Summary
Diese Studie stellt eine detaillierte experimentelle Verfahren zur Looping Dynamik der Doppelstrang-DNA mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zu messen. Das Protokoll beschreibt auch, wie die Looping-Wahrscheinlichkeitsdichte genannt J-Faktor zu extrahieren.
Abstract
Biegen der Doppelstrang-DNA (dsDNA) mit vielen wichtigen biologischen Prozessen wie der DNA-Protein-DNA-Erkennung und Verpackung in Nukleosomen verbunden. Thermodynamik der dsDNA Biege wurde durch eine Methode namens Cyclisierung, die auf DNA-Ligase kovalent zu verbinden setzt kurz klebrigen Enden eines dsDNA sucht. Allerdings kann Ligationseffizienz durch viele Faktoren, die nicht verwandt sind dsDNA Looping, wie die DNA-Struktur rund um die klebrigen Enden verbunden, und Ligase betroffen sein können auch die scheinbare Schleifenrate beeinflussen durch Mechanismen wie unspezifische Bindung. Hier zeigen wir, wie man dsDNA Looping Kinetik ohne Ligase durch Erfassen transienter DNA-Schleifenbildung durch FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zu messen. dsDNA-Moleküle werden mit einem einfachen PCR-basiertes Protokoll mit einem FRET-Paar und einem Biotin-Linker konstruiert. Die Schleifenwahrscheinlichkeitsdichte als die J-Faktor bekannt ist, aus dem Looping Rate und der Kühlrate zwischen zwei abschaltung extrahiertted klebrigen Enden. Durch das Testen zwei dsDNAs mit verschiedenen intrinsischen Krümmungen zeigen wir, dass die J-Faktor ist sensibel für die Eigenform der dsDNA.
Introduction
Das Verständnis der mechanischen Eigenschaften von dsDNA ist von grundlegender Bedeutung in der Grundlagenwissenschaften und technische Anwendungen. Die Struktur der dsDNA ist komplizierter als eine gerade, weil spiralförmigen Leiter Rolle, Neige-und Verdrehungswinkel zwischen aufeinanderfolgenden Basenpaare mit der Sequenz variieren. Temperaturschwankungen können dazu führen, dsDNA zu unterschiedlichen Modi Konformationsfluktuationen wie Biegen, Verdrehen und Strecken unterzogen werden. Übergänge wie Schmelzen und Knicken kann auch unter extremen Bedingungen auftreten.
Unter dieser Bewegungen hat dsDNA Biege die auffälligste biologische Wirkung ein. dsDNA Biegung mit Gen-Repression oder Aktivierung, indem zwei entfernten Standorten nahe einander zugeordnet. Es spielt auch eine wichtige Rolle bei der DNA-Verpackung im Zellkern oder ein virales Kapsid. Biegeverformung dsDNA kann experimentell durch die hochauflösende Mikroskopie (AFM-und TEM-2 3) und der ThermoDyn visualisiert werdenamics und Kinetik kann durch Looping-Assays, die chemisch verbinden nebeneinander liegenden Stellen des dsDNA sucht werden.
Ein solcher Test ist Ligase-abhängig Cyclisierung 4. In diesem Assay werden dsDNA-Molekülen mit "klebrig" (kohäsiven) Enden zirkularisiert oder durch DNA-Ligase dimerisiert. Durch Vergleichen der Raten der Kreis und die Dimer-Bildung, kann man eine effektive molare Konzentration von einem Ende der DNA in der Nähe des anderen Endes, die als J-Faktor bekannt ist, erhalten. Dieser Faktor ist dimensions J entspricht der Wahrscheinlichkeitsdichte des Findens ein Ende der DNA in einem kurzen Abstand von dem anderen Ende, und spiegelt damit die Flexibilität der DNA. Die Messung der J-Faktor als Funktion der DNA-Länge zeigt viele Merkmale über die DNA Mechanik einschließlich der Persistenz Länge 4,5.
Das wurmartige Kette (WLC)-Modell wurde weithin als der kanonischen Polymer-Modell für dsDNA Mechanik basierend auf dem Erfolg in Erklärungen angesehenining der Kraft-Dehnungs-Kurven in DNA ziehen Experimente 6 und richtig Vorhersage der J Faktoren dsDNAs länger als 200 bp 7 erhalten. Allerdings mit der Cyclisierung Assay an dsDNA-Moleküle so kurz wie 100 bp, Cloutier und Widom maßen die J Faktoren, um mehrere Größenordnungen höher als die WLC-Modell-Vorhersage 8 sein. Ein Jahr später, Du et al. J Faktoren erzeugt im Einvernehmen mit dem WLC-Modell mit dem Cyclisierung Assay mit niedrigeren Konzentrationen von Ligase und schrieb den anomalen Ergebnis aus der Gruppe Widom hohen Konzentrationen verwendet Ligase 9. Diese Kontroverse zeigt beispielhaft die unvermeidlichen Einfluss der DNA-Ligase auf Cyclisierung Kinetik bei Verwendung der herkömmlichen Assay 9. Darüber hinaus kann auch auf DNA-Ligase DNA-Struktur und Steifigkeit durch unspezifische Bindung 10,11.
Um die technischen Belange der Protein-abhängige Looping-Assays zu beseitigen, vor kurzem haben wir gezeigt, eine protein-kostenlos Looping Assay, der auf Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) 12. In diesem Verfahren werden geschleift Konformationen von FRET zwischen dem Donor und Akzeptor in der Nähe der klebrigen Enden eines DNA-Moleküls gebunden nachgewiesen. Eine Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopobjektiv-Typ (TIRF) verwendet, um Bahnen der reversible Looping und unlooping Ereignisse von der Oberfläche immobilisierten DNA-Einzelmoleküle für einen längeren Zeitraum aufzuzeichnen. Diese Methode bietet PCR-basierten Aufbau von DNA-Molekülen an Mismatch-freie DNA-Moleküle, die eine entscheidende Verbesserung gegenüber einer ähnlichen Methode Vafabakhsh und Ha 13 zu generieren. Die Einzelmolekül-Aspekt dieses Protokoll ermöglicht die Messung von Verteilungen zusätzlich zu Durchschnittswerte Ensemble während der FRET-Aspekt ermöglicht es, DNA-Looping Dynamik wiederholt aus dem gleichen Molekül messen, auch unter Bedingungen, die Ligase-Aktivität beeinträchtigen können.
Die TIRFM Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Eine benutzerdefinierteGestalteten Probentisch wird über eine Olympus IX61 Mikroskop Körper platziert. 532 nm und 640 nm-Laser von der Seite eingeführt werden und durch kleine elliptische Spiegel 14 in den hohen NA Ziel reflektiert wird, um kritische Einfallswinkel, unter dem Deckglas-Wasser-Grenzfläche zu erreichen. Wir stellen fest, dass eine weit verbreitete Durch Ziel TIR mit dichroitischen Spiegeln oder Prismen TIR-basierte Setups können auch für diese FRET-Anwendung verwendet werden. Das Fluoreszenzbild durch das Mikroskop gebildet wird durch einen dichroitischen Spiegel in Donor-und Akzeptor-Bilder aufgeteilt. Sie werden dann auf beiden Hälften eines EMCCD erneut abgebildet. Weitere Langpassemissionsfilter verwendet werden, um Hintergrundsignal zu reduzieren.
Die Temperaturregelung ist unerlässlich für den Erwerb reproduzierbare kinetischen Daten. Zur Temperaturregelung wird das Ziel aus dem Mundstück des Mikroskopkörpers um die Wärmeübertragung und Wasser von einer Temperatur gesteuert Kühler / Heizung minimieren getrennt durch eine Messing-Kragen, die eng passt in Umlaufum die innere Metall unter der Ziel-Jacke. Diese Einrichtung ist in der Lage, stabile Temperaturregelung an der Deckfläche zwischen 15 und 50 ° C (Fig. 2) zu erreichen. In dieser Arbeit wurde die Probentemperatur auf 24 ° C gehalten wird
Das folgende Protokoll zeigt die Schritt-für-Schritt-Verfahren für die DNA-Konstruktion, die Einschätzung der DNA-Form, Einzelmolekül-Experiments, und J-Faktor Bestimmung.
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Protocol
1. DsDNA Probenvorbereitung
- Gestalten Sie global gekrümmt DNAs durch Wiederholung eines 10-mer-Sequenz. Zum Beispiel 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'ist ein 186-bp-DNA gekrümmten wobei X eine Zufalls zusätzlichen Basis und der flankierenden Sequenz die sich wiederholende 10-mer-Sequenz Adaptersequenzen.
HINWEIS:. In diesem Beispiel wurden zwei 10-mere mit gegenüberliegenden Präferenzen Nukleosom Bildung auf der Grundlage einer großen Nukleosom Belegung Studie von Kaplan et al 15 gewählt. Da die Schrauben Wiederholung der dsDNA ist nahe bei 10 bp, wird jede Netz Auslenkung der Schraubenachse des 10-mer zu akkumulieren, um eine Form wie ein Kreisbogen (Abbildung 3A) zu erzeugen. Da die Schrauben Zeit ist näher an 10,5 bp, wird eine zusätzliche Basis nach jeweils zwei Wiederholungen eingesetzt, um die gekrümmte Struktur so eben wie möglich zu halten. Diese Sequenzen kürzer als 200 bp aus Companie bestellt werdens Angebot, dass Gen-Synthese-Service. Es ist zweckmäßig, diese Sequenzen mit gemeinsamen Adaptersequenzen für nachfolgende Schritte flankieren. Das Verfahren ist in Fig. 3B schematisch dargestellt. - Führen Sie die PCR mit Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) und Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). HINWEIS: Primer 2 mit der FRET-Donor Cy3 am 5'-Ende markiert. Ein typisches PCR-Protokoll Rezept und Radfahren sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.
- Führen Sie die PCR mit Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) und Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). HINWEIS: Primer 3 mit dem FRET-Akzeptor Cy5 durch das Rückgrat und die Biotin-Linker am 5'-Ende markiert. PCR-Rezept und Radfahren Protokoll wie oben.
- Reinige die PCR-Produkte mit Hilfe eines PCR-Reinigung-Kit.
- Mischen die Cy3-markierten Produkt und die Cy5-markierte Produkt in einem Puffer für den Strangaustausch (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) in Endkonzentrationen von 0,4 undNr. 181, M und 0,1 uM. HINWEIS: Die überschüssige Cy3-DNA erhöht die Konzentration des Duplex Durchführung sowohl Cy3 und Cy5 als Ergebnis der Strangaustausch.
- Wechsel Stränge durch Inkubation bei 98,5 ° C für 2 Minuten, allmähliches Abkühlen bis 5 º C Anstiegsrate von 0,1 ° C / sec, und Inkubation bei 5 ° C für 2 Stunden.
2. Gel-Elektrophorese zu dsDNA Krümmung Detect
- Gießen Polyacrylamidgel 16,17 durch Mischen Acrylamid und Bisacrylamid Lösungen bei 29.2:0.8 Verhältnis von 5% (w / v) in 1 × Tris / Borat / EDTA (TBE)-Puffer bei pH 8,0. Hinweis: 10 ml Gel-Lösung enthält: 1,217 ml 40% Acrylamid, 0,667 ml 2% Bis-Acrylamid, 1 ml 10x TBE, 100 L Ammoniumpersulfat (APS), 10%, 10 l TEMED, und der Rest ist dH 2 O. Vollständige Verfestigung des Gels beträgt etwa 30 min.
- Laden der Polyacrylamid-Gel mit DNA-Proben und die DNA-Leiter in 1X-Beladungspuffer (5% Glycerin, 0,03% (w / v) Bromphenolblau blue) und führen Sie das Gel bei 5-8 V / cm bei 4 ° C für 45 Minuten oder bis die Farbstofffront nähert sich dem Ende des Gels.
- Färben Sie das Gel mit 1X TBE-Puffer, der 0,5 g / ml Ethidiumbromid für 30 min enthält. Identifizieren Sie die DNA-Banden unter UV-Beleuchtung. Vergleichen Bandpositionen mit der Größe Marker (100 bp DNA-Leiter), um die scheinbare Größe der DNA-Moleküle zu berechnen. HINWEIS: Gebogene DNAs bewegen in der Regel langsamer als gerade DNAs.
3. Durchflusszelle Vorbereitung
- Drill 6-7 Paare von Löchern, die entlang zwei gegenüberliegenden Rändern eines Glasobjektträgers (3'' × 1'') unter Verwendung einer Bohrmaschine und Diamantbohrer. Nach dem Bohren, reiben Sie die Folie in fließendem Wasser, um sichtbare Glaspulver zu entfernen. HINWEIS: Die Löcher dienen als Perfusions-und Auslässe. Beim Bohren ist Kühl die Folie mit Wasser wichtig Rissbildung zu vermeiden.
- Legen Sie die Folien aufrecht in ein Glas und füllen es mit Wasser. Beschallen für 15 min und übertragen sie in ein anderes Glas deAceton für Reinigungs dicated. Füllen Sie sie mit Aceton und beschallen für 15 min. Spülen Sie die Folien mit Ethanol mit einer Sprühflasche und dann mit Wasser. Legen Sie sie in einem Polypropylen-Glas, füllen Sie es mit 5 M Kaliumhydroxid und beschallen für 15 min. Schließlich beschallen die Folien in Wasser 15 min. Reinigen Sie die Deckgläser (Nr. 1, 24 x 40 mm) mit dem gleichen Protokoll. HINWEIS: Gereinigt Rutschen und Deckgläser können in dH 2 O für langfristige Gebrauch gespeichert werden.
- Mischen 1 mg Biotin-PEG-Silan (MW 3400) mit 80 mg mPEG-Silan (MW 2000) in 340 L 0,1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung. Gut mischen und zentrifugieren Sie die Mischung kurz auf von Blasen loszuwerden. HINWEIS: Die Funktionalisierung der Oberfläche mit Polyethylenglykol (PEG) trägt zur Verringerung unspezifischer Bindung von DNA an die Oberfläche.
- Setzen Sie 80 L der PEG-Lösung auf jeder Folie und senken Sie ein Deckglas darüber. Warten Sie 45 min. Trennen Sie das Deckglas aus der Folie mit einer Pinzette, spülen Sie sie mit reichlich dH 2 O und sei tSaum trocken im Freien.
- Legen Sie dünne Streifen von doppelseitigem Klebeband auf der Folie, um Kanäle zu bilden. Richten Sie ein Deckglas darüber und drücken Sie fest auf das Deckglas gegen den Schieber, um flüssigkeitsdichte Kanäle bilden. Wählen Sie mit 5 Minuten-Epoxy, um die Kanten der Kanäle zu versiegeln.
4. Vorbereitung der Trolox-Lösung
- Setzen ~ 30 mg Trolox und 10 ml dH 2 O in einem Kolben und verwenden Sie einen Magneten Rührstab, um die Lösung in der offenen Luft für 18 Stunden rühren.
- Filtern der Lösung unter Verwendung eines 0,2 &mgr; m-Filter und den pH auf 7 durch Zugabe von ~ 6 ul 1 M Tris-Base (pH 11). Hinweis: Trolox ist ein Anti-Reagenz blinkt die üblicherweise in Einzel-Molekül verwendet wird, untersucht 18. Die Wirkung von Trolox Antifading kommt aus seiner oxidierten Derivat, das in teilweise abgebaut Trolox-Lösung 19 vorhanden ist. Schnell Lösen Trolox in Methanol oder hohen pH-Tris-Lösung sollte durch ineffiziente Oxidation vermieden werden.
5. Einzel-molkül Imaging
- Injizieren 15 ul NeutrAvidin-Lösung (0,5 mg / ml) in den Kanal und Warten für 2 Minuten vor dem Spülen mit 100 ul T50-Puffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,0).
- Injizieren 50 ul DNA-Probe (50-100 pM) in den Kanal. 5 min warten und spülen Sie die ungebundene DNA weg mit 100 L T50-Puffer. HINWEIS: Die DNA-Moleküle spezifisch an die Oberfläche binden durch die NeutrAvidin-Biotin-Wechselwirkung.
- Füllen Sie den Kanal mit der Bildpuffer, die eine sauerstoffbindende System 20 (100 mm Lochkreis, 5 mM PCA, 1 mM Trolox und 500 mM NaCl) enthält.
- Stellen Sie den Rahmen in EMCCD-Übertragungsmodus auf dem Computer mit 25 Bildern pro Sekunde streamen 2 x 2 klassierte Bilder (256 x 256).
- Setzen Sionsöl auf dem Mikroskopobjektiv, und befestigen Sie die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch mit Probe-Clips. Grob den Fokus, indem man die Laser-Reflexionsmuster an der Wand. Feineinstellung des Fokus mit der Live-Ansicht der Fluoreszenz imAlter auf dem Monitor.
- Beginnt die Datenerfassung mit dem 532-nm-Laser auf. Überprüfen Sie die Live-Ansicht und stellen Sie den Fokus, wenn nötig. Stoppen Sie die Datenerfassung, wenn die meisten Moleküle haben gebleicht.
HINWEIS: In dieser Anlage wird ein Labor-C-Programm geschrieben, um die Mikroskopsteuerung und Anzeige von Live-Bildern auf dem Bildschirm, wie sie auf der Festplatte gespeichert sind, verwendet.
6. Bildverarbeitung und Datenanalyse
HINWEIS: Eine Zeitreihe von 256 x 256 Bilder werden mit einem MATLAB-Code verarbeitet, um Einzelmolekülzeitverläufe von Cy3-und Cy5-Intensitäten zu erzeugen. Um Pixel zwischen dem Spender und dem Akzeptor-Kanal Kanal des Split-View-Bild-Paare, 6-7 Paare von Cy3 und Cy5-Spots, wobei jedes Paar aus dem gleichen Molekül gleichmäßig über das Sichtfeld verteilt sind, werden von Hand gepflückt, und eine affine Transformation wird unter Verwendung der Koordinaten dieser Punkte als Ankerpunkte berechnet.
- Mit einem MATLAB-Skript, durch alle Einzelmolekül-Zeit zu suchen Spuren tHut zeigen mehrere Übergänge zwischen niedrigen und hohen FRET-Signale. Identifizieren Sie die geschleift und geloopten Staaten.
HINWEIS: Die FRET-Signal wird als das Cy5 Intensität (I a), dividiert durch die Summe der Cy3-und Cy5-Intensitäten (I a + I d). Geschleift Staat hat hohe FRET-Wert, während ungeloopte Zustand niedrigen FRET-Wert hat. Das Histogramm von FRET-Signale von einem einzelnen Molekül ist bimodal wegen reversible Looping und unlooping verteilt. - Finden Sie die Schwelle, die die beiden Verteilungen durch die Bestimmung der Schnittpunkt zwischen den beiden Einbau Gaußkurven trennt.
- Berechnen Sie die FRET-Effizienz als
und weisen Sie die geschleift Staaten mit hohen FRET-Werten und den geloopten Staaten mit niedrigen FRET-Werte. - Mit einem MATLAB-Skript, analysieren die kumulative Anzahl der Moleküle (N (t)), die eingeschleift (odererreicht die hohe FRET-Zustand) zu verschiedenen Zeitabläufen seit Beginn der Datenerfassung. HINWEIS: Da eine dsDNA-Molekül kann in jeder Konformation des geloopten Zustand zu Beginn der Datenerfassung zu starten, die Steigerungsrate in der Bevölkerung spiegelt die geschlungenen Schleifendurchschnittsrate gemittelt über anfängliche Konformationen. Entpacken Sie die Looping Rate k-Schleife durch den Einbau N (t) mit einer Exponentialfunktion:
Wenn biphasisch steigt, kann es mit einem Doppel Exponentialfunktion montiert werden: 
In diesem Fall ist k Schleife erhalten aus: 
HINWEIS: Theoretisch ist die Überlebenswahrscheinlichkeit, dass ein Polymer nicht zum Zeitpunkt t geschlungen ist nicht eine einfache oder doppelte Exponentialfunktion 12. Exponential fitting wird als praktisches Mittel, um die durchschnittliche Kreiszeit zu extrahieren.
und weisen Sie die geschleift Staaten mit hohen FRET-Werten und den geloopten Staaten mit niedrigen FRET-Werte. 
Wenn biphasisch steigt, kann es mit einem Doppel Exponentialfunktion montiert werden: 
In diesem Fall ist k Schleife erhalten aus: 
HINWEIS: Theoretisch ist die Überlebenswahrscheinlichkeit, dass ein Polymer nicht zum Zeitpunkt t geschlungen ist nicht eine einfache oder doppelte Exponentialfunktion 12. Exponential fitting wird als praktisches Mittel, um die durchschnittliche Kreiszeit zu extrahieren. 7. Bestimmung der J-Faktor
HINWEIS: Die J-Faktor darstellt, wie konzentriert das eine Ende eines dsDNA ist, um das andere Ende. Es kann durch Interpolieren der Konzentration von einem Ende des Segments der DNA, die die gleiche Reaktionsgeschwindigkeit mit dem anderen Ende des Segments gemessenen Schlingengeschwindigkeit erzeugen würde, bestimmt werden. Experimentell wird ein Endabschnitt auf der Oberfläche immobilisiert ist, und der andere Endabschnitt wird in einer bestimmten Konzentration c eingeführt. Wenn die gemessene Kühlrate zwischen den beiden Enden ist k Glühen, dann wird der Faktor 21 J gegeben durch 
. Die Kühlrate-Konstante (k = k Glühen Glühen / C) ist unabhängig von der Sondenkonzentration.
- Fluss 20 ul von 30-50 pM Biotin-Cy5 Oligo (Primer 3) into NeutrAvidin einer beschichteten Kanal. Spülen Sie den Kanal mit 100 ul T50 abzuwaschen ungebundenen Oligos.
- Vorbereitung des Bilderzeugungspuffer, wie in Teil 5 mit dem Zusatz von Cy3 Oligo (Primer 2) in einer Endkonzentration von 50 nM beschrieben. Fluss dieses Bildpuffer in den Kanal.
- Während die 532-nm-Laser auf, kurz drehen Sie den 640-nm-Laser auf Standorte der Oberfläche gebundenen Cy5 Oligos zu identifizieren. Schalten Sie die 640-nm-Laser und starten Sie die Überwachung des FRET-Signals.
HINWEIS: Bei der Hybridisierung eines Oligo Cy3 mit einem oberflächengebundenen Oligo Cy5, Cy5-Fluoreszenz wird von FRET auftreten. - Mit einem MATLAB-Skript, analysieren die Anzahl der Moleküle, die im ungebundenen Zustand (geringe Cy5-Intensität) zu starten, aber später in die geglühten Zustand (hohe Intensität Cy5) drehen als Funktion der Zeit aus den Cy5 Intensität Spuren.
- Zeichnen Sie diese Anzahl von geglüht Moleküle gegen die Zeit. Setzen Sie diese Kurve mit einer einzigen Exponentialfunktion (
(k Glühen) zu erhalten. - Wiederholen dieses Experiment bei verschiedenen Cy3 Oligo-Konzentrationen (60, 100 und 180 nM), um die Linearität zwischen der Kühlrate und der Konzentration der Reaktanten zu bestätigen. Entpacken Sie die zweiter Ordnung Glühen Geschwindigkeitskonstante (k Glühen ) Von der Piste.
- Berechnen Sie die J-Faktor aus
, Wobei k-Schleife ist der Schlingengeschwindigkeit in der gleichen Pufferbedingungen gemessen.
(k Glühen) zu erhalten. 
, Wobei k-Schleife ist der Schlingengeschwindigkeit in der gleichen Pufferbedingungen gemessen. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA-Moleküle für die Untersuchung verwendet Schleifen bestehen aus einem Duplexregion der variablen Sequenz und Länge und einzelsträngige Überhänge, welche komplementär zueinander sind. Die Überhänge, die 7-Basis lang sind, können miteinander zu glühen, um die Loop-Zustand zu erfassen. Jeder Überstand enthält entweder Cy3 oder Cy5, die in dem DNA-Rückgrat durch Amiditchemie verbunden ist. Die Cy5-Überhang ist auch mit Biotin-TEG (15-Atom-Tetra-Ethylen-Glykol-Abstandshalter) für die Oberflächen Immobilisierung (siehe Abbildung 4A) verbunden. Alle diese Modifikationen können in die dsDNA nach einer PCR-basierten Protokolls (Protokoll 1 und 3B) eingearbeitet werden. Die gewählte Länge und Sequenz der Überhänge funktionieren gut, um nachweisbare und reversible FRET Ereignisse in normalen experimentellen Bedingungen zu produzieren. Die Schlingen unlooping und die Kinetik des DNA-Schleife empfindlich auf die Umgebungstemperatur, und daher ist eine Temperatursteuerung wichtig für die Reproduzierbarkeit. Eine solche controller leicht in das Mikroskop (2) eingebracht werden.
Mit TIRFM, anti-korrelierte Fluktuationen der Cy3 (Donor) und Cy5 (Akzeptor)-Signale von der Oberfläche immobilisierten dsDNA-Moleküle wurden (Abbildung 4B). In der geloopten Zustand ist der Abstand zwischen den beiden Farbstoffen kleiner als 5 nm, die in der Hoch Cy5 Signal-und Klein Cy3-Signal durch hohe FRET-Effizienz (4A und 4C) führen würde. Mehrere Kontrollexperimente wurden durchgeführt, um zu beweisen, dass die hohe FRET-Zustand stellt die Loop-Zustand. Die Lebensdauer der hohen FRET-Zustand mit zunehmender Hanglänge, was darauf schließen lässt, dass die hohe FRET-Zustand wird durch Basenpaarung zwischen den beiden Überhänge stabilisiert. Die Lebensdauer der hohen FRET-Zustand verringert auch mit abnehmender DNA-Länge, die erwartet wird, da die Energie steigt Schleife frei wie der Schleife 12 wird kleiner. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse, die hohen und niedrigen FRET states an die geschleift und geloopten Staaten zugeordnet werden, beziehungsweise.
Um die Wirkung der intrinsischen Krümmung der dsDNA auf Looping zu testen, wurden zwei 186 bp dsDNAs mit unterschiedlichen Krümmungen gebaut, die "gerade" (S-DNA) benannt sind und "gebogene" (C-DNA) auf der Grundlage ihrer Krümmung. Die sich wiederholenden 10-mer-Sequenz TTTATCATCC für die C-DNA und TGACAGCAAC für die S-DNA. Die Gesamtkrümmung jeder dieser dsDNAs wurde durch PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese), welche die am weitesten verbreitete Methode zur dsDNA Krümmung 16,22 Schätzung wird geprüft. Fig. 5 zeigt, dass das S-DNA läuft ähnlich wie die DNA mit der gleichen Größe in der DNA-Leiter (vgl. Spur 1 und Spur 2 in Abbildung 5). Auf der anderen Seite, die C-DNA zeigt eine größere scheinbare Größe im Vergleich zu seinem Gegenstück in der DNA-Leiter (~ 1,2 größer als die reale Größe, siehe Spur 1 und Spur 3). Diese Beobachtung zeigt, daß der C-DNA besitzt eine größere Eigen curvature als die S-DNA.
Fig. 6 zeigt eine repräsentative Fluoreszenzzeitspur von der C-DNA (6A) und der entsprechenden Spur FRET (6B). Im Vergleich zum S-DNA (4B und 4C), der C-DNA produziert mehr Hoch FRET Veranstaltungen im gleichen Zeitraum; die C-4-DNA-Schleifen-mal häufiger als die S-DNA im selben Aufnahmezeit (Abbildung 7). Dieses Ergebnis zeigt, dass intrinsische Krümmung der DNA kann erhebliche Auswirkungen auf Looping Dynamik.
Um die J-Faktor aus dem Looping Rate zu extrahieren, muss man die Konzentration unabhängige zweiter Ordnung Geschwindigkeitskonstante für die Hybridisierung zwischen zwei getrennten Überhänge messen. Eine Realisierung einer solchen Messung ist in 8A gezeigt. Die Hybridisierung der Oligo Cy3 an den immobilisierten Oligo produziert Cy5 Cy5 Intensität platzt aufgrund FRET. Von mehreren meaMessungen mit unterschiedlichen Cy3-Oligo-Konzentrationen (siehe Abbildung 8B), kann man in einer statistisch robuste Weise zu extrahieren. In unserem Versuch wurde die Kühlrate konstant zwischen den beiden Oligos in 500 mM NaCl bestimmt zu 0,45 ± 0,04 x 10 6 M -1 s -1 ist. Die J-Faktor wurde durch Division der Looping Rate (k-Schleife) von der zweiten Ordnung Glühen Geschwindigkeitskonstante (k 'Glühen) berechnet. Sie betrug 61 ± 3 nM für die S-DNA und 265 ± 48 nM für die C-DNA. Der J-Faktor der S-DNA (Abbildung 9) ist in guter Übereinstimmung mit früheren Messungen bei ähnlicher Länge 7.
Abbildung 1. Objective-Typ TIRFM. A) Anregungs-Optik. Die 532 nm-und 640 nm-Laser werden getrennt einem simil kollimiertar Durchmesser, zusammengeführt in dem gleichen Weg durch einen dichroitischen Spiegel, und konzentrierte sich auf einen winzigen elliptischen Spiegel unter dem Ziel zurück Öffnung platziert. Es ist wichtig, eine achromatische Linse zum Fokussieren der chromatischen Aberration. B) Mikroskopoptik zu minimieren. Die seitliche Position der Miniaturspiegel zu fein eingestellt, so daß sie den Laserstrahl durch das Objektiv zu reflektieren, während minimal Sperrfluoreszenzemission ist. Deshalb muss es auf einem kleinen Übersetzungsbühne montiert werden. Ein weiterer Spiegel auf der gegenüberliegenden Seite reflektiert den austretenden Laser auf seinen Eintritt in die Detektionsoptik zu vermeiden. Auf der Bildebene außerhalb des Mikroskopkörpers wird ein einstellbarer Schlitz angeordnet, um das Bild um die Hälfte der Größe des Erfassungsbereichs des CCD beschneiden. Die Fluoreszenzemission wird durch einen dichroitischen Spiegel in zwei Kanäle aufgeteilt, und die Relais-Linsen bilden das zweite Bild auf der CCD mit 1:1-Vergrößerung. Einer der reflektierenden Spiegel leicht gedreht wird, um die Donor-Offsetund Akzeptor-Bilder. Ein Bandpass-und ein Langpassfilter werden verwendet, um den Hintergrund in den Donor-und Akzeptor-Kanäle zu reduzieren sind. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 2. Temperaturregelung für Einzelmolekül-Experimente. Die Solltemperatur (T s) ist das Lesen auf dem Wasserkühler / Heizung. Die Ist-Temperatur (T a) wird durch ein Thermo Kontaktieren der oberen Oberfläche des Deckglases auf dem Mikroskop gemessen. Das Grundstück von den tatsächlichen Temperaturen gegen sechs verschiedene Solltemperaturen (schwarze Quadrate) zeigt eine hervorragende Linearität (grün gestrichelte Linie). Die Robustheit des Reglers wird durch Stichprobenmessungen zu späteren Zeitpunkten (rote Rauten) vorgenommen wird. Der Einschub ist das Bild des Temperaturkoeffizientenntrolling Einheit und das Ziel, in ihrer endgültigen Montage. Die rote Linie stellt eine Steigung der Einheit. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3. DNA-Design. A) Gebogene dsDNA. Ein 10-mer dsDNA als gekrümmte Rohrsegment und die zwei Einzelstränge als gestrichelte Linien dargestellt. Die Helixachse der jedem 10-mer DNA ist nicht vollkommen gerade, und somit jede Verkettung von derartigen 10-mer wird, um inkrementelle Neigung der Schraubenachse in die gleiche Richtung führen. Dieser Effekt kann genutzt werden, um eine ebene, superhelikalen Molekül. B) PCR-basierte Erstellung von dsDNA zu erzeugen. Einzelstrang-DNAs werden als horizontale Linie dargestellt. Ihre tatsächliche Krümmung ist hier nicht dargestellt. Das zentrale Segment in schwarz stellt die einzigartigen Teil des DNA-Fragments. Gezeigt in hellgrau sind die Adapter-Sequenzen, die für alle in dieser Studie verwendeten DNAs. Primer 1 und 4 lagern sich an den vorderen und hinteren Adapter auf. Primer 2 mit Cy3 am 5'-Ende markiert. Primer 3 hat ein Biotin-Tag am 5'-Ende und ein intern verbunden Cy5. Die hellblauen Bereiche der Primer 2 und 3 enthalten komplementären Sequenzen, die als klebrige Enden funktionieren. Entweder ein Plasmid oder genomischer DNA, die die Sequenz von Interesse enthält, wird als Matrize in zwei PCR-Reaktionen verwendet. Cy3-markierte dsDNA wird unter Verwendung von Primer 1 und 2 hergestellt, und Cy5-markierte biotinylierte DNA wird unter Verwendung von Primer 3 und 4 hergestellt. Diese zwei PCR-Produkte erhitzt werden und zusammen Strangaustausch abgekühlt. Vier verschiedene dsDNAs gebildet werden, von denen nur eine enthält Cy3, Cy5 und Biotin. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 4. Versuchsschema. A) Einzelmolekül-FRET-Experiment. dsDNA-Moleküle mit Cy3 (grün) auf einer Seite und Cy5 (rot) auf der anderen Seite gekennzeichnet sind, auf dem PEG (Polyethylenglykol)-beschichtete Oberfläche immobilisiert. Reversible Looping und unlooping von dsDNAs führen zu hohen FRET (geloopten) und niedriger FRET (geloopten)-Zuständen. B) Eine typische Einzelmolekülzeitspur von Spender (grün) und Akzeptor (rot) Fluoreszenzintensitäten. Die hohen und niedrigen FRET-Zustände werden als die geschleift und geloopten Staaten identifiziert sind. Angedeutet ist das erste Mal, dass Looping verwendet, um die Schleife zu berechnen ist. (Inset) Der Zoom-in-Bild zeigt die Anti-Korrelation der Cy3 und Cy5-Intensitäten. C) Ein Zeit Spur von FRET-Effizienz von Donor und Akzeptor Intensität berechnet Spuren in B. 4B und
5. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (29.2:0.8 Acrylamid / Bis-Acrylamid, 5% in TBE-Puffer, pH 8,0) aus synthetischen DNAs. Von links nach rechts, enthalten die Bahnen 1 kb Marker, die 186 bp-DNA und die Gerade 186 bp Gebogene DNA. Diese Zahl wird teilweise von einer früheren Publikation 12 mit Genehmigung angepasst. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
6. Repräsentative Spuren von der gekrümmten DNA (DNA-C) (A) und der entsprechenden FRET Spur (B). Vergleich der Intensität und der FRET zwischen den Spuren S-DNA (Fig. 4B und 4C) und C-DNA (6A und 6B) zeigt deutlich, dass die gekrümmte DNA häufiger als die lineare DNA in der gleichen Pufferbedingungen Schleifen. (Inset) Der Zoom-in-Bild zeigt die Anti-Korrelation der Cy3 und Cy5-Intensitäten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 7. Die mittleren erste Looping Zeiten der geraden und gekrümmten DNAs. Jede time wurde von ~ 500 Moleküle in 5 verschiedenen Feldern extrahiert. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus drei unabhängigen Experimenten berechnet. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 8. Bestimmung der Kühlrate konstant aus Oligo-Hybridisierung. A) Schematische Darstellung der Kühlrate Messung. Cy5-Primer wird auf der Oberfläche immobilisiert, und Cy3 Primer bei 50-180 nM vorliegt. Binding und unverbindlich des Cy3 Primer bei 50 nM auftreten reversibel und führen zu nachweisbaren Akzeptor-Bursts, die in dem Einsatz. B) Die Kühlrate linear von der Konzentration der freien Oligo dargestellt sind. Die Steigung der Linie stellt die zweiter Ordnung Glühen Geschwindigkeitskonstante (k 'annea l). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 9 Die J-Faktoren der geraden und gebogenen DNAs in nM berechnet Der J-Faktor wurde aus zwei Messgrößen ermittelt:... Den Looping Rate der dsDNA Schleife und der Kühlrate konstant der freien komplementäre Überhänge Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
| Komponente | Volume/50 ul Reaktions | Endkonzentration |
| 36 ul | ||
| 5x phusion Puffer | 10 ul | 1x |
| 10 mM dNTPs | 1 ul | Jeweils 200 uM |
| Vorwärts-Primer (25 uM) | 1 ul | 0,5 uM |
| Reverse-Primer (25 uM) | 1 ul | 0,5 uM |
| Phusion Hot Start DNA-Polymerase (2 U / ul) | 0,5 ul | 0,02 U / ul |
| Template DNA | 0,5 ul | ~ 1 ng |
Tabelle 1. PCR-Reaktionsmischung. Das Protokoll wird für die Phusion DNA-Polymerase optimiert. Einzelteile sollten in dieser Reihenfolge hinzugefügt werden.
| Zyklusschritt | Temperatur | Zeit | Anzahl der Zyklen |
| Initiale Denaturierung | "> 95 ° C30 Sek. | 1 | |
| Denaturierung | 95 ° C | 5 Sek. | 30 |
| Annealing | 60 ° C | 10 Sek. | |
| Erweiterung | 72 ° C | 15 sec / kb | |
| Schluss Erweiterung | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 & #176; C | halten |
Tabelle 2. PCR-Zyklus-Befehle. Die Glühtemperatur ist auf der Basis der Schmelztemperatur der Primer bestimmt. Die Verlängerung der Zeit für die Phusion DNA-Polymerase optimiert.
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Discussion
Eine einfache Einzelmolekül-FRET-Assay, der auf Looping wurde verwendet, um die Kinetik der DNA von verschiedenen Eigenformen zu studieren. Gekrümmt DNAs können durch Wiederholen eines 10-mer-Sequenz in Phase mit dem Schrauben Zeitraum von 10,5 bp, hergestellt werden, und deren Krümmungen mit PAGE abgeschätzt werden. Diese dsDNAs werden mit klebrigen Enden entwickelt, um transienten Schleife Stabilisierung ermöglichen. Es extrahiert den Schlingengeschwindigkeit von der exponentiellen Anstieg in der Anzahl der Moleküle im Laufe der Zeit eingeschleift. Die Kühlrate konstant zwischen den getrennten klebriges Ende Segmente verwendet, um die Konzentration entsprechend des Schleifenwahrscheinlichkeitsdichte, die als J-Faktor bekannt ist, zu bestimmen.
In einer Ligase-basierte DNA-Cyclisierung Assay die Messung der DNA-Verschluss Wahrscheinlichkeit empfindlich auf die Ligase-Konzentration und der J-Faktor überschätzt, wenn Ligase übermäßige 9 werden. Unspezifische Bindung von DNA-Ligase, DNA kann auch die Schleife 10. Außerdem Ligase Aktivität hängt von Salz und zerfällt im Laufe der Zeit. So ist es schwierig, DNA-Looping in suboptimalen Bedingungen für Ligase-Aktivität zu untersuchen. Im Gegensatz dazu ist ein FRET-Looping-Test frei von all diesen Sorgen.
Unsere experimentellen Protokoll ist ähnlich der von Vafabakhsh Ha und 13 bis auf zwei wichtige Aspekte, die diskussionswürdig sind. Vafabakhsh und Ha 13 konstruiert ihre dsDNA-Moleküle durch Ligation mehrere synthetische Oligonukleotide. Obwohl die Fehler (Insertion, Deletion oder Substitution) Rate pro Nukleotid in Oligo-Synthese ist vernachlässigbar (f 0,181%) 23, der Anteil des unbeabsichtigten DNA-Sequenzen linear mit Oligo Länge. Daher kann ein 100-bp-Duplex-Probe von diesem Protokoll hergestellt bis zu ~ 33% unvollkommenen Doppelstränge, die in höheren Schleifenrate 24 führen kann, enthalten. Im Vergleich dazu nutzt unser Protokoll der Polymerasekettenreaktion (PCR), um die dsDNA-Moleküle, die eine viel höhere Genauigkeit als DNA CHE synthetisierenmosynthesis 25. Nach Angaben des Herstellers, würde die High-Fidelity-Polymerase verwendeten wir eine richtige 100-bp-DNA-Molekül an 99,8% Wahrscheinlichkeit erzeugt nach 30 Zyklen der PCR-Amplifikation.
Ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen den beiden Untersuchungen ist die Oberfläche Immobilisierung Schema. In unserer Studie werden DNA-Moleküle an der Oberfläche durch ihre Enden befestigt ist, während in dem Protokoll, das von Vafabakhsh und Ha 13, sie durch eine innere Basis angebracht sind. Es wurde vorhergesagt, dass auf der Grundlage der Begrenzungseffekt allein, ein intern gemerkt dsDNA Schleife häufiger als eine freie dsDNA, bis zu einem Faktor von fünf je nach Lage der inneren Pinning 26. Deshalb, wenn die Messung der J-Faktor als Funktion der DNA-Konturlänge, interne Pinning unerwartete Variabilität einzuführen. Es ist auch möglich, dass die modifizierte Base mit der Linker eine schwächere Basenpaarungsfähigkeit, was zu einer höheren Schlingengeschwindigkeit führen kann. Allerdings despite diese offensichtlichen Unterschiede, die beiden Protokolle erzeugen ähnliche J Faktoren bei 100 bp (~ 3 nM vs ~ 2 nM).
Das FRET-Assay-Looping hält Versprechen für das Studium eine breite Palette von Phänomenen zu dsDNA Looping einschließlich der Auswirkungen von Fehlpaarungen, Kerben oder Lücken auf dsDNA Looping 27, die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf dsDNA Looping, und Temperaturabhängigkeit der dsDNA Flexibilität zusammen. Diese Themen wäre schwierig, mit dem herkömmlichen Ligase-basierte Cyclisierung zu adressieren. Die FRET-Schleife-Assay kann auch verwendet werden, um die J-Faktor gegen die Konturlänge, dem Standardverhältnis von Polymer Modelle zu testen ist zu messen. Allerdings ist die hier vorgestellte Protokoll wir nicht auf das Studium Looping von dsDNA kürzer als 100 bp gut geeignet. Unterhalb dieser Länge wird dsDNA Schleifen extrem langsam, und somit die gemessene Geschwindigkeit wird durch andere unbeabsichtigte Prozesse wie Bleichen beeinträchtigt. Man kann die scheinbare Schleifen Kinetik von uns beschleunigenten hohe Salzkonzentration ([Na +]> 500 mM), aber physiologische Relevanz einer solchen Messung wird fragwürdig. Daher wird die Untersuchung von dsDNA Biegen an Längenskalen unter 100 bp von einem Ansatz orthogonal zur Cyclisierung-basierte Assays profitieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken James Waters, Gable Wadsworth und Bo Broadwater für das Manuskript kritisch zu lesen. Wir danken auch vier anonymen Gutachtern für die Bereitstellung von nützlichen Kommentare. Wir danken für die finanzielle Unterstützung von Georgia Institute of Technology, der Burroughs Wellcome Fund Career Award in der Scientific-Schnittstelle, und dem Studenten-Forschungsnetzwerk Zuschuss von NSF Physik lebender Systeme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
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