Summary
Questo studio presenta una procedura sperimentale dettagliato per misurare le dinamiche di loop di DNA a doppio filamento con singola molecola Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Il protocollo descrive inoltre come estrarre il ciclo di densità di probabilità chiamato il fattore J.
Abstract
Curvatura del DNA a doppia elica (dsDNA) è associato con molti importanti processi biologici quali il riconoscimento DNA-proteine e confezionamento DNA in nucleosomi. Termodinamica di dsDNA curvatura è stata studiata da un metodo chiamato ciclizzazione che si basa sul DNA ligasi di unirsi covalentemente brevi estremità coesive di un dsDNA. Tuttavia, l'efficienza legatura può essere influenzata da molti fattori che non sono legati a dsDNA loop come la struttura del DNA che circonda le estremità appiccicose uniti, e ligasi può anche influenzare il tasso looping apparente attraverso meccanismi quali il legame non specifico. Qui mostriamo come misurare dsDNA cinetica looping senza ligasi rilevando formazione transitoria ciclo DNA mediante FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). molecole di dsDNA sono costruiti utilizzando un protocollo basato su PCR semplice con un paio FRET e un linker biotina. La densità di probabilità loop noto come fattore J viene estratto dal prezzo loop e il tasso di ricottura tra due sezionatoreTed estremità appiccicose. Testando due dsDNAs con curvature diverse intrinseche, mostriamo che il fattore J è sensibile alla forma intrinseca del dsDNA.
Introduction
Comprendere le proprietà meccaniche di dsDNA è di fondamentale importanza nelle scienze di base e applicazioni di ingegneria. La struttura di dsDNA è più complicato di una scala elicoidale dritto, perché angoli di rollio, inclinazione e torsione tra coppie di basi successive possono variare con la sequenza. Fluttuazioni termiche possono causare dsDNA di sottoporsi a diversi modi di fluttuazioni conformazionali come la flessione, torsione e stretching. Transizioni come fusione e attorcigliamenti possono verificarsi anche in condizioni estreme.
Tra questi movimenti, dsDNA flessione ha l'impatto biologico più evidente 1. dsDNA piegatura è associato repressione genica o attivazione portando due siti distanti vicini tra loro. Esso gioca un ruolo importante nella confezione DNA all'interno del nucleo cellulare o un capside virale. Deformazione piegatura di dsDNA possono essere visualizzati sperimentalmente microscopia ad alta risoluzione (AFM 2 e 3 TEM), e il Thermodynamics e cinetiche possono essere studiati mediante saggi di looping, che legano chimicamente siti giustapposte del dsDNA.
Un tale saggio è ligasi-dipendente ciclizzazione 4. In questo saggio, le molecole di dsDNA con (coesivi) estremita 'adesive' sono circolarizzato o dimerizzate da DNA ligasi. Confrontando i tassi di cerchio e la formazione di dimeri, si può ottenere una concentrazione molare efficace di una delle estremità del DNA in prossimità dell'altra estremità, che è conosciuto come il fattore J. Questo fattore J è dimensionalmente equivalente alla densità di probabilità di trovare una estremità del DNA a breve distanza dall'altra estremità, e riflette quindi la flessibilità del DNA. Misurare il fattore J in funzione della lunghezza del DNA rivela molte caratteristiche di meccanica DNA compresa la lunghezza di persistenza 4,5.
La catena vermiforme (WLC) modello è stato ampiamente considerato come il modello di polimero canonico per la meccanica dsDNA in base al suo successo nel spiegazioneining le curve forza-estensione ottenuti in DNA tirare esperimenti 6, e correttamente predire i fattori di J dsDNAs più di 200 bp 7. Tuttavia, utilizzando il test ciclizzazione su molecole dsDNA più brevi 100 bp, Cloutier e Widom misurato i fattori J di essere diversi ordini di grandezza superiori rispetto al modello WLC previsione 8. Un anno dopo, Du et al. prodotta fattori J in accordo con il modello WLC utilizzando il test ciclizzazione con concentrazioni più basse di ligasi e attribuito il risultato anomalo dal gruppo Widom ad alte concentrazioni ligasi utilizzati 9. Questa controversia esemplifica l'influenza inevitabile di DNA ligasi sulla cinetica di ciclizzazione quando si utilizza il test convenzionali 9. Inoltre, DNA ligasi può anche influenzare la struttura del DNA e la rigidità attraverso legame non specifico 10,11.
Per eliminare le preoccupazioni tecniche di analisi looping proteina-dipendente, abbiamo recentemente dimostrato una prottest looping ein-libero basato sul Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. In questo metodo, conformazioni loop vengono rilevati dal FRET tra donatore e accettore divisoria in prossimità delle estremità appiccicose di una molecola di DNA. Un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale obiettivo di tipo (TIRFM) viene utilizzato per registrare traiettorie di ciclaggio reversibile e eventi unlooping di molecole di DNA a singola superficie immobilizzato per un periodo prolungato di tempo. Questo metodo offre assemblaggio basato su PCR di molecole di DNA per generare molecole di DNA senza disadattamento, che è un miglioramento fondamentale per un metodo simile per Vafabakhsh e Ha 13. L'aspetto unico molecola di questo protocollo permette misura delle distribuzioni oltre Ensemble medie mentre l'aspetto FRET permette di misurare la dinamica di ciclica DNA ripetutamente dalla stessa molecola, anche in condizioni che possono alterare ligasi attività.
La configurazione TIRFM è mostrato in Figura 1. A personalizzatoPortaoggetti progettato è posto sopra un corpo del microscopio Olympus IX61. 532 nm e 640 nm laser vengono introdotti dal lato e sono riflessi da specchi ellittici minuscoli 14 nella alta obiettivo NA per ottenere l'angolo di incidenza critico all'interfaccia coprioggetto-acqua. Notiamo che più diffusa passante obiettivo TIR utilizzando specchi dicroici o configurazioni TIR basato prisma può essere utilizzato anche per questa applicazione FRET. L'immagine di fluorescenza formata dal microscopio è suddiviso in immagini donatore e accettore da uno specchio dicroico. Vengono poi ri-masterizzata su due metà di un EMCCD. Ulteriori filtri di emissione passa-lungo sono utilizzati per ridurre segnale di fondo.
Il controllo della temperatura è essenziale per acquisire dati cinetici riproducibili. Per il controllo della temperatura, l'obiettivo è separato dal boccaglio del corpo del microscopio per ridurre al minimo il trasferimento di calore, e l'acqua da un raffreddatore / riscaldatore di temperatura controllata è distribuito attraverso un collare di ottone che si adatta strettamenteattorno al metallo interno sotto la giacca obiettivo. Questa configurazione è in grado di ottenere il controllo della temperatura solido a superficie coprioggetto tra 15 e 50 ° C (Figura 2). In questo lavoro, la temperatura del campione è stata mantenuta a 24 ° C.
Il protocollo seguente presenta la procedura step-by-step per la costruzione del DNA, la stima di forma del DNA, esperimento di singola molecola, e J determinazione fattore.
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Protocol
1. Preparazione dsDNA campione
- Progettare DNA curve globalmente ripetendo una sequenza di 10-mer. Ad esempio, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'è un DNA curvo 186-bp, dove X è una base supplementare casuale e la sequenza fiancheggiante la sequenza ripetuta 10-mer sono sequenze adattatore.
NOTA:. In questo esempio 15 sono stati scelti due 10-mers con preferenze opposte alla formazione dei nucleosomi sulla base di una larga scala studio occupazione nucleosomi da Kaplan et al. Poiché la ripetizione dell'elica di dsDNA è vicino a 10 bp, qualsiasi deviazione netto dell'asse elicoidale del 10-mer si accumulerà per produrre una forma ad arco di cerchio (Figura 3A). Poiché il periodo elicoidale è più vicino a 10,5 bp, una base supplementare è inserito dopo ogni due ripetizioni di mantenere la struttura curva come planare possibile. Queste sequenze più brevi di 200 bp possono essere ordinati da companies che offrono gene servizio di sintesi. E 'conveniente per affiancare queste sequenze con sequenze adattatori comuni per i passi successivi. La procedura è schematizzata in Figura 3B. - Eseguire la PCR con Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) e Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Primer 2 è etichettato con il Cy3 donatore FRET all'estremità 5 '. Una tipica ricetta PCR e protocollo di ciclismo sono presentati nelle tabelle 1 e 2.
- Eseguire la PCR con Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) e Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Primer 3 è etichettato con l'accettante Cy5 FRET attraverso la spina dorsale e la biotina-linker all'estremità 5 '. PCR ricetta e il protocollo ciclismo sono come sopra.
- Purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di pulizia PCR.
- Mescolare il prodotto Cy3 marcato e il prodotto Cy5 marcato in un buffer di scambio strand (NaCl 100 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) a concentrazioni finali di 0,4 &# 181, M e 0,1 micron, rispettivamente. NOTA: L'eccesso Cy3-DNA aumenta la concentrazione del duplex trasportare sia Cy3 e Cy5 per effetto dello scambio filamento.
- Scambio trefoli incubando a 98,5 ° C per 2 min, gradualmente raffreddamento a 5 ° C con velocità di rampa di 0,1 ° C / sec, e incubando a 5 ° C per 2 ore.
2. Elettroforesi su gel per rilevare dsDNA curvatura
- Versare il gel poliacrilammide 16,17 mescolando acrilammide e soluzioni bis-acrilammide a 29.2:0.8 rapporto, 5% (w / v) in 1X Tris / Borato / EDTA (TBE) tampone a pH 8,0. Nota: 10 ml di soluzione di gel contiene: 1.217 ml 40% di acrilammide, 0.667 ml 2% bis-acrilammide, 1 ml di TBE 10X, 100 L persolfato di ammonio (APS) 10%, 10 L TEMED, e il resto è dH 2 O. Solidificazione completa del gel dura circa 30 min.
- Caricare il gel di poliacrilammide con campioni di DNA e il DNA ladder in 1X tampone di caricamento (5% glicerolo, 0,03% (w / v) di bromofenolo blue) ed eseguire il gel a 5-8 V / cm a 4 ° C per 45 minuti o fino a quando il fronte del colorante si avvicina alla fine del gel.
- Macchiare il gel utilizzando tampone 1X TBE contenente 0,5 g / ml di etidio bromuro per 30 min. Identificare le bande di DNA sotto illuminazione UV. Confronta le posizioni di banda con il marcatore di formato (100 bp DNA ladder) per calcolare le dimensioni apparenti delle molecole di DNA. NOTA: curvo DNA generalmente si muovono più lentamente rispetto DNA dritto.
3. Flusso Preparazione cellulare
- Praticare 6-7 coppie di fori lungo due lati opposti di un vetrino (3'' x 1'') utilizzando un trapano a colonna e punte di diamante. Dopo la foratura, strofinare lo scivolo in acqua corrente per eliminare polvere di vetro visibile. NOTA: I fori servono come ingressi di perfusione e punti vendita. Durante la perforazione, raffreddando il vetrino con acqua è importante per evitare fessurazioni.
- Porre i vetrini in posizione verticale in un barattolo di vetro e riempirlo con acqua. Ultrasuoni per 15 min e trasferirli in un altro vaso di vetro dedicated per pulizia acetone. Riempire con acetone e ultrasuoni per 15 min. Sciacquare i vetrini con etanolo utilizzando un flacone spray e poi con acqua. Metterli in un barattolo di polipropilene, riempirlo con idrossido di potassio 5 M, e ultrasuoni per 15 min. Infine, sonicare i vetrini in acqua per 15 minuti. Pulire i coprioggetti (n. 1, 24 x 40 mm) utilizzando lo stesso protocollo. NOTA: diapositive e vetrini puliti possono essere memorizzati in dH 2 O per l'uso a lungo termine.
- Mescolare 1 mg di biotina-PEG-silano (MW 3400) con 80 mg di MPEG-silano (MW 2000) in 340 L di soluzione di bicarbonato 0,1 M di sodio. Mescolare bene e centrifugare la miscela brevemente per sbarazzarsi di bolle. NOTA: La funzionalizzazione della superficie con polietilene glicole (PEG) aiuta a ridurre il legame non specifico del DNA alla superficie.
- Mettere 80 L della soluzione di PEG in ogni diapositiva e abbassare delicatamente un coprioggetto su di esso. Attendere 45 min. Separare il vetrino dalla diapositiva con le pinzette, sciacquare con abbondante dH 2 O e lasciare torlo asciugare all'aria aperta.
- Mettere sottili strisce di nastro biadesivo in tutta la diapositiva di formare canali. Allineare un coprioggetto su di esso e premere con decisione il vetrino contro la diapositiva di formare canali a tenuta stagna. Utilizzare 5 minuti epossidica per sigillare i bordi dei canali.
4. Preparazione della Soluzione Trolox
- Mettere ~ 30 mg Trolox e 10 ml di dH 2 O in un pallone e utilizzare una barra di magnete scalpore per mescolare la soluzione all'aria aperta per 18 ore.
- Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 micron e regolare il pH a 7 con l'aggiunta di ~ 6 microlitri di 1 base M Tris (pH 11). Nota: Trolox è un reagente anti-lampeggiante che viene comunemente usato in singola molecola studi 18. L'azione antiscolorimento di Trolox deriva dal suo derivato ossidato che è presente in parzialmente degradata soluzione Trolox 19. Sciogliendo rapidamente Trolox in metanolo o ad alto pH della soluzione Tris deve essere evitato a causa dell'ossidazione inefficiente.
5. Single-molImaging ecule
- Iniettare 15 ml di soluzione NeutrAvidin (0,5 mg / ml) nel canale e attendere 2 minuti prima di risciacquare con 100 microlitri di tampone T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,0).
- Iniettare 50 ml di campione di DNA (50-100 pM) nel canale. Attendere 5 minuti e risciacquare il DNA non legato via con 100 L di tampone T50. NOTA: molecole di DNA saranno specificatamente legarsi alla superficie attraverso l'interazione NeutrAvidin-biotina.
- Riempire il canale con il buffer di imaging che contiene un sistema che assorbe ossigeno 20 (PCD 100 mM, 5 mM PCA, 1 Trolox mM e NaCl 500 mM).
- Impostare la EMCCD in modalità a trasferimento di quadro per lo streaming di 2 x 2 immagini categorizzate (256 x 256) al computer a 25 fotogrammi al secondo.
- Mettete l'olio per immersione sull'obiettivo microscopio, e fissare la cella di flusso sul palco microscopio utilizzando clip campioni. Coarse-regolare il fuoco osservando il modello riflessione laser sulla parete. Fine-regolare la messa a fuoco utilizzando la visualizzazione in tempo reale della fluorescenza imetà sul monitor.
- Iniziare acquisizione dati con il laser 532 nm su. Controllare il live view e regolare la messa a fuoco, se necessario. Smettere di acquisizione dati quando la maggior parte delle molecole sono fotodecolorate.
NOTA: In questa struttura, viene utilizzato un programma-lab scritta C per controllare il microscopio e visualizzare le immagini in diretta sul monitor in quanto vengono salvati sul disco rigido.
6. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati
NOTA: Una serie temporale di 256 x 256 le immagini vengono elaborate da un codice MATLAB per generare singola molecola tempo tracce di Cy3 e Cy5 intensità. Per accoppiare pixel tra il canale donatore e accettore canale dell'immagine split-view, 6-7 coppie di Cy3 e Cy5 macchie, ciascuna coppia dalla stessa molecola uniformemente dispersa attraverso il campo di vista, vengono raccolte manualmente, e una trasformazione affine viene calcolato utilizzando le coordinate di questi punti come punti di ancoraggio.
- Utilizzo di uno script MATLAB, guardare attraverso tutti i tempi singola molecola tracce tcappello mostrano più transizioni tra i segnali alte e basse tasto. Identificare gli stati in loop e in loop.
NOTA: Il segnale FRET è definita come l'intensità Cy5 (I a) diviso per la somma di Cy3 e Cy5 intensità (I a + I d). Stato Looped ha un alto valore FRET mentre lo stato in loop ha un valore basso FRET. L'istogramma dei segnali FRET da una singola molecola è bimodale distribuito a causa di looping reversibile e unlooping. - Trova la soglia che separa le due distribuzioni determinando l'intersezione tra le due curve gaussiane muro.
- Calcolare l'efficienza FRET come
e assegnare gli stati ansa con alti valori di FRET e gli stati in loop con valori bassi FRET. - Utilizzo di uno script MATLAB, analizzare il numero cumulativo di molecole (N (t)), che in loop (oraggiunto lo stato alto FRET) a diversi time-lapse da inizio acquisizione dati. NOTA: Dal momento che una molecola di dsDNA può iniziare in qualsiasi conformazione dello stato in loop all'inizio di acquisizione dati, il tasso di aumento della popolazione loop riflette il tasso medio di ciclo media di oltre conformazioni iniziali. Estrarre il looping ciclo tasso k montando N (t) con una funzione esponenziale:
Se aumenta bifasico, può essere dotato di una doppia funzione esponenziale: 
In questo caso, k ciclo è ottenuta da: 
NOTA: Teoricamente, la probabilità di sopravvivenza che un polimero non ha loop al tempo t non è una singola o doppia funzione esponenziale 12. FITT esponenzialeING è usato come un mezzo pratico per estrarre il tempo medio looping.
e assegnare gli stati ansa con alti valori di FRET e gli stati in loop con valori bassi FRET. 
Se aumenta bifasico, può essere dotato di una doppia funzione esponenziale: 
In questo caso, k ciclo è ottenuta da: 
NOTA: Teoricamente, la probabilità di sopravvivenza che un polimero non ha loop al tempo t non è una singola o doppia funzione esponenziale 12. FITT esponenzialeING è usato come un mezzo pratico per estrarre il tempo medio looping. 7. Determinazione del fattore J
NOTA: Il fattore J rappresenta come concentrato un'estremità di un dsDNA è intorno all'altra estremità. Può essere determinato interpolando la concentrazione di una estremità del segmento di DNA che produrrebbe la stessa velocità di reazione con l'altra estremità segmento come tasso loop misurata. Sperimentalmente, un segmento finale viene immobilizzato sulla superficie, e l'altra estremità segmento viene introdotto ad una certa concentrazione c. Se il tasso di ricottura misurata tra le due estremità è k ricottura, allora il fattore J 21 è dato da 
. La costante di velocità di ricottura (k = k ricottura ricottura / C) è indipendente dalla concentrazione sonda.
- Flusso 20 l di 30-50 pM biotina-Cy5 oligo (Primer 3) into un canale NeutrAvidin rivestita. Sciacquare il canale con 100 microlitri T50 per lavare via oligo non legato.
- Preparare il tampone di imaging come descritto nella parte 5 con l'aggiunta di Cy3 oligo (Primer 2) ad una concentrazione finale di 50 nM. Flusso questo buffer di imaging nel canale.
- Pur mantenendo il laser 532 nm su, girare brevemente il laser 640 nm a identificare le posizioni di associazione superficie Cy5 oligo. Spegnere il laser 640 nm e iniziare a monitorare il segnale FRET.
NOTA: Su ibridazione di un oligo Cy3 ad un Cy5 oligo-bound superficie, Cy5 fluorescenza derivare da FRET. - Utilizzo di uno script MATLAB, analizzare il numero di molecole che si aprono nello stato non legato (bassa intensità Cy5) ma poi si trasformano in stato (intensità alta Cy5) ricotto in funzione del tempo per l'intensità tracce Cy5.
- Tracciare questo numero di molecole vs tempo ricottura. Montare questa curva con una singola funzione esponenziale (
(k tempra). - Ripetere questo esperimento a diverse concentrazioni Cy3 oligo (60, 100 e 180 nm) per confermare la linearità tra il tasso di ricottura e la concentrazione reagente. Estrarre la costante di velocità di ricottura secondo ordine (k tempra ) Dal pendio.
- Calcolare il fattore J da
, Dove k ciclo è il tasso loop misurata nelle stesse condizioni buffer.
(k tempra). 
, Dove k ciclo è il tasso loop misurata nelle stesse condizioni buffer. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Molecole di DNA utilizzati per lo studio loop consistono in una regione duplex di sequenza e lunghezza variabile e sporgenze a singolo filamento che sono complementari tra loro. Le sporgenze, che sono lunghe 7-base, possono ricombinarsi tra loro per acquisire lo stato in loop. Ogni sbalzo contiene sia Cy3 o Cy5 che è collegato nella spina dorsale del DNA attraverso la chimica amidite. Il Cy5-sporgenza è anche collegata con biotina-TEG (15-atomo Tetra-glicole etilenico distanziale) per l'immobilizzazione di superficie (vedi Figura 4A). Tutte queste modifiche possono essere incorporati nel dsDNA seguendo un protocollo basato su PCR (protocollo 1 e Figura 3B). La lunghezza scelta e la sequenza delle sporgenze funzionano bene per produrre eventi FRET rilevabili e reversibili delle normali condizioni sperimentali. L'annodamento e la cinetica unlooping del ciclo DNA sono sensibili alla temperatura ambientale, e quindi, un regolatore di temperatura è essenziale per la riproducibilità. Tale Controller può essere facilmente incorporata nel microscopio (Figura 2).
Utilizzando TIRFM, le fluttuazioni di (accettore) segnali da molecole di dsDNA-superficie immobilizzato sono stati osservati (Figura 4B) Cy3 (donatore) e Cy5 anti-correlato. Nello stato in loop, la distanza tra due coloranti è minore di 5 nm, che porterebbe a segnale alto Cy5 e Cy3 segnale basso a causa di alta efficienza FRET (figure 4A e 4C). Diversi esperimenti di controllo sono stati eseguiti per dimostrare che lo stato alto FRET rappresenta lo stato in loop. La durata dello stato alto FRET è aumentata con l'aumentare della lunghezza dello sbalzo, il che suggerisce che lo stato di alta FRET è stabilizzata da appaiamento delle basi tra le due sporgenze. La durata dello stato alto FRET anche diminuisce al diminuire della lunghezza del DNA, che si pensa perché il ciclo gratuito di energia aumenta come il ciclo diventa più piccolo 12. Sulla base di questa evidenza, l'alto e il basso sta FRETtes possono essere assegnati agli stati in loop e in loop, rispettivamente.
Per testare l'effetto di curvatura intrinseca di dsDNA su annodare, due dsDNAs 186 bp con curvature diverse sono stati costruiti, che sono chiamati 'dritto' (S-DNA) e 'curvo' (C-DNA) in base alla loro curvatura. La sequenza di 10-mer ripetizione è TTTATCATCC per il C-DNA e TGACAGCAAC per la S-DNA. La curvatura complessiva di ciascuna di tali dsDNAs verificate dallo PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide), che è il metodo più utilizzato per stimare dsDNA curvatura 16,22. Figura 5 mostra che la S-DNA viene eseguito in modo simile al DNA della stessa dimensione nel DNA ladder (confrontare corsia 1 e 2 corsia in Figura 5). D'altra parte, il C-DNA mostra una dimensione apparente maggiore rispetto alla sua controparte nel DNA ladder (~ 1,2 più grande della sua dimensione reale, vedi corsia 1 e corsia 3). Questa osservazione indica che il C-DNA possiede una grande cu intrinsecarvature rispetto alla S-DNA.
La Figura 6 mostra una traccia tempo fluorescenza rappresentante della C-DNA (Figura 6A) e la corrispondente traccia FRET (Figura 6B). Rispetto alla S-DNA (Figure 4B e 4C), il C-DNA produce più eventi di alto FRET durante lo stesso periodo di tempo; il C-DNA loop 4 volte più frequentemente rispetto alla S-DNA durante lo stesso tempo di acquisizione (Figura 7). Questo risultato dimostra che la curvatura intrinseca del DNA può influenzare in modo significativo il ciclo dinamiche.
Per estrarre il fattore J dal tasso di loop, è necessario misurare la costante di velocità di secondo ordine indipendente dalla concentrazione per l'ibridazione tra due strapiombi scollegati. Una realizzazione di tale misura è illustrato nella Figura 8A. Ibridazione di oligo Cy3 al oligo Cy5 immobilizzato produce Cy5 raffiche di intensità a causa di agitarsi. Dal mea multiplarazioni con diverse concentrazioni Cy3-oligo (vedi Figura 8B), si possono estrarre in modo statisticamente robusto. Nel nostro esperimento, la costante di velocità di ricottura tra i due oligonucleotidi in NaCl 500 mM è stato determinato in 0,45 ± 0,04 x 10 6 M -1 s -1. Il fattore J è stata calcolata dividendo la velocità di loop (k loop) dalla costante secondo ordine tasso ricottura (annealing k '). E 'stato 61 ± 3 nM per il S-DNA e 265 ± 48 nM per il C-DNA. Il fattore J della S-DNA (Figura 9) è in buon accordo con le misure precedenti alla lunghezza simile 7.
Figura 1. Objective-tipo TIRFM. A) di eccitazione ottica. I 532 nm e 640 nm laser sono collimati separatamente in un simildiametro ar, fusa per incorporazione nella stessa strada da uno specchio dicroico, e si è concentrato su un piccolo specchio ellittico posto sotto l'apertura posteriore dell'obiettivo. E 'importante utilizzare una lente acromatica per la focalizzazione di minimizzare l'aberrazione cromatica. B) ottiche del microscopio. La posizione laterale dello specchio miniatura deve essere finemente regolata in modo che possa riflettere il fascio laser attraverso l'obiettivo mentre minimamente bloccando emissione di fluorescenza. Di conseguenza, deve essere montato su una piccola fase di traduzione. Un altro specchio sul lato opposto riflette il laser in uscita per evitare che penetri l'ottica di rilevamento. Al piano dell'immagine di fuori del corpo del microscopio, una fenditura regolabile viene posizionato per ritagliare l'immagine alla metà della dimensione dell'area di rilevamento del CCD. L'emissione di fluorescenza è divisa da uno specchio dicroico in due canali, e le lenti relè formano la seconda immagine sul CCD con ingrandimento 1:1. Uno degli specchi riflettenti è leggermente ruotata per compensare il donatoree le immagini accettore. Una banda ea filtri longpass sono utilizzati per ridurre lo sfondo nei canali donatore e accettore, rispettivamente. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Controllo della temperatura per esperimenti di singola molecola. La temperatura impostata (T s) è la lettura sul refrigeratore acqua / riscaldamento. La temperatura effettiva (T a) viene misurata con una termocoppia a contatto della superficie superiore del vetrino sul microscopio. La trama delle temperature reali contro sei differenti temperature impostate (quadrati neri) dimostra eccellente linearità (linea verde tratteggiata). La robustezza del regolatore è indicata da misurazioni a campione effettuate in tempi successivi (diamanti rossi). L'inserto è l'immagine della temperatura controlling unità e l'obiettivo nel loro assemblaggio finale. La linea rossa rappresenta una pendenza di unità. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. DNA Design. A) curvo dsDNA. A dsDNA 10-mer è rappresentato come un segmento di tubo ricurvo, e le due filamenti singoli come linee tratteggiate. L'asse elicoidale di qualsiasi DNA 10-mer non è perfettamente rettilinea, e quindi ogni concatenazione di tale un 10-mer porterà ad inclinazione incrementale dell'asse elicoidale nella stessa direzione. Questo effetto può essere sfruttato per generare un planare, molecola superelicoidale. B) preparazione basata sulla PCR di dsDNA. DNA a singolo filamento sono mostrati come una linea orizzontale. La loro curvatura reale non è raffigurato qui. Il segmento centrale in nero rappresenta la parte unica del frammento di DNA. Mostrati in grigio chiaro sono le sequenze adattatori comuni a tutte DNA utilizzati in questo studio. Primer 1 e 4 ricottura agli adattatori anteriori e posteriori, rispettivamente. Primer 2 è marcato con Cy3 al 5'-end. Primer 3 ha un tag biotina al terminale 5 'e un Cy5 collegati internamente. Le regioni azzurro del Primer 2 e 3 contengono sequenze complementari che funzionano finisce come appiccicose. O un plasmide o DNA genomico che contiene la sequenza di interesse è utilizzato come templato in due reazioni di PCR separate. È prodotto Cy3-marcato dsDNA usando primer 1 e 2, e Cy5 biotinilato DNA marcato viene prodotto utilizzando innesco 3 e 4. Questi due prodotti PCR sono riscaldati e raffreddati insieme per scambio filamento. Quattro diverse dsDNAs si formano, uno solo dei quali contiene Cy3, Cy5, e biotina. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4. Schema sperimentale. A) esperimento di FRET singola molecola. dsDNA molecole marcate con Cy3 (verde) da un lato e Cy5 (rosso), dall'altro, sono immobilizzati sulla PEG (polietilenglicole)-superficie rivestita. Looping reversibile e unlooping di dsDNAs traducono in alta FRET (loop) e bassa FRET (in loop) stati, rispettivamente. B) Un tipico traccia temporale singola molecola di donatore (verde) e accettore (rosso) intensità di fluorescenza. Gli stati FRET alti e bassi sono identificati come gli stati in loop e in loop, rispettivamente. Anche indicato è la prima volta loop che viene utilizzato per calcolare il tasso di loop. (Interno) Lo zoom-in figura mostra l'anti-correlazione delle intensità Cy3 e Cy5. C) Una traccia temporale di efficienza FRET calcolata da intensità donatore e accettore tracce in B. Figura 4B e
Figura 5. Elettroforesi su gel di poliacrilammide (29.2:0.8 acrilammide / bis-acrilamide, 5% in tampone TBE, pH 8,0) di DNA sintetico. Da sinistra a destra, le corsie contengono 1 kb di servirlo, il 186 bp DNA dritto e il 186 bp DNA curvo. Questa cifra è parzialmente adattato da una precedente pubblicazione 12 con il permesso. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 6. Tracce rappresentativi del DNA curvo (C-DNA) (A) e la sua traccia FRET corrispondente (B). Confronto dell'intensità e FRET tracce tra S-DNA (Figure 4B e 4C) e C-DNA (figure 6A e 6B) mostra chiaramente che il DNA curvo loop più frequentemente del DNA direttamente nelle stesse condizioni buffer. (Interno) La figura di zoom-in mostra l'anti-correlazione delle intensità Cy3 e Cy5. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 7. I tempi medi primi loop del rettilineo e le curve DNA. Ogni time è stato estratto da ~ 500 molecole in 5 campi diversi. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM) calcolato da tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 8. Determinazione della costante di velocità di ricottura da oligo ibridazione. A) Rappresentazione schematica della misurazione della frequenza di ricottura. Cy5 primer viene immobilizzato sulla superficie, e Cy3 primer è presente a 50-180 nM. Rilegatura e non vincolante del primer Cy3 a 50 nm si verificano in modo reversibile e portare a scoppi accettore rilevabili, che sono indicati nel riquadro. B) Il tasso di ricottura dipende linearmente dalla concentrazione di oligo libero. La pendenza della linea rappresenta la costante di secondo ordine tasso di ricottura (k Annea ' l). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 9 I fattori J del DNA rette e curve calcolate in nM Il fattore J è stato determinato sulla base di due measurables:... Il tasso loop del ciclo dsDNA e la costante di velocità ricottura degli strapiombi complementari libere Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
| Componente | Volume/50 reazione microlitri | Concentrazione finale |
| 36 microlitri | ||
| Tampone Phusion 5x | 10 microlitri | 1x |
| DNTP 10 mM | 1 ml | 200 pM ciascuno |
| Primer Forward (25 micron) | 1 ml | 0,5 micron |
| Primer reverse (25 micron) | 1 ml | 0,5 micron |
| Phusion hot start DNA polimerasi (2 U / ml) | 0,5 microlitri | 0.02 U / ml |
| DNA Template | 0,5 microlitri | ~ 1 ng |
Tabella 1. Miscela di reazione PCR. Il protocollo è ottimizzato per la DNA polimerasi Phusion. Gli articoli devono essere aggiunti in questo ordine.
| Fase del ciclo | Temperatura | Tempo | Numero di cicli |
| Denaturazione iniziale | "> 95 ° C30 sec | 1 | |
| Denaturazione | 95 ° C | 5 sec | 30 |
| Ricottura | 60 ° C | 10 sec | |
| Estensione | 72 ° C | 15 sec / kb | |
| Estensione finale | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 & #176; C | tenere |
Tabella 2. Istruzioni ciclismo PCR. La temperatura di ricottura è determinato sulla base delle temperature di fusione dei primer. Il tempo di estensione è ottimizzato per la DNA polimerasi Phusion.
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Discussion
Un semplice test single-molecule basato su FRET è stato usato per studiare la cinetica di loop di DNA di diverse forme intrinseche. DNA curve possono essere preparati ripetendo una sequenza di 10-mer in fase con il periodo elicoidale di 10,5 bp, e le curvature possono essere stimati usando PAGE. Questi dsDNAs sono progettati con le estremità adesive per permettere la stabilizzazione ciclo transitorio. Abbiamo estratto il tasso loop dalla crescita esponenziale del numero di molecole in loop nel tempo. La costante di velocità di ricottura tra i tratti di estremità appiccicose disconnesse viene utilizzato per determinare la concentrazione equivalente della densità di probabilità loop, che è conosciuto come il fattore J.
In un test DNA ligasi ciclizzazione base-, la misura di probabilità chiusura DNA è sensibile alla concentrazione ligasi, e il fattore J può essere sovrastimato se ligasi è eccessiva 9. Legame non specifico di DNA ligasi di DNA può anche influenzare il ciclo 10. Inoltre, Ligasattività e dipende sale e decade nel tempo. Così è difficile studiare loop DNA in condizioni non ottimali per l'attività ligasi. Al contrario, un saggio looping basato su FRET è libero da tutte queste preoccupazioni.
Il nostro protocollo sperimentale è simile a quella di Vafabakhsh e Ha 13 tranne due aspetti importanti che sono degni di discussione. Vafabakhsh e Ha 13 costruito le loro molecole dsDNA legando diversi oligonucleotidi sintetici. Sebbene l'errore (inserzione, delezione, o sostituzione) tasso ogni nucleotide in sintesi oligo è trascurabile (f 0,181%) 23, la frazione di sequenze di DNA non intenzionali aumenta linearmente con la lunghezza oligo. Pertanto, un campione duplex di 100 bp preparato da questo protocollo può contenere fino a ~ 33% duplex imperfette che possono risultare in una maggiore velocità di looping 24. In confronto, il protocollo utilizza reazione polimerasica a catena (PCR) per sintetizzare molecole dsDNA, che ha una fedeltà molto superiore Che DNAmosynthesis 25. Secondo i dati del costruttore, la polimerasi ad alta fedeltà abbiamo usato genererebbe una corretta molecola di DNA di 100 bp alla probabilità del 99,8% dopo 30 cicli di amplificazione PCR.
Un'altra differenza fondamentale tra i due studi è il sistema di immobilizzazione superficie. Nel nostro studio, molecole di DNA sono attaccate alla superficie attraverso le loro estremità, mentre nel protocollo da Vafabakhsh e Ha 13, esse sono attaccate mediante una base interna. È stato previsto che basata sull'effetto confinamento solo, un dsDNA bloccato internamente può ciclo più spesso di un dsDNA libero, fino ad un fattore di cinque a seconda della posizione di pinning interno 26. Pertanto, quando si misura il fattore J in funzione della lunghezza del profilo del DNA, pinning interno può introdurre variabilità inaspettato. E 'anche possibile che la base modificata con il linker ha una capacità di accoppiamento di basi deboli, che può risultare in un tasso più elevato di loop. Tuttavia, Despite queste apparenti differenze, i due protocolli producono fattori J analoghe a 100 bp (~ 3 Nm vs ~ 2 nm).
Questo saggio looping basato su FRET promettente per studiare una vasta gamma di fenomeni legati alla dsDNA looping compreso l'effetto di mismatch, scheggiature o lacune su dsDNA loop 27, l'effetto del DNA proteine vincolante per dsDNA looping, e la dipendenza dalla temperatura della dsDNA flessibilità. Questi argomenti sarebbero difficili da affrontare con la ciclizzazione base di ligasi convenzionale. Il saggio loop basato su FRET può anche essere usato per misurare il fattore J vs la lunghezza del profilo, che è il rapporto standard per testare i modelli polimerici. Tuttavia, il protocollo abbiamo presentato qui non è molto adatto a studiare loop di dsDNA più breve di 100 bp. Sotto questa lunghezza, dsDNA looping diventa estremamente lento, e quindi il tasso misurato sarà influenzato da altri processi involontari come photobleaching. Si può accelerare la cinetica di looping apparenti da noiing alta concentrazione salina ([Na +]> 500 mm), ma rilevanza fisiologica di tale misura diventa discutibile. Quindi, ricerca di dsDNA flessione a scale di lunghezza inferiori a 100 bp beneficerà di una ortogonale approccio alla analisi basate ciclizzazione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo James Waters, Gable Wadsworth e Bo Broadwater per criticamente la lettura del manoscritto. Ringraziamo anche quattro revisori anonimi per fornire commenti utili. Noi riconosciamo il sostegno finanziario Georgia Institute of Technology, il Burroughs Wellcome Fund Award Career l'interfaccia scientifico, e la borsa di rete di ricerca studente dalla NSF Fisica dei sistemi viventi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
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