinig de dekglaasjes (nr. 1, 24 x 40 mm) met hetzelfde protocol. OPMERKING: Niet vervuilde dia's en dekglaasjes kan in dH 2 O worden opgeslagen voor gebruik op lange termijn.
- Meng 1 mg biotine-PEG-silaan (MW 3400) met 80 mg mPEG-silaan (MW 2000) in 340 L van 0,1 M natriumbicarbonaat oplossing. Meng goed en centrifugeer het mengsel kort om zich te ontdoen van de bubbels. OPMERKING: De functionalisering van het oppervlak met polyethyleenglycol (PEG) vermindert niet-specifieke binding van DNA aan het oppervlak.
- Zet 80 L van de PEG-oplossing op elke dia toe en laat een dekglaasje overheen. Wacht 45 minuten. Scheid de dekglaasje van de glijbaan met een pincet, spoel ze af met ruime hoeveelheid dH 2 O en laat tzoom drogen in open lucht.
- Plaats dunne reepjes van dubbele plakband over de dia om kanalen te vormen. Lijn een dekglaasje overheen en drukt u stevig op de dekglaasje tegen de dia vloeistofdichte kanalen vormen. Gebruik 5 minuten epoxy aan de randen van de kanalen dichten.
4. Bereiding van Trolox Oplossing
- Zet ~ 30 mg Trolox en 10 ml dH 2 O in een kolf en gebruik een magneet roerstaafje om de oplossing in de open lucht gedurende 18 uur roeren.
- Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 um filter en de pH op 7 door toevoeging ~ 6 ui 1 M Tris-base (pH 11). Opmerking: Trolox is een anti-knipperende reagens dat veel gebruikt wordt in single-molecule studies 18. De antifading actie van Trolox komt van zijn geoxideerde derivaat, dat aanwezig is in gedeeltelijk aangetast Trolox oplossing 19 is. Snel oplossen Trolox in methanol of hoge pH Tris oplossing moet worden vermeden door inefficiënte oxidatie.
5. Single-molecule Imaging
- Injecteer 15 pi neutravidine oplossing (0,5 mg / ml) in het kanaal en wacht 2 min voor spoelen met 100 pl T50 buffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.0).
- Injecteer 50 pl DNA monster (50-100 pM) in het kanaal. Wacht 5 minuten en spoel de ongebonden DNA weg met 100 L van T50 buffer. OPMERKING: DNA moleculen zullen specifiek binden aan het oppervlak door neutravidine-biotine interactie.
- Vul het kanaal met de beeldvormende buffer die een zuurstof opvangsysteem 20 (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox en 500 mM NaCl) bevat.
- Stel de EMCCD in frame-transfer mode naar 2 x 2 binned beelden (256 x 256) te streamen naar de computer met 25 frames per sec.
- Doe immersie olie op de microscoop objectief, en zet de stroom cel op de microscoop podium met behulp van specimen clips. Grof scherpstellen door te kijken naar de laser reflectie patroon op de muur. Fijn scherpstellen met behulp van de live weergave van de fluorescentie imleeftijden op de monitor.
- Begin data-acquisitie met de 532 nm laser in. Controleer de live view en de scherpstelling aan te passen indien nodig. Stop met data-acquisitie wanneer de meeste moleculen photobleached.
OPMERKING: In deze faciliteit, een-lab geschreven C programma om de microscoop controleren en weer live beelden op de monitor wanneer ze worden opgeslagen op de harde schijf wordt gebruikt.
6. Beeldverwerking en Data-analyse
OPMERKING: Een tijdreeks van 256 x 256 beelden worden verwerkt door een MATLAB-code in single-molecule tijd sporen van Cy3 en Cy5 intensiteiten genereren. Om pixels tussen de donor en de acceptor kanaal kanaal van het imago van de gesplitste weergave koppelen, 6-7 paren van Cy3 en Cy5 vlekken, elk paar van hetzelfde molecuul gelijkmatig verspreid over het gezichtsveld, worden handmatig geplukt, en een affiene transformatie wordt berekend met behulp van de coördinaten van deze plekken als ankerpunten.
- Met behulp van een MATLAB script, kijken door alle single-molecule tijd sporen tmuts Toon meerdere overgangen tussen lage en hoge FRET signalen. Identificeer de lus en unlooped staten.
Opmerking: Het FRET signaal wordt gedefinieerd als de Cy5 intensiteit (I a) gedeeld door de som van Cy3 en Cy5 intensiteiten (I a + I d). Looped staat heeft een hoge FRET waarde terwijl unlooped staat heeft lage FRET waarde. Het histogram van FRET signalen van een enkel molecuul wordt bimodaal verdeeld vanwege omkeerbare looping en unlooping. - Zoek de drempel die de twee verdelingen scheidt door het bepalen van het snijpunt tussen de twee gepaste Gauss curves.
- Bereken de FRET efficiëntie
en wijs de lus staten met een hoge FRET waarden en de unlooped landen met lage FRET waarden. - Met een MATLAB script analyseren de cumulatieve aantal moleculen (N (t)) dat een lus (ofbereikte de hoge FRET staat) op verschillende tijdstippen vervalt sinds het begin van de data-acquisitie. OPMERKING: Aangezien een dsDNA-molecuul kan beginnen in een conformatie van de unlooped staat aan het begin van de data-acquisitie, het groeitempo van de lus bevolking weerspiegelt de gemiddelde snelheid over de eerste looping conformaties gemiddeld. Pak de looping tarief k lus door het aanbrengen van N (t) met een exponentiële functie:
Als verhogingen in twee fasen, kan worden uitgerust met een dubbele exponentiële functie: 
In dit geval is k lus verkregen: 
OPMERKING: Theoretisch, de overlevingskans dat een polymeer is niet gelust op tijdstip t is geen enkele of dubbele exponentiële functie 12. Exponentiële fitting wordt gebruikt als een praktisch middel om de gemiddelde tijd looping extraheren.
en wijs de lus staten met een hoge FRET waarden en de unlooped landen met lage FRET waarden. 
Als verhogingen in twee fasen, kan worden uitgerust met een dubbele exponentiële functie: 
In dit geval is k lus verkregen: 
OPMERKING: Theoretisch, de overlevingskans dat een polymeer is niet gelust op tijdstip t is geen enkele of dubbele exponentiële functie 12. Exponentiële fitting wordt gebruikt als een praktisch middel om de gemiddelde tijd looping extraheren. 7. Bepalen van de J Factor
OPMERKING: De J factor geeft aan hoe geconcentreerd ene uiteinde van een dsDNA rond het andere uiteinde. Het kan worden bepaald door interpolatie van de concentratie van een segment van het DNA dat dezelfde reactiesnelheid zou opleveren met het andere uiteinde bevindt als gemeten looping tarief. Experimenteel wordt een segment geïmmobiliseerd op het oppervlak, en het andere segment is geïntroduceerd op een bepaalde concentratie c. Als de gemeten annealing snelheid tussen de twee uiteinden is k gloeien, wordt vervolgens de J factor 21 van de 
. Het gloeien snelheidsconstante (k = k annealen gloeien / C) is onafhankelijk van de probe concentratie.
- Flow 20 ul van 30-50 pM biotine-Cy5 oligo (Primer 3) into een neutravidine-coated kanaal. Spoel het kanaal met 100 ul T50 weg te spoelen ongebonden oligo's.
- Bereid de beeldvorming buffer zoals in deel 5 met de toevoeging van Cy3 oligo (primer 2) bij een eindconcentratie van 50 nM. Vloeien deze beeldvorming buffer in het kanaal.
- Terwijl de 532 nm laser, zet kort de 640 nm laser op locaties van het oppervlak gebonden Cy5 oligo's te identificeren. Schakel de 640 nm laser en beginnen met het monitoren van de FRET signaal.
OPMERKING: Bij hybridisatie van Cy3 oligo een oppervlak gebonden oligo Cy5, Cy5 fluorescentie zullen voortvloeien uit FRET. - Met een MATLAB script analyseren het aantal moleculen die beginnen in de ongebonden toestand (laag Cy5 intensiteit) maar later zetten in de gegloeide toestand (hoog Cy5 intensiteit) als functie van de tijd van de Cy5 intensiteit sporen.
- Plotten dit aantal gegloeide moleculen tegen de tijd. Past deze curve met een exponentiële functie (
(k gloeien) te verkrijgen. - Herhaal dit experiment bij verschillende concentraties Cy3 oligo (60, 100 en 180 nM) lineariteit tussen de annealing snelheid en de reactant concentratie bevestigen. Extract van de tweede-orde gloeien snelheidsconstante (k gloeien ) Van de helling.
- Bereken de J-factor van
, Waarbij k de lus looping snelheid gemeten in dezelfde buffer staat.
(k gloeien) te verkrijgen. 
, Waarbij k de lus looping snelheid gemeten in dezelfde buffer staat. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA-moleculen voor de looping studie uit een duplexgebied variabele sequentie en lengte enkelstrengs overhangen die complementair aan elkaar zijn. De overhangen, die 7-base lang zijn, kunnen hybridiseren met elkaar om de lus staat vast te leggen. Elke overhang bevat ofwel Cy3 of Cy5 die is gekoppeld aan de DNA backbone via amidiet chemie. De Cy5-overhang is ook verbonden met biotine-TEG (15-atoom Tetra-Ethyleen Glycol spacer) voor oppervlakte immobilisatie (zie figuur 4A). Al deze wijzigingen kunnen in de dsDNA worden opgenomen na een PCR-gebaseerde protocol (protocol nr. 1 en Figuur 3B). De gekozen lengte en volgorde van de overhangen werken goed detecteerbaar en omkeerbaar FRET gebeurtenissen in normale experimentele omstandigheden produceren. De looping en unlooping kinetiek van de DNA lus zijn gevoelig voor de omgevingstemperatuur, en dus een temperatuurregelaar is essentieel voor reproduceerbaarheid. Een dergelijke controller kan gemakkelijk worden opgenomen in de microscoop (Figuur 2).
Met TIRFM, anti-gecorreleerde fluctuaties van Cy3 (donor) en Cy5 (acceptor) signalen van het oppervlak geïmmobiliseerde dsDNA-moleculen waargenomen (Figuur 4B). In de lus staat, de afstand tussen twee kleurstoffen kleiner is dan 5nm, welke leidt tot hoge Cy5 A/D- en Cy3 signaal door hoge FRET efficiency (figuren 4A en 4C). Verschillende controle experimenten werden uitgevoerd om te bewijzen dat de hoge FRET toestand representeert de lus staat. De levensduur van de hoge FRET staat toe met toenemende uitsteeklengte, wat suggereert dat de hoge FRET toestand wordt gestabiliseerd door basenparing tussen de twee overhangen. De levensduur van de hoge FRET staat ook bij afnemende DNA lengte, die wordt verwacht, omdat de lus vrije energie neemt toe naarmate de lus kleiner wordt 12. Op basis van deze gegevens, de hoge en lage FRET states kunnen worden toegewezen aan de lus en unlooped staten, respectievelijk.
Om het effect van intrinsieke kromming van dsDNA op looping testen, werden twee 186 bp dsDNAs met verschillende krommingen geconstrueerd die genoemd "zuivere" (S-DNA) en "gebogen" (C-DNA) op basis van de kromming. De herhalende 10-meer sequentie TTTATCATCC voor de C-DNA en TGACAGCAAC de S-DNA. De totale kromming van elk van deze dsDNAs werd gecontroleerd door PAGE (polyacrylamidegelelektroforese), de meest gebruikte methode voor het schatten dsDNA kromming 16,22. Figuur 5 toont dat de S-DNA loopt gelijk aan het DNA van dezelfde grootte in het DNA ladder (vergelijk baan 1 en baan 2 in figuur 5). Anderzijds, de C-DNA toont groter schijnbare omvang ten opzichte van zijn tegenhanger in de DNA ladder (~ 1,2 groter dan de werkelijke grootte, zie laan 1 en laan 3). Deze waarneming geeft aan dat de C-DNA bezit een grotere intrinsieke curvature dan de S-DNA.
Figuur 6 toont een representatief fluorescentie time trace van de C-DNA (figuur 6A) en de bijbehorende FRET trace (figuur 6B). Vergeleken met de S-DNA (Figuren 4B en 4C), de C-DNA produceert meer high FRET gebeurtenissen tijdens dezelfde tijdsperiode; de C-DNA lussen 4 maal vaker dan de S-DNA in dezelfde acquisitietijd (figuur 7). Dit resultaat toont dat intrinsieke kromming van DNA aanzienlijk beïnvloeden looping dynamiek.
Om de J-factor van de looping tarief halen, moet men de concentratie-onafhankelijke tweede-orde snelheidsconstante voor hybridisatie tussen twee losgekoppeld overhangen meten. Een realisatie van deze meting wordt getoond in Figuur 8A. Hybridisatie van de Cy3 oligo aan het geïmmobiliseerde Cy5 oligo produceert Cy5 intensiteit uitbarstingen als gevolg van FRET. Van meerdere measurements met verschillende Cy3-oligo-concentraties (zie figuur 8B), kan men uitpakken in een statistisch robuuste manier. In ons experiment, de annealing snelheidsconstante tussen de twee oligonucleotiden in 500 mM NaCl werd bepaald als 0,45 ± 0,04 x 10 6 M-1 s -1 zijn. De J factor werd berekend door de looping tarief (k lus) te delen door de tweede-orde snelheidsconstante annealing (k 'annealen). Het was 61 ± 3 nM voor de S-DNA en 265 ± 48 nM voor de C-DNA. De J-factor van de S-DNA (figuur 9) is in de reële overeenstemming met eerdere metingen op gelijke lengte 7.
Figuur 1. Doelstelling type TIRFM. A) excitatie optiek. De 532 nm en 640 nm lasers worden afzonderlijk gecollimeerd tot een similar diameter, samengevoegd in hetzelfde pad door een dichroïsche spiegel, en gericht op een kleine elliptische spiegel geplaatst onder de doelstelling terug diafragma. Het is belangrijk om een achromatische lens voor het focusseren van chromatische aberratie. B) Microscoop optiek minimaliseren. De laterale positie van de miniatuur spiegel moet fijn worden ingesteld zodat de laserstraal kan reflecteren door de doelstelling bij minimaal blokkeren fluorescentie-emissie. Daarom moet deze op een kleine vertaalstadium gemonteerd. Nog een spiegel aan de andere kant geeft de uitgaande laser om te voorkomen dat de detectieoptica. Op het beeldvlak buiten de microscoop lichaam, een instelbare sleuf geplaatst bijsnijden om de helft van het detectiebereik van de CCD. De fluorescentie emissie wordt gesplitst door een dichroïsche spiegel in twee kanalen, en het relais lenzen vormen het tweede beeld op de CCD met 1:1 vergroting. Een van de reflecterende spiegels enigszins geroteerd om de donor te compenserenen acceptor afbeeldingen. Een bandpass en een longpass filters worden gebruikt om de achtergrond respectievelijk te verminderen in de donor en acceptor kanalen. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Temperatuurregeling voor single-molecule experimenten. De ingestelde temperatuur (T s) is de lezing over het water chiller / verwarming. De werkelijke temperatuur (Ta) wordt gemeten met een thermokoppel contact brengen van het bovenoppervlak van het dekglaasje op de microscoop. De plot van de werkelijke temperaturen versus zes verschillende ingestelde temperaturen (zwarte vierkantjes) toont uitstekende lineariteit (groene stippellijn). De robuustheid van de controller wordt weergegeven door willekeurige uitgevoerd op latere tijdstippen (rode ruiten). De inzet is het beeld van de temperatuur controlling eenheid en het doel in hun eindassemblage. De rode lijn vertegenwoordigt een helling van eenheid. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. DNA Design. A) Gebogen dsDNA. Een 10-meer dsDNA wordt voorgesteld als een gebogen buis segment, en de twee enkele strengen als stippellijnen. De spiraalvormige as van een 10-meer DNA niet perfect recht en dus elke aaneenschakeling van dergelijke 10-meer leidt tot toenemende kanteling van de spiraalvormige as in dezelfde richting. Dit effect kan worden benut om een vlakke, superhelische molecuul. B) PCR-gebaseerde voorbereiding van dsDNA genereren. Enkelstrengs DNA's worden weergegeven als een horizontale lijn. Hun werkelijke kromming wordt hier niet afgebeeld. Het centrale segment zwart vertegenwoordigt de uniek deel van het DNA-fragment. Lichtgrijs weergegeven zijn de adaptersequenties die alle DNAs die in deze studie. Primer 1 en 4 hybridiseren aan de voorzijde en achterzijde adapters, respectievelijk. Primer 2 wordt gemerkt met Cy3 aan het 5'-uiteinde. Primer 3 heeft een biotine label aan het 5'-uiteinde en een intern gekoppeld Cy5. De lichtblauwe gebieden van Primer 2 en 3 bevatten complementaire sequenties die als sticky ends functioneren. Ofwel een plasmide of genomisch DNA dat de sequentie van interesse bevat wordt gebruikt als de matrijs in twee afzonderlijke PCR reacties. Cy3-gemerkt dsDNA wordt geproduceerd met primer 1 en 2, en gebiotinyleerd Cy5-gemerkte DNA wordt geproduceerd met primer 3 en 4. Deze twee PCR-producten worden verwarmd en gekoeld samen strenguitwisseling. Vier verschillende dsDNAs worden gevormd, waarvan er slechts een bevat Cy3, Cy5, en biotine. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Experimentele regeling. A) Single-molecule FRET experiment. dsDNA-moleculen gelabeld met Cy3 (groene) enerzijds en Cy5 (rood) anderzijds, geïmmobiliseerd op het PEG (polyethyleenglycol)-coating. Omkeerbaar looping en unlooping van dsDNAs resulteren in hoge FRET (lus) en lage FRET (unlooped) staten, respectievelijk. B) Een typische single-molecule tijdpad van donor (groen) en acceptor (rood) fluorescentie-intensiteiten. De hoge en lage FRET staten worden geïdentificeerd als de lus en unlooped staten, respectievelijk. Ook aangegeven is de eerste keer dat lus wordt gebruikt om de lus te berekenen. (Inzet) De zoom-in figuur toont de anti-correlatie van de Cy3 en Cy5 intensiteiten. C) Een tijdpad van FRET rendement berekend van donor en acceptor intensiteit sporen in B. Figuur 4B en
Figuur 5. Polyacrylamide gelelektroforese (29.2:0.8 acrylamide / bis-acrylamide, 5% in TBE-buffer, pH 8,0) synthetische DNA's. Van links naar rechts, de lanen bevatten 1 kb marker, het 186 bp rechte DNA en 186 bp Gebogen DNA. Dit cijfer is gedeeltelijk aangepast van een eerdere publicatie 12 met toestemming. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 6. Representatieve sporen van de gebogen DNA (DNA-C) (A) en de bijbehorende FRET trace (B). Vergelijking van de intensiteit en FRET sporen tussen S-DNA (Figuren 4B en 4C) en C-DNA (Figuren 6A en 6B) toont duidelijk dat de gebogen DNA ronde vaker dan het rechte DNA in dezelfde buffer staat. (Inzet) De zoom-in figuur toont de anti-correlatie van de Cy3 en Cy5 intensiteiten. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 7. De gemiddelde eerste looping tijden van de rechte en de gebogen DNA. Elke time werd uit ~ 500 moleculen in 5 verschillende gebieden. De fout balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) berekend op basis van 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 8. Bepalen van de gloeien snelheidsconstante van oligo hybridisatie. A) Schematische weergave van de annealing-meting. Cy5 primer geïmmobiliseerd op het oppervlak, en Cy3 primer aanwezig 50-180 nM is. Binding en ontbindende van de Cy3 primer bij 50 nM later reversibel en leiden tot detecteerbare acceptor uitbarstingen, die getoond in de inzet. B) Het gloeien lineair is afhankelijk van de concentratie van vrij oligo. De helling van de lijn staat voor de tweede-orde gloeien snelheidsconstante (k 'Annea l). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 9 De J factoren van de rechte en gebogen DNA berekend nM De J-factor werd bepaald op basis van twee measurables:... De looping koers van de dsDNA lus en het gloeien snelheidsconstante van de vrije complementaire overhangen Klik hier voor grotere afbeelding .
| Bestanddeel | Volume/50 ul reactie | Eindconcentratie |
| 36 pl | ||
| 5x Phusion buffer | 10 gl | 1x |
| 10 mM dNTPs | 1 pi | 200 uM elk |
| Voorwaartse primer (25 uM) | 1 pi | 0,5 uM |
| Reverse primer (25 uM) | 1 pi | 0,5 uM |
| Phusion warme start DNA-polymerase (2 U / pl) | 0,5 pl | 0,02 U / ul |
| DNA Template | 0,5 pl | ~ 1 ng |
Tabel 1. PCR-mix. Het protocol is geoptimaliseerd voor Phusion DNA polymerase. Artikelen dienen te worden toegevoegd in deze volgorde.
| Cyclus stap | Temperatuur | Tijd | Aantal cycli |
| Initiële denaturatie | "> 95 ° C30 sec | 1 | |
| Denaturatie | 95 ° C | 5 sec | 30 |
| Gloeien | 60 ° C | 10 sec | |
| Uitbreiding | 72 ° C | 15 sec / kb | |
| Laatste verlenging | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 & #176; C | houden |
Tabel 2. PCR fietsen instructies. Wordt de annealing temperatuur bepaald op basis van de smelttemperatuur van de primers. De verlengingstijd is geoptimaliseerd voor de Phusion DNA polymerase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een eenvoudige single-molecule assay gebaseerd op FRET werd gebruikt om looping kinetiek van DNA van verschillende intrinsieke vormen bestuderen. Gebogen DNA kan worden bereid door het herhalen van een 10-meer sequentie in fase met de spiraalvormige periode van 10,5 bp en de krommingen kunnen worden geschat PAGE. Deze dsDNAs zijn ontworpen met sticky ends op voorbijgaande lus kan stabiliseren. We onttrokken de looping tarief van de exponentiële toename van het aantal lus moleculen in de tijd. De annealing snelheidsconstante tussen de losgekoppelde kleverige eindsegmenten wordt gebruikt om de concentratie equivalent van de lus waarschijnlijkheidsverdeling, die bekend staat als de J bepalen.
In een ligase gebaseerde DNA cyclisatie test, het meten van DNA sluiting kans is gevoelig voor de ligase concentratie en J factor kan worden overschat als ligase buitensporig 9. Niet-specifieke binding van DNA-ligase aan DNA kan ook van invloed op de looping 10. Bovendien Ligase activiteit is afhankelijk van zout en vervalt na verloop van tijd. Het is dus moeilijk om DNA looping studeren in omstandigheden suboptimaal voor ligase activiteit. Daarentegen, een FRET-gebaseerde looping assay is vrij van al deze problemen.
Het experimentele protocol is vergelijkbaar met die van Vafabakhsh Ha en 13 op twee belangrijke aspecten die discussie waard zijn. Vafabakhsh en Ha 13 construeerden hun dsDNA-moleculen door ligatie van verschillende synthetische oligo's. Hoewel de fout (insertie, deletie of substitutie) tarief per nucleotide in oligo synthese is verwaarloosbaar (f 0.181%) 23, de fractie van ongewenste DNA-sequenties lineair toeneemt met oligo lengte. Daarom kan een 100-bp duplex monster bereid door dit protocol tot ~ 33% imperfecte duplexen die kan resulteren in hogere looping tarief 24 bevatten. In vergelijking, ons protocol gebruikt polymerasekettingreactie (PCR) om de dsDNA-moleculen, die een veel hogere betrouwbaarheid dan DNA che heeft synthetiserenmosynthesis 25. Volgens gegevens van de fabrikant, zou hifi polymerase we een correcte 100 bp DNA-molecuul gegenereerd 99,8% waarschijnlijkheid na 30 cycli van PCR amplificatie.
Een ander belangrijk verschil tussen de twee studies is het oppervlak immobilisatieschema. In onze studie worden DNA moleculen door hun uiteinden aan het oppervlak gehecht terwijl in het protocol door Vafabakhsh Ha en 13, worden ze verbonden door een interne base. Er werd voorspeld dat gebaseerd alleen op de opsluiting effect, een inwendig vastgemaakt dsDNA kan lus vaker dan vrij dsDNA, tot een factor vijf, afhankelijk van de locatie van interne pinning 26. Daarom, bij het meten van de J als functie DNA contour lengte, interne pinning onverwachte variabiliteit introduceren. Het is ook mogelijk dat de gemodificeerde base met de linker een zwakkere baseparing vermogen, wat kan resulteren in een hoger percentage looping. Echter, despite deze duidelijke verschillen, de twee protocollen te produceren soortgelijke J factoren bij 100 bp (~ 3 nM vs ~ 2 nM).
Deze op FRET gebaseerde test lus houdt belofte voor het bestuderen van diverse verschijnselen in verband met dsDNA looping inclusief het effect van mismatches, inkepingen of openingen van dsDNA lus 27, het effect van DNA-bindende eiwitten op dsDNA looping en temperatuursafhankelijkheid van dsDNA flexibiliteit. Deze onderwerpen zou moeilijk te behandelen zijn met de conventionele ligase gebaseerde cyclisatie zijn. De FRET-gebaseerde looping test kan ook worden gebruikt om de J factor tegen de contour lengte, de standaard verhouding polymeer modellen te testen meten. Echter, het protocol dat we hier gepresenteerde is niet goed geschikt voor het bestuderen van looping van dsDNA korter dan 100 bp. Onder deze lengte dsDNA looping zeer langzaam, en derhalve de gemeten snelheid wordt beïnvloed door andere ongewenste processen zoals fotobleken. Men kan de schijnbare looping kinetiek versnellen door onsing hoge zoutconcentratie ([Na +]> 500 mm), maar fysiologische relevantie van een dergelijke meting wordt twijfelachtig. Daarom zal onderzoek dsDNA buigen bij lengteschalen dan 100 bp gebruikmaken van een benadering orthogonaal naar cyclisatie gebaseerde testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken James Waters, Gable Wadsworth en Bo Broadwater voor het kritisch lezen van het manuscript. We danken ook vier anonieme reviewers voor het verstrekken van nuttige opmerkingen. Wij erkennen de financiële ondersteuning van het Georgia Institute of Technology, de Burroughs Wellcome Fonds Career Award op het Wetenschappelijk Interface, en de student onderzoeksnetwerk subsidie van NSF Fysica van levende systemen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).
