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Biology

एकल अणु झल्लाहट द्वारा डीएनए पाशन पढ़ रही है

Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51667
Automatic Translation
1, 1
1School of Physics, Georgia Institute of Technology

Summary

इस अध्ययन के एकल अणु प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का उपयोग डबल असहाय डीएनए के पाशन गतिशीलता को मापने के लिए एक विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रिया को प्रस्तुत करता है. प्रोटोकॉल भी जम्मू कारक बुलाया पाशन प्रायिकता घनत्व निकालने के लिए कैसे करें.

Abstract

डबल असहाय डीएनए (dsDNA) के झुकने ऐसे डीएनए प्रोटीन मान्यता और nucleosomes में डीएनए की पैकेजिंग के रूप में कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं के साथ जुड़ा हुआ है. DsDNA झुकने की ऊष्मा covalently एक dsDNA से कम चिपचिपा सिरों में शामिल होने के लिए डीएनए ligase पर निर्भर करता है जो एक विधि कहा जाता चक्रगति द्वारा अध्ययन किया गया है. हालांकि, बंधाव दक्षता डीएनए में शामिल हो गए चिपचिपा सिरों आसपास संरचना, और ligase के रूप में पाशन dsDNA से संबंधित नहीं हैं कि कई कारकों से प्रभावित किया जा सकता है भी ऐसी अविशिष्ट बंधन के रूप में तंत्र के माध्यम से स्पष्ट पाशन दर को प्रभावित कर सकते हैं. यहाँ, हम झल्लाहट (प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण) द्वारा क्षणिक डीएनए पाश गठन पता लगाने के द्वारा ligase बिना dsDNA पाशन कैनेटीक्स को मापने के लिए कैसे दिखा. dsDNA अणुओं एक झल्लाहट जोड़ी और एक बायोटिन linker के साथ एक सरल पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग कर निर्माण कर रहे हैं. जम्मू कारक के रूप में जाना जाता पाशन प्रायिकता घनत्व दो disconnec के बीच पाशन दर और annealing दर से निकाला जाता हैटेड चिपचिपा समाप्त होता है. विभिन्न आंतरिक curvatures के साथ दो dsDNAs परीक्षण करके, हम जम्मू कारक dsDNA की आंतरिक आकृति के प्रति संवेदनशील है कि दिखा.

Introduction

DsDNA के यांत्रिक गुणों को समझना बुनियादी विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में बुनियादी महत्व की है. लगातार बेस जोड़े के बीच रोल, झुकाव, और मोड़ कोण दृश्य के साथ भिन्न हो सकते हैं क्योंकि dsDNA की संरचना एक सीधे पेचदार सीढ़ी से अधिक जटिल है. थर्मल उतार चढ़ाव dsDNA इस तरह, झुकने घुमा और खींच के रूप में गठनात्मक उतार चढ़ाव के विभिन्न साधनों से गुजरना करने के लिए पैदा कर सकता है. इस तरह के पिघलने और kinking के रूप में संक्रमण भी चरम स्थितियों में हो सकता है.

इन प्रस्तावों के अलावा, dsDNA झुकने सबसे महत्त्वपूर्ण जैविक प्रभाव 1 है. dsDNA झुकने एक दूसरे के करीब दो दूर के स्थानों लाकर जीन दमन या सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ है. यह भी डीएनए सेल नाभिक के अंदर पैकेजिंग या एक वायरल capsid में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. DsDNA के झुकने विरूपण उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी (AFM 2 और मंदिर 3), और thermodyn प्रयोगात्मक द्वारा देखे जा सकते हैंamics और कैनेटीक्स रासायनिक dsDNA की Juxtaposed साइटों से लिंक जो पाशन assays, द्वारा अध्ययन किया जा सकता है.

ऐसा ही एक परख ligase निर्भर चक्रगति 4 है. इस परख में, 'चिपचिपा (एकजुट) के साथ समाप्त होता dsDNA अणुओं circularized रहे हैं या डीएनए ligase द्वारा dimerized. चक्र और डिमर गठन की दरों की तुलना करके, एक जम्मू कारक के रूप में जाना जाता है, जो दूसरे छोर के आसपास के क्षेत्र में डीएनए के एक छोर से एक प्रभावी दाढ़ एकाग्रता प्राप्त कर सकते हैं. यह जम्मू कारक दूसरे छोर से कुछ ही दूरी पर डीएनए के एक छोर पाने की संभावना घनत्व के लिए dimensionally बराबर है और इस प्रकार डीएनए के लचीलेपन को दर्शाता है. डीएनए की लंबाई के एक समारोह के रूप में जम्मू कारक मापने हठ लंबाई 4,5 सहित डीएनए यांत्रिकी के बारे में कई विशेषताओं का पता चलता है.

कीड़ा की तरह श्रृंखला (WLC) मॉडल व्यापक रूप से expla में अपनी सफलता के आधार पर dsDNA यांत्रिकी के लिए विहित बहुलक मॉडल के रूप में माना गया हैडीएनए प्रयोगों 6 खींच रहा है और सही ढंग से लंबे समय तक 200 बी पी 7 से dsDNAs की जम्मू कारकों की भविष्यवाणी में प्राप्त बल विस्तार से घटता ining. हालांकि, 100 बीपी के रूप में के रूप में कम dsDNA अणुओं पर चक्रगति परख का उपयोग, Cloutier और Widom WLC मॉडल भविष्यवाणी 8 से अधिक परिमाण के कई आदेशों होने के लिए जम्मू कारकों मापा. एक साल बाद, दू एट अल. ligase की कम सांद्रता के साथ चक्रगति परख का उपयोग WLC मॉडल के साथ समझौते में जम्मू कारकों का उत्पादन और Widom समूह से 9 इस्तेमाल किया उच्च ligase सांद्रता के लिए विषम परिणाम जिम्मेदार ठहराया. पारंपरिक परख 9 का उपयोग करते समय यह विवाद चक्रगति कैनेटीक्स पर डीएनए ligase की अपरिहार्य प्रभाव एक मिसाल है. इसके अलावा, डीएनए ligase भी अविशिष्ट बाध्यकारी 10,11 के माध्यम से डीएनए संरचना और कठोरता को प्रभावित कर सकते हैं.

प्रोटीन पर निर्भर पाशन assays के तकनीकी चिंताओं को खत्म करने के लिए हमने हाल ही में एक prot का प्रदर्शनप्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) 12 के आधार पर Ein मुक्त पाशन परख. इस विधि में, looped रचना एक डीएनए अणु का चिपचिपा सिरों के पास जुड़ी दाता और स्वीकर्ता के बीच झल्लाहट से पता चला रहे हैं. एक उद्देश्य प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TIRFM) प्रतिवर्ती पाशन और समय की एक लम्बी अवधि के लिए सतह से स्थिर एकल डीएनए अणु से unlooping घटनाओं के trajectories रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस विधि Vafabakhsh और हा 13 से एक समान विधि पर एक महत्वपूर्ण सुधार है जो बेमेल मुक्त डीएनए अणु, उत्पन्न करने के लिए डीएनए अणु की पीसीआर आधारित विधानसभा सुविधाएँ. इस प्रोटोकॉल के एकल अणु पहलू झल्लाहट पहलू भी ligase गतिविधि क्षीण कर सकते हैं कि स्थितियों में, एक ही अणु से बार बार डीएनए पाशन गतिशीलता को मापने के लिए अनुमति देता है, जबकि इसके अलावा में वितरण के माप मूविंग कलाकारों की टुकड़ी को अनुमति देता है.

TIRFM सेटअप चित्र 1 में दिखाया गया है. एक कस्टमसे डिजाइन नमूना चरण एक ओलिंप IX61 माइक्रोस्कोप शरीर पर रखा गया है. 532 एनएम और 640 एनएम लेज़रों ओर से पेश कर रहे हैं और coverslip पानी इंटरफेस में घटना का महत्वपूर्ण कोण को प्राप्त करने के लिए उच्च NA उद्देश्य में छोटे अंडाकार दर्पण 14 से परिलक्षित होते हैं. हम और अधिक व्यापक dichroic दर्पण या चश्मे आधारित TIR setups का उपयोग कर के माध्यम से उद्देश्य TIR भी इस झल्लाहट आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दें. माइक्रोस्कोप द्वारा गठित प्रतिदीप्ति छवि एक dichroic दर्पण से दाता और स्वीकर्ता छवियों में विभाजित है. वे तो एक EMCCD के दो हिस्सों पर फिर से imaged हैं. अतिरिक्त लंबे पास उत्सर्जन फिल्टर पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है.

तापमान नियंत्रण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गतिज डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. तापमान नियंत्रण के लिए, उद्देश्य एक तापमान नियंत्रित चिलर / हीटर से गर्मी हस्तांतरण, और पानी को कम करने के लिए माइक्रोस्कोप शरीर की nosepiece से अलग है कि कसकर फिट बैठता है एक पीतल कॉलर के माध्यम से वितरित किया जाता हैउद्देश्य जैकेट के नीचे आंतरिक धातु के आसपास. इस सेटअप 15 और 50 डिग्री सेल्सियस के बीच coverslip सतह (चित्रा 2) में मजबूत तापमान नियंत्रण हासिल करने में सक्षम है. इस काम में, नमूना तापमान 24 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था

निम्नलिखित प्रोटोकॉल डीएनए निर्माण, डीएनए आकार के आकलन, एकल अणु प्रयोग, और जम्मू कारक निर्धारण के लिए कदम दर कदम प्रक्रिया प्रस्तुत करता है.

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Protocol

1. DsDNA नमूना तैयार

  1. एक 10 मेर अनुक्रम दोहरा द्वारा विश्व स्तर पर घुमावदार DNAs डिजाइन. उदाहरण के लिए, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC एक्स) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG -3 'एक 186-BP घुमावदार एक्स एक यादृच्छिक अतिरिक्त आधार है जहां डीएनए और दोहरा 10 पूर्व अनुक्रम flanking अनुक्रम अनुकूलक दृश्यों रहे है.
    नोट:. इस उदाहरण में कापलान एट अल द्वारा एक बड़े पैमाने पर nucleosome अधिभोग अध्ययन पर आधारित nucleosome गठन के विपरीत वरीयताओं के साथ दो 10 mers 15 चुने गए हैं. DsDNA के पेचदार दोहराने 10 बीपी के करीब है के बाद से, 10 पूर्व के पेचदार धुरी के किसी भी शुद्ध विक्षेपन एक परिपत्र चाप (चित्रा 3) जैसे आकार का उत्पादन करने के लिए जमा करेंगे. पेचदार अवधि 10.5 बीपी के करीब है, एक अतिरिक्त आधार संभव के रूप में तलीय के रूप में घुमावदार संरचना रखने के लिए हर दो दोहराता के बाद डाला जाता है. 200 बीपी से कम इन दृश्यों companie से आदेश दिया जा सकताउस प्रस्ताव जीन संश्लेषण सेवा. यह बाद के चरणों के लिए आम एडाप्टर दृश्यों के साथ इन दृश्यों पार्श्व के लिए सुविधाजनक है. प्रक्रिया चित्रा 3 बी में schematized है.
  2. प्राइमर 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) और प्राइमर 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG) के साथ पीसीआर प्रदर्शन करना. नोट: प्राइमर 2 5 'अंत में झल्लाहट दाता Cy3 के साथ लेबल है. एक ठेठ पीसीआर नुस्खा और साइकिल चालन प्रोटोकॉल टेबल्स 1 और 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं.
  3. प्राइमर 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) और प्राइमर 4 (CAACAACGAGCTCGAATG) के साथ पीसीआर प्रदर्शन करना. नोट: प्राइमर 3 5 'अंत में रीढ़ की हड्डी और बायोटिन linker के माध्यम से झल्लाहट स्वीकर्ता Cy5 के साथ लेबल है. पीसीआर नुस्खा और साइकिल चालन प्रोटोकॉल के रूप में ऊपर हैं.
  4. एक पीसीआर सफाई किट का उपयोग पीसीआर उत्पादों शुद्ध.
  5. 0.4 & की अंतिम सांद्रता में कतरा आदान प्रदान के लिए एक बफर (100 मिमी NaCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.0, 1 मिमी EDTA) में Cy3 लेबल उत्पाद और Cy5 लेबल उत्पाद मिश्रण# 181; क्रमशः एम और 0.1 माइक्रोन,. नोट: अतिरिक्त Cy3 डीएनए किनारा मुद्रा का एक परिणाम के रूप में Cy3 और Cy5 दोनों को ले जाने डुप्लेक्स की एकाग्रता बढ़ जाती है.
  6. 2 मिनट के लिए 98.5 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा विनिमय किस्में, धीरे - धीरे 5 को ठंडा डिग्री सेल्सियस से 0.1 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की रैंप दर के साथ, और 5 में incubating   2 घंटे के लिए सी °.

2. जेल वैद्युतकणसंचलन dsDNA वक्रता का पता लगाने के लिए

  1. 29.2:0.8 अनुपात में acrylamide और बीआईएस acrylamide समाधान के मिश्रण से polyacrylamide जेल 16,17 डालो, 5% (w / v) 8.0 पीएच पर 1x Tris / Borate / EDTA (TBE) बफर में. नोट: जेल समाधान के 10 एमएल शामिल: 1.217 मिलीग्राम 40% acrylamide, 0.667 मिलीग्राम 2% बीआईएस acrylamide, 1 मिलीलीटर TBE 10X, 100 एल अमोनियम persulfate (ए पी एस) 10%, 10 एल TEMED, और बाकी DH 2 ओ है जेल की पूर्ण solidification बारे में 30 मिनट लगते हैं.
  2. डीएनए के नमूने और 1X लोड हो रहा है बफर में डीएनए सीढ़ी (5% ग्लिसरॉल, 0.03% (w / v) bromophenol बीएल साथ polyacrylamide जेल लोड करेंUE) और 5-8 पर जेल चलाने के 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या डाई सामने तक वी / सेमी जेल के अंत दृष्टिकोण.
  3. 30 मिनट के लिए 0.5 ग्राम / मिलीलीटर ethidium ब्रोमाइड होता है कि 1X TBE बफर का उपयोग कर जेल दाग. यूवी रोशनी के तहत डीएनए बैंड को पहचानें. डीएनए अणु के स्पष्ट आकार की गणना करने के लिए आकार मार्कर (100 बीपी डीएनए सीढ़ी) के साथ बैंड पदों की तुलना करें. नोट: घुमावदार DNAs आम तौर पर सीधे DNAs की तुलना में धीमी चाल है.

3. सेल तैयार प्रवाह

  1. एक ड्रिल प्रेस और हीरे की ड्रिल बिट का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड के दो विपरीत किनारों (3'' एक्स 1'') के साथ छेद में से 6-7 जोड़े ड्रिल. ड्रिलिंग के बाद दिखाई कांच पाउडर निकालने के लिए पानी में बहने स्लाइड रगड़ें. नोट: छेद छिड़काव inlets और दुकानों के रूप में सेवा करते हैं. ड्रिलिंग के दौरान पानी के साथ स्लाइड ठंडा खुर को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. एक ग्लास जार में ईमानदार स्लाइड प्लेस और पानी से भरना. 15 मिनट के लिए Sonicate और अन्य ग्लास जार डे में उन्हें स्थानांतरणएसीटोन सफाई के लिए dicated. 15 मिनट के लिए एसीटोन और sonicate के साथ भरें. फिर एक स्प्रे बोतल और पानी के साथ प्रयोग इथेनॉल के साथ स्लाइड कुल्ला. एक polypropylene जार में रखें, 5 मीटर पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड के साथ भरने, और sonicate 15 मिनट के लिए. अंत में, 15 मिनट के लिए पानी में स्लाइड्स sonicate. एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग coverslips (संख्या 1, 24 x 40 मिमी) साफ करें. नोट: साफ स्लाइड और coverslips लंबे समय तक इस्तेमाल के लिए DH 2 हे में संग्रहित किया जा सकता है.
  3. 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के 340 एल में एमपीईजी-silane के 80 मिलीग्राम (मेगावाट 2000) के साथ बायोटिन खूंटी silane के 1 मिलीग्राम (मेगावाट 3400) मिलाएं. अच्छी तरह मिक्स और बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए संक्षिप्त मिश्रण अपकेंद्रित्र. नोट: polyethylene glycol (खूंटी) के साथ सतह की functionalization सतह के लिए डीएनए की अविशिष्ट बंधन को कम मदद मिलती है.
  4. प्रत्येक स्लाइड पर खूंटी समाधान की 80 एल रखो और धीरे से एक coverslip कम है. 45 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. , चिमटी के साथ स्लाइड से coverslip को अलग DH 2 हे की प्रचुर मात्रा के साथ उन्हें कुल्ला और दो ​​टीखुली हवा में हेम शुष्क.
  5. चैनलों के लिए फार्म स्लाइड भर में डबल स्टिक टेप की पतली स्ट्रिप्स रखें. इस पर एक coverslip संरेखित और मजबूती से तरल तंग चैनलों के लिए फार्म स्लाइड के खिलाफ coverslip दबाएँ. चैनल के किनारों को सील करने के लिए 5 मिनट epoxy का प्रयोग करें.

Trolox समाधान के 4. तैयारी

  1. एक कुप्पी में ~ 30 मिलीग्राम Trolox और 10 मिलीलीटर DH 2 हे रखो और 18 घंटे के लिए खुली हवा में समाधान हलचल करने के लिए एक चुंबक हलचल पट्टी का उपयोग करें.
  2. एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर और 1 एम Tris आधार (पीएच 11) की ~ 6 μl जोड़कर 7 पीएच को समायोजित करें. नोट: Trolox आमतौर पर 18 अध्ययन एकल अणु में प्रयोग किया जाता है जो एक विरोधी निमिष अभिकर्मक है. Trolox की antifading कार्रवाई आंशिक रूप से अपमानित Trolox समाधान 19 में मौजूद है जो अपने ऑक्सीकरण व्युत्पन्न से आता है. जल्दी से मेथनॉल या उच्च पीएच Tris समाधान में Trolox भंग क्योंकि अक्षम ऑक्सीकरण से बचा जाना चाहिए.

5. एकल मोलecule इमेजिंग

  1. चैनल में NeutrAvidin समाधान (0.5 मिलीग्राम / एमएल) की 15 μl इंजेक्षन और T50 बफर के 100 μl (10 मिमी Tris-एचसीएल, 50 मिमी NaCl, 7.0 पीएच) के साथ rinsing से पहले 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
  2. चैनल में डीएनए नमूना (50-100 PM) का 50 μl इंजेक्षन. 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और T50 बफर के 100 एल के साथ दूर अनबाउंड डीएनए कुल्ला. नोट: डीएनए अणु विशेष रूप से NeutrAvidin बायोटिन बातचीत के माध्यम से सतह के लिए बाध्य होगा.
  3. एक ऑक्सीजन सफाई प्रणाली 20 (100 मिमी PCD, 5 मिमी पीसीए, 1 मिमी Trolox, और 500 मिमी NaCl) है जिसमें इमेजिंग बफर के साथ चैनल भरें.
  4. प्रति सेकंड 25 तख्ते पर कंप्यूटर के लिए 2 एक्स 2 binned छवियों (256 X 256) स्ट्रीम करने के लिए फ्रेम स्थानान्तरण मोड में EMCCD सेट करें.
  5. खुर्दबीन उद्देश्य पर विसर्जन तेल डाल कर, और नमूना क्लिप का उपयोग कर खुर्दबीन मंच पर प्रवाह सेल को ठीक. दीवार पर लेजर प्रतिबिंब पैटर्न को देखकर फोकस मोटे समायोजित करें. प्रतिदीप्ति आईएम के लाइव दृश्य का उपयोग फोकस ठीक से समायोजितमॉनिटर पर उम्र.
  6. पर 532 एनएम लेजर के साथ डाटा अधिग्रहण शुरू करो. लाइव देखें जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो ध्यान समायोजित. सबसे अणुओं photobleached है जब डाटा अधिग्रहण बंद करो.
    नोट: इस सुविधा में, माइक्रोस्कोप नियंत्रित और वे हार्ड डिस्क पर सेव किया गया के रूप में की निगरानी पर रहते छवियों को प्रदर्शित करने के लिए एक प्रयोगशाला से लिखा सी कार्यक्रम का इस्तेमाल किया जाता है.

6. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

नोट: 256 x 256 छवियों का एक समय श्रृंखला Cy3 और Cy5 तीव्रता के एकल अणु समय निशान उत्पन्न करने के लिए एक MATLAB कोड द्वारा कार्रवाई की जाती है. दाता चैनल और विभाजन दृश्य छवि के स्वीकर्ता चैनल के बीच पिक्सल युग्मित करने के लिए, Cy3 और Cy5 स्थलों में से 6-7 जोड़े, समान रूप से देखने के क्षेत्र भर में बिखरे एक ही अणु से प्रत्येक जोड़ी, मैन्युअल रूप से एक affine परिवर्तन उठाया, और कर रहे हैं लंगर अंक के रूप में इन स्थानों के निर्देशांक का उपयोग कर की गणना है.

  1. एक Matlab स्क्रिप्ट का उपयोग करना, सभी एकल अणु समय के माध्यम से देखने के लिए टी निशाननिम्न और उच्च झल्लाहट संकेतों के बीच टोपी शो कई बदलाव. Looped और unlooped राज्यों की पहचान.
    नोट: झल्लाहट संकेत Cy5 तीव्रता के रूप में परिभाषित किया गया है (मैं एक) Cy3 और Cy5 तीव्रता का योग (मैं डी मैं एक +) से विभाजित. Unlooped राज्य कम झल्लाहट मूल्य है, जबकि looped राज्य उच्च झल्लाहट मूल्य है. एक अणु से झल्लाहट संकेतों के हिस्टोग्राम bimodally क्योंकि प्रतिवर्ती पाशन और unlooping का वितरित किया जाता है.
  2. दो फिट गाऊसी घटता बीच चौराहे के निर्धारण से दो वितरण कहना है कि अलग सीमा का पता लगाएं.
  3. झल्लाहट दक्षता के रूप में की गणना और उच्च झल्लाहट मूल्यों और कम झल्लाहट मूल्यों के साथ unlooped राज्यों के साथ looped राज्यों आवंटित.
  4. एक Matlab स्क्रिप्ट का प्रयोग, अणुओं (एन (टी)) की संचयी संख्या का विश्लेषण है कि looped (याडाटा अधिग्रहण की शुरुआत के बाद से अलग अलग समय खामियों पर उच्च झल्लाहट राज्य) पर पहुंच गया. नोट: एक dsDNA अणु डाटा अधिग्रहण के शुरू में unlooped राज्य के किसी भी रचना में शुरू कर सकते हैं, looped जनसंख्या में वृद्धि की दर का मतलब पाशन दर प्रारंभिक रचना पर औसतन दर्शाता है. एक घातीय समारोह के साथ एन (टी) फिटिंग द्वारा पाशन दर कश्मीर पाश निकालें: Biphasically बढ़ जाती है, तो यह एक डबल घातीय समारोह के साथ फिट किया जा सकता है: इस मामले में, कश्मीर पाश से प्राप्त होता है: नोट: सिद्धांततः, एक बहुलक समय टी में looped नहीं किया गया है कि जीवित रहने की संभावना एक या दो घातीय समारोह 12 नहीं है. घातीय FITTआईएनजी औसत पाशन समय निकालने के लिए एक व्यावहारिक साधन के रूप में प्रयोग किया जाता है.

7. जम्मू निर्धारण कारक

नोट: जम्मू कारक एक dsDNA के एक छोर दूसरे छोर के आसपास है कैसे केंद्रित का प्रतिनिधित्व करता है. यह मापा पाशन दर के रूप में दूसरे छोर खंड के साथ ही प्रतिक्रिया दर का उत्पादन होगा कि डीएनए के एक छोर खंड की एकाग्रता interpolating द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. प्रयोगात्मक, एक छोर खंड सतह पर स्थिर है, और दूसरे छोर खंड एक निश्चित एकाग्रता सेल्सियस पर शुरू की है. दो सिरों के बीच मापा annealing दर K पानी रखना है, तो जम्मू कारक 21 द्वारा दिया जाता है . annealing दर लगातार (कश्मीर पानी रखना = K पानी रखना / सी) जांच एकाग्रता से स्वतंत्र है.

  1. 30-50 बजे बायोटिन Cy5 oligo के 20 μl (प्राइमर 3) प्रवाह मैंएक NeutrAvidin में लिपटे चैनल Nto. अनबाउंड oligos दूर धोने के लिए 100 μl T50 साथ चैनल कुल्ला.
  2. 50 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता में Cy3 oligo (प्राइमर 2) के अलावा के साथ भाग 5 में वर्णित के रूप में इमेजिंग बफर तैयार करें. चैनल में इस इमेजिंग बफर प्रवाह.
  3. पर 532 एनएम लेजर रखते हुए, संक्षेप में सतह बाध्य Cy5 oligos के स्थानों की पहचान करने पर 640 एनएम लेजर बारी. 640 एनएम लेजर बंद करें और झल्लाहट संकेत निगरानी शुरू करते हैं.
    नोट: एक सतह बाध्य Cy5 oligo के लिए एक Cy3 oligo के संकरण करने पर, Cy5 प्रतिदीप्ति झल्लाहट से पैदा होगा.
  4. एक Matlab स्क्रिप्ट का प्रयोग, अबाध राज्य (कम Cy5 तीव्रता) में शुरू किया लेकिन बाद में Cy5 तीव्रता निशान से समय के एक समारोह के रूप में annealed राज्य (उच्च Cy5 तीव्रता) में बदल जाते हैं जो अणुओं की संख्या का विश्लेषण.
  5. Annealed अणुओं बनाम समय की इस संख्या में प्लॉट. एक एकल घातीय समारोह (साथ इस वक्र फिट (K पानी रखना) प्राप्त करने के लिए.
  6. Annealing दर reactant और एकाग्रता के बीच linearity पुष्टि करने के लिए अलग Cy3 oligo सांद्रता (60, 100, और 180 एनएम) में इस प्रयोग को दोहराएँ. दूसरे क्रम annealing दर लगातार (कश्मीर पानी रखना निकालें ) ढलान से.
  7. जम्मू कारक से गणना , कश्मीर पाश ही बफर हालत में मापा पाशन दर है.

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Representative Results

पाशन अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया डीएनए अणु चर अनुक्रम और लंबाई और एक दूसरे के पूरक हैं कि एकल असहाय overhangs के एक डुप्लेक्स क्षेत्र से मिलकर. 7 आधार लंबे होते हैं जो overhangs, looped राज्य पर कब्जा करने के लिए एक दूसरे को पानी रखना कर सकते हैं. प्रत्येक अधिकता amidite रसायन शास्त्र के माध्यम से डीएनए रीढ़ की हड्डी में जुड़ा हुआ है कि Cy3 या Cy5 या तो होता है. Cy5 की अधिकता भी सतह स्थिरीकरण (चित्रा -4 ए देखें) के लिए बायोटिन तेग (15 परमाणु टेट्रा ईथीलीन Glycol स्पेसर) के साथ जुड़ा हुआ है. इन सभी संशोधनों पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल 1 और चित्रा 3 बी) निम्नलिखित dsDNA में शामिल किया जा सकता है. overhangs के लिए चुना लंबाई और अनुक्रम सामान्य प्रयोगात्मक शर्तों में detectable और प्रतिवर्ती झल्लाहट घटनाओं का उत्पादन करने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं. पाशन और डीएनए पाश की unlooping कैनेटीक्स आसपास के तापमान के प्रति संवेदनशील हैं, और इसलिए, एक तापमान नियंत्रक reproducibility के लिए आवश्यक है. इस तरह के एक विवादller आसानी माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) में शामिल किया जा सकता है.

TIRFM का प्रयोग, Cy3 (दाता) और Cy5 सतह immobilized dsDNA अणुओं से (स्वीकर्ता) संकेतों मनाया गया (चित्रा 4 बी) के उतार चढ़ाव विरोधी सहसंबद्ध. Looped राज्य में, दो रंगों के बीच की दूरी की वजह से उच्च झल्लाहट दक्षता (आंकड़े 4A और 4C) के लिए उच्च Cy5 संकेत और कम Cy3 संकेत नतीजा होगा, जो 5nm से छोटी है. कई नियंत्रण प्रयोगों उच्च झल्लाहट राज्य looped राज्य का प्रतिनिधित्व करने वाली साबित करने के लिए प्रदर्शन किया गया. उच्च झल्लाहट राज्य के जीवनकाल उच्च झल्लाहट राज्य दो overhangs के बीच आधार बाँधना द्वारा स्थिर है कि जो पता चलता है, बढ़ती अधिकता लंबाई के साथ वृद्धि हुई है. उच्च झल्लाहट राज्य का जीवनकाल भी पाश के रूप में पाश मुक्त ऊर्जा बढ़ जाती है 12 छोटा हो जाता है क्योंकि उम्मीद है जो डीएनए लंबाई, कम से कम किया है. इस सबूत, उच्च और निम्न झल्लाहट स्टेशन के आधार परtes क्रमशः, looped और unlooped राज्यों को सौंपा जा सकता है.

पाशन पर dsDNA की आंतरिक वक्रता के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, विभिन्न curvatures के साथ दो 186 बीपी dsDNAs 'सीधे' (एस डीएनए) नाम दिया जाता है, जो निर्माण किया गया और उनकी वक्रता पर आधारित 'घुमावदार' (सी डीएनए). दोहरा 10 पूर्व अनुक्रम एस डीएनए के लिए C-डीएनए और TGACAGCAAC के लिए TTTATCATCC है. इन dsDNAs में से प्रत्येक के समग्र वक्रता पृष्ठ dsDNA वक्रता 16,22 अनुमान लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है जो (polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन), द्वारा जाँच की थी. 5 चित्रा एस डीएनए एक ही आकार के डीएनए को इसी से चलता है कि पता चलता है डीएनए सीढ़ी में (लेन 1 और चित्रा 5 में 2 लेन की तुलना). दूसरी ओर, सी डीएनए डीएनए सीढ़ी में अपने समकक्ष की तुलना में एक बड़ा स्पष्ट आकार से पता चलता है (~ अपने वास्तविक आकार से बड़ा 1.2, लेन 1 और 3 लेन देखें). इस अवलोकन सी डीएनए एक बड़ा आंतरिक घन पास इंगित करता है किएस डीएनए से rvature.

चित्रा 6 सी डीएनए (चित्रा 6A) और इसी झल्लाहट ट्रेस (चित्रा 6B) से एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति समय का पता लगाने से पता चलता है. एस डीएनए (आंकड़े 4B और 4C) की तुलना में, सी डीएनए समय की इसी अवधि के दौरान और अधिक उच्च झल्लाहट घटनाओं का उत्पादन; सी डीएनए एक ही अधिग्रहण के समय के दौरान एस डीएनए (चित्रा 7) से अधिक बार 4 बार छोरों. इस परिणाम डीएनए के आंतरिक वक्रता काफी गतिशीलता पाशन प्रभावित कर सकते हैं दर्शाता है.

पाशन दर से जम्मू कारक निकालने के लिए, एक दो काट दिया overhangs के बीच संकरण के लिए एकाग्रता स्वतंत्र दूसरे क्रम की दर लगातार उपाय करने की जरूरत है. इस तरह के माप का एक अहसास चित्रा 8A में दिखाया गया है. Immobilized Cy5 oligo को Cy3 oligo के संकरण झल्लाहट कारण Cy5 तीव्रता फटने पैदा करता है. कई विदेश मंत्रालय सेविभिन्न Cy3-oligo सांद्रता के साथ surements (चित्रा 8B देखें), एक एक सांख्यिकीय मजबूत तरीके से निकाल सकते हैं. हमारे प्रयोग में, 500 मिमी NaCl में दो oligos के बीच annealing दर लगातार 0.45 ± 0.04 x 10 6 एम -1 सेकंड -1 होने के लिए निर्धारित किया गया था. जम्मू कारक दूसरे क्रम annealing दर लगातार (कश्मीर 'पानी रखना) द्वारा पाशन दर (कश्मीर लूप) को विभाजित करके गणना की गई. यह सी डीएनए के लिए एस डीएनए और 265 ± 48 एनएम के लिए 61 ± 3 एनएम था. एस डीएनए (9 चित्रा) की जम्मू कारक समान लंबाई 7 में पिछले माप के साथ निष्पक्ष समझौते में है.

चित्रा 1

चित्रा 1. उद्देश्य प्रकार TIRFM. ए) उत्तेजना प्रकाशिकी. 532 एनएम और 640 एनएम लेज़रों एक simil के लिए अलग से collimated रहे हैंएआर व्यास, एक dichroic दर्पण से एक ही रास्ते में मिला दिया, और उद्देश्य वापस एपर्चर के नीचे रखा एक छोटे अंडाकार दर्पण पर जोर दिया. यह रंगीन विपथन. बी) माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी कम करने के लिए ध्यान केंद्रित के लिए एक अवर्णी लेंस का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. लघु दर्पण के पार्श्व स्थिति न्यूनतम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को अवरुद्ध करते हुए यह उद्देश्य के माध्यम से लेजर बीम को प्रतिबिंबित कर सकते हैं कि बहुत पतले समायोजित किया जाना है. इसलिए, यह एक छोटा सा अनुवाद मंच पर मुहिम शुरू की जानी चाहिए. विपरीत दिशा में एक और दर्पण का पता लगाने प्रकाशिकी में प्रवेश करने से रोकने के लिए बाहर जाने वाले लेजर को दर्शाता है. माइक्रोस्कोप शरीर के बाहर छवि विमान में एक समायोज्य भट्ठा सीसीडी का पता लगाने के क्षेत्र के आधे आकार के लिए छवि फसल के लिए रखा गया है. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दो चैनलों में एक dichroic दर्पण द्वारा विभाजित है, और रिले लेंस 01:01 बढ़ाई साथ सीसीडी पर दूसरी छवि रूप है. दर्शाती दर्पण का एक थोड़ा दाता ऑफसेट करने के लिए घुमाया जा रहा हैऔर स्वीकर्ता छवियों. एक bandpass और एक longpass फिल्टर क्रमशः, दाता और स्वीकर्ता चैनलों में पृष्ठभूमि को कम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
एकल अणु प्रयोगों के लिए चित्रा 2. तापमान नियंत्रण. सेट तापमान (टी एस) पानी चिलर / हीटर पर पढ़ रही है. वास्तविक तापमान (टी) एक खुर्दबीन पर coverslip के ऊपर की सतह से संपर्क एक thermocouple से मापा जाता है. वास्तविक तापमान बनाम छह अलग सेट तापमान (काला) वर्ग की साजिश उत्कृष्ट linearity (ग्रीन लाइन धराशायी) से पता चलता है. नियंत्रक की मजबूती बाद में टाइम्स (लाल हीरे) में किए गए यादृच्छिक माप से दिखाया गया है. इनसेट तापमान सह की तस्वीर हैउनके अंतिम विधानसभा में इकाई और उद्देश्य ntrolling. लाल रेखा एकता की एक ढलान का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. डीएनए डिजाइन. ए) dsDNA मुड़े. एक 10 मेर dsDNA एक घुमावदार ट्यूब खंड, और धराशायी लाइनों के रूप में दो ही किस्में के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. किसी भी 10 पूर्व डीएनए के पेचदार अक्ष बिल्कुल सीधे नहीं है, और इस तरह इस तरह के एक 10 पूर्व की प्रत्येक कड़ी में एक ही दिशा में पेचदार धुरी के वृद्धिशील झुकाव को बढ़ावा मिलेगा. इस आशय की एक तलीय, superhelical अणु. बी) dsDNA की पीसीआर आधारित तैयारी उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एकल असहाय DNAs एक क्षैतिज रेखा के रूप में दिखाया गया है. उनकी वास्तविक वक्रता यहाँ दर्शाया नहीं गया है. काले रंग में केंद्रीय खंड का प्रतिनिधित्व करता है डीएनए टुकड़ा का अनूठा हिस्सा. इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी DNAs के लिए आम एडाप्टर दृश्यों हल्के भूरे रंग में दिखाया गया है. आगे और पीछे एडाप्टर के लिए प्राइमर 1 और 4 पानी रखना, क्रमशः. प्राइमर 2 5'-अंत में Cy3 के साथ लेबल है. प्राइमर 3 5'-अंत में एक बायोटिन टैग और एक आंतरिक जुड़ा हुआ Cy5 है. प्राइमर 2 और 3 के हल्के नीले रंग क्षेत्रों के रूप में चिपचिपा समाप्त होता है कि समारोह पूरक दृश्यों होते हैं. ब्याज का अनुक्रम होता है कि एक प्लाज्मिड या जीनोमिक डीएनए या तो दो अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं में टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. Cy3 लेबल dsDNA प्राइमर 1 और 2 का उपयोग कर उत्पादन किया है, और biotinylated Cy5 लेबल डीएनए प्राइमर 3 और 4 का उपयोग कर उत्पादन किया जाता है. इन दो पीसीआर उत्पादों गरम कर रहे हैं और किनारा आदान प्रदान के लिए एक साथ ठंडा. चार अलग dsDNAs Cy3, Cy5, और बायोटिन शामिल केवल, जिनमें से एक का गठन कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

हमेशा "> चित्रा 4
चित्रा 4. प्रायोगिक योजना. ए) एकल अणु झल्लाहट प्रयोग. दूसरे पर एक तरफ और Cy5 (लाल) पर Cy3 (हरा) के साथ लेबल dsDNA अणुओं खूंटी (polyethylene glycol) लेपित सतह पर स्थिर रहे. DsDNAs की प्रतिवर्ती पाशन और unlooping उच्च झल्लाहट (looped) और कम झल्लाहट (unlooped) राज्यों, क्रमशः. बी) दाता (हरे रंग की एक ठेठ एकल अणु समय का पता लगाने) और स्वीकर्ता (लाल) प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिणाम. उच्च और निम्न झल्लाहट राज्यों क्रमश: looped और unlooped राज्यों के रूप में पहचाने जाते हैं. इसके अलावा पाशन दर की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि पहले पाशन समय है संकेत दिया. (इनसेट) ज़ूम में आंकड़ा. सी) दाता और स्वीकर्ता तीव्रता से गणना की झल्लाहट दक्षता का एक समय का पता लगाने बी में निशान Cy3 और Cy5 तीव्रता के विरोधी संबंध को दर्शाता है. 4B चित्रा और मुख्य पाठ में वर्णित के रूप टुनिशिया> 4C सीधे डीएनए (एस डीएनए) से लिया गया था. 0.2 पर कम झल्लाहट 532 एनएम लेजर द्वारा Cy5 के प्रत्यक्ष उत्तेजना की वजह से है, और fluorescently सक्रिय Cy5 की उपस्थिति की पुष्टि. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. Polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (29.2:0.8 acrylamide / बीआईएस acrylamide, TBE बफर, 8.0 पीएच में 5%) सिंथेटिक DNAs की. बाएं से दाएं, गलियों 1 केबी मार्कर, 186 बी पी सीधे डीएनए और 186 बी पी होते घुमावदार डीएनए. यह आंकड़ा आंशिक रूप से अनुमति के साथ पिछले एक प्रकाशन 12 से अनुकूलित है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

"के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" _content हमेशा "> चित्रा 6
चित्रा 6. घुमावदार डीएनए (सी डीएनए) (ए) और अपनी इसी झल्लाहट ट्रेस (बी) से प्रतिनिधि निशान. तीव्रता की तुलना करें और एस डीएनए (आंकड़े 4B और 4C) और सी डीएनए (आंकड़े 6A के बीच निशान झल्लाहट और 6B) स्पष्ट रूप से घुमावदार डीएनए अधिक बार एक ही बफर हालत में सीधे डीएनए से छोरों कि दिखाता है. (इनसेट) ज़ूम में आंकड़ा Cy3 और Cy5 तीव्रता के विरोधी संबंध को दर्शाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
चित्रा 7. सीधे और घुमावदार DNAs का मतलब पहली पाशन बार. प्रत्येक टीIME 5 विभिन्न क्षेत्रों में ~ 500 अणुओं से निकाला गया था. त्रुटि सलाखों 3 स्वतंत्र प्रयोगों से गणना मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

8 चित्रा
चित्रा 8. Oligo संकरण से annealing दर लगातार निर्धारण. Annealing दर माप का एक) योजनाबद्ध देखें. Cy5 प्राइमर सतह पर स्थिर है, और Cy3 प्राइमर 50-180 एनएम पर मौजूद है. 50 एनएम पर बाध्यकारी और Cy3 प्राइमर की unbinding reversibly होते हैं और annealing दर मुफ्त oligo की एकाग्रता पर रैखिक निर्भर करता है इनसेट. बी) में दिखाया गया है जो detectable स्वीकर्ता फटने, नेतृत्व करने के लिए. लाइन की ढलान दूसरे क्रम annealing दर लगातार (कश्मीर 'annea का प्रतिनिधित्व करता है एल). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

9 चित्रा
चित्रा 9 समुद्री मील में गणना की सीधे और घुमावदार DNAs की जम्मू कारकों जम्मू कारक दो measurables के आधार पर निर्धारित किया गया था... DsDNA पाश और मुक्त पूरक overhangs के annealing दर लगातार की पाशन दर बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

आठ: 25px; चौड़ाई: 351px; "> पानी
घटक Volume/50 μl प्रतिक्रिया अंतिम एकाग्रता
36 μl
5x Phusion बफर 10 μl 1x
10 मिमी dNTPs 1 μl 200 माइक्रोन प्रत्येक
आगे प्राइमर (25 माइक्रोन) 1 μl 0.5 माइक्रोन
रिवर्स प्राइमर (25 माइक्रोन) 1 μl 0.5 माइक्रोन
Phusion गर्म शुरू डीएनए पोलीमरेज़ (2 यू / μl) 0.5 μl 0.02 यू / μl
टेम्पलेट डीएनए 0.5 μl ~ 1 एनजी

तालिका 1. पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण. प्रोटोकॉल Phusion डीएनए पोलीमरेज़ के लिए अनुकूलित है. आइटम इस क्रम में जोड़ा जाना चाहिए.

"> 95 डिग्री सेल्सियस
साइकिल कदम तापमान समय चक्रों की संख्या
प्रारंभिक विकृतीकरण 30 सेकंड 1
विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 5 सेकंड 30
एनीलिंग 60 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड
विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड / केबी
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1
4 & #176, सी पकड़

तालिका 2. पीसीआर साइकिल निर्देश. Annealing तापमान प्राइमरों के पिघलने के तापमान के आधार पर निर्धारित किया जाता है. एक्सटेंशन समय Phusion डीएनए पोलीमरेज़ के लिए अनुकूलित है.

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Discussion

झल्लाहट पर आधारित एक सरल एकल अणु परख विभिन्न आंतरिक आकार के DNAs के पाशन कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. घुमावदार DNAs 10.5 बीपी के पेचदार अवधि के साथ चरण में 10 पूर्व अनुक्रम दोहरा द्वारा तैयार किया जा सकता है, और उनके curvatures पृष्ठ का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है. ये dsDNAs क्षणिक पाश स्थिरीकरण अनुमति देने के लिए चिपचिपा समाप्त होता है के साथ डिजाइन किए हैं. हम समय के साथ looped अणुओं की संख्या में घातीय वृद्धि से पाशन दर निकाली गई. डिस्कनेक्ट किया चिपचिपा अंत वर्गों के बीच annealing दर लगातार जम्मू कारक के रूप में जाना जाता है जो पाशन प्रायिकता घनत्व, की एकाग्रता बराबर निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

एक ligase आधारित डीएनए चक्रगति परख में, डीएनए बंद करने संभाव्यता की माप ligase एकाग्रता के प्रति संवेदनशील है, और ligase 9 अत्यधिक है अगर जम्मू कारक overestimated किया जा सकता है. डीएनए के लिए डीएनए ligase के बंधन nonspecific भी पाशन 10 प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, ligasई गतिविधि नमक पर निर्भर करता है और समय के साथ decays. इस प्रकार यह ligase गतिविधि के लिए suboptimal शर्तों में डीएनए पाशन अध्ययन करने के लिए मुश्किल है. इसके विपरीत, एक झल्लाहट आधारित पाशन परख इन चिंताओं के सभी से मुक्त है.

हमारे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल चर्चा के लायक हैं जो दो महत्वपूर्ण पहलुओं को छोड़कर Vafabakhsh और हा 13 के समान है. Vafabakhsh और हा 13 कई सिंथेटिक oligos ligating द्वारा उनके dsDNA अणुओं का निर्माण किया. Oligo संश्लेषण में न्यूक्लियोटाइड प्रति त्रुटि (प्रविष्टि, विलोपन, या प्रतिस्थापन) दर 23 (0.181% च) नगण्य है, अनायास ही डीएनए दृश्यों के अंश oligo लंबाई के साथ रैखिक बढ़ जाती है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार 100-BP द्वैध नमूना उच्च पाशन दर 24 में हो सकता है जो ~ अप करने के लिए 33% अपूर्ण duplexes शामिल कर सकते हैं. इसकी तुलना में, हमारे प्रोटोकॉल डीएनए चे तुलना में बहुत अधिक निष्ठा है जो dsDNA अणुओं, synthesize करने पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करता हैmosynthesis 25. निर्माता के आंकड़ों के अनुसार, हम इस्तेमाल उच्च निष्ठा पोलीमर्स पीसीआर प्रवर्धन के 30 चक्रों के बाद 99.8% संभावना पर एक सही 100 बीपी डीएनए अणु पैदा होंगे.

दो अध्ययनों के बीच एक और महत्वपूर्ण अंतर यह है कि सतह स्थिरीकरण योजना है. Vafabakhsh और हा 13 से प्रोटोकॉल में, वे एक आंतरिक आधार के माध्यम से जुड़े होते हैं, जबकि हमारे अध्ययन में, डीएनए अणु, उनके सिरों के माध्यम से सतह से जुड़े होते हैं. यह अकेले कारावास प्रभाव के आधार पर, एक आंतरिक टिकी dsDNA पांच में से एक कारक के लिए अधिक बार एक मुक्त dsDNA से पाश, आंतरिक 26 लगाए के स्थान के आधार पर कर सकते हैं कि भविष्यवाणी की थी. डीएनए समोच्च लंबाई के एक समारोह के रूप में जम्मू कारक मापने इसलिए, जब आंतरिक लगाए अप्रत्याशित परिवर्तनशीलता मिलवा सकता है. यह linker के साथ संशोधित आधार एक उच्च पाशन दर में परिणाम कर सकते हैं जो एक कमजोर आधार बाँधना क्षमता, है कि यह भी संभव है. हालांकि, despइन स्पष्ट मतभेद ite, दो प्रोटोकॉल 100 बीपी (~ 3 एनएम बनाम ~ 2 एनएम) पर भी इसी तरह जम्मू कारकों का उत्पादन.

इस झल्लाहट आधारित पाशन परख 27 पाशन dsDNA पर बेमेल, nicks या अंतराल के प्रभाव, डीएनए dsDNA पाशन पर बंधनकारी प्रोटीन के प्रभाव, और dsDNA लचीलेपन का तापमान निर्भरता सहित dsDNA पाशन से संबंधित घटना की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए वादा है. इन विषयों में पारंपरिक ligase आधारित चक्रगति साथ पता करने के लिए मुश्किल होगा. झल्लाहट आधारित पाशन परख भी बहुलक मॉडल का परीक्षण करने के लिए मानक रिश्ता है जो समोच्च लंबाई बनाम जम्मू कारक, मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, हम यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल 100 बीपी की तुलना में कम dsDNA के पाशन का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है. इस लंबाई के नीचे, dsDNA पाशन बेहद धीमी गति से, और इसलिए मापा दर ऐसे photobleaching के रूप में अन्य अनपेक्षित प्रक्रियाओं से प्रभावित हो जाएगा हो जाता है. एक हमारे द्वारा स्पष्ट पाशन कैनेटीक्स तेज कर सकते हैंउच्च नमक एकाग्रता ([ना +]> 500 मिमी), लेकिन इस तरह के माप की शारीरिक प्रासंगिकता आईएनजी संदिग्ध हो जाता है. इसलिए, 100 बीपी नीचे लंबाई पैमाने पर झुकने dsDNA की जांच चक्रगति आधारित assays के लिए एक दृष्टिकोण orthogonal से लाभ होगा.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgments

हम समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए जेम्स वाटर्स, मकान का कोना वाद्स्वोर्थ और बो Broadwater धन्यवाद. हम भी उपयोगी टिप्पणी प्रदान करने के लिए चार अनाम समीक्षक धन्यवाद. हम जॉर्जिया प्रौद्योगिकी संस्थान, वैज्ञानिक इंटरफेस पर Burroughs Wellcome कोष कैरियर पुरस्कार, और जीवन प्रणालियों के NSF भौतिकी से छात्र रिसर्च नेटवर्क अनुदान से वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Small DNA FRAG Extract Kit-100PR VWR 97060-558
Acrylamide 40% solution 500 ml VWR 97064-522
Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml VWR 97063-948
GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp Fermentas SM0241
Mini Vertical PAGE System VWR 89032-300
Syringe filter 0.2 μm CS50 VWR A2666
Trolox Sigma-Aldrich 238813-1G triplet state quencher
Protocatechuic acid (PCA) Sigma-Aldrich 08992-50MG oxygen scavenging system
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) Sigma-Aldrich P8279-25UN oxygen scavenging system
mPEG-silane, MW 2,000 1 g Laysan Bio MPEG-SIL-2000-1g
Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 Laysan Bio Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein Invitrogen A2666
Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs F-540L
Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit IBI Scientific IB47020
Premium plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-1
VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 VWR 48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater Fisher Scientific temperature control
Objective Cooling Collar Bioptechs 150303 temperature control
KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage Semprex KMI53
High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW Edmund optics NT66-968 Cy3 excitation
CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector Coherent 1139604 Cy5 excitation
650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter Semrock FF650-Di01-25x36 splitting dichroic
LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm Semrock LM01-552-25 combining dichroic
Brightline Fluorescence Filter 593/40 Semrock FF01-593/40-25 Cy3 emission filter
635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm Semrock BLP01-635R-25 Cy5 emission filter
EMCCD iXon+ Andor Technology DU-897E-CS0-#BV
IX51 inverted microscope frame Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF Olympus
Immersion oil type-F for fluorescence microscopy Olympus IMMOIL-F30CC
2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated  Edmund optics 54-092 miniature mirror
1/4" Travel Single-Axis Translation Stage Thorlabs MS-1 translation of miniature mirror
Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm Thorlabs AC254-200-A focusing lens
Adjustable Mechanical Slit Thorlabs VA100
Dielectric Mirror Thorlabs BB1-E02
Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm Thorlabs AC254-100-A relay lens
Lens Mount for Ø1" Optics Thorlabs LMR1
Dichroic Filter Mount Thorlabs FFM1
Fixed Cage Cube Platform Thorlabs B3C
Kinematic Mount for Ø1" Optics Thorlabs KM100
N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm Thorlabs LA1422-A collimating lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm Thorlabs LA1222-A telescope lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm Thorlabs LA1433-A telescope lens

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References

  1. Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
  2. Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
  3. Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
  4. Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
  5. Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
  6. Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  7. Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
  8. Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
  9. Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
  10. Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
  11. Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
  12. Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
  13. Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
  14. Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
  15. Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
  16. Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
  17. Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
  18. Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
  19. Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
  20. Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  21. Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
  22. Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
  23. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
  24. Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
  25. Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
  26. Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
  27. Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 88 डीएनए पाशन जम्मू कारक एक अणु झल्लाहट जेल गतिशीलता बदलाव डीएनए वक्रता कीड़ा की तरह श्रृंखला
एकल अणु झल्लाहट द्वारा डीएनए पाशन पढ़ रही है
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