Summary
Denne studien presenterer en detaljert eksperimentell prosedyre å måle looping dynamikken i dobbel-strandet DNA ved hjelp av single-molekyl fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET). Protokollen beskriver også hvordan du kan hente looping sannsynlighetstetthet kalt J-faktor.
Abstract
Bøying av dobbelt-trådet DNA (dsDNA) er forbundet med mange viktige biologiske prosesser slik som DNA, protein anerkjennelse og DNA-pakking i nucleosomes. Termodynamikk av dsDNA bøying har blitt studert av en metode som kalles syklisering som er avhengig av DNA ligase å kovalent bli korte klebrige endene av en dsDNA. Imidlertid kan ligation effektivitet påvirkes av mange faktorer som ikke er relatert til dsDNA looping slik som DNA-strukturen rundt de sammenkoblede klebrige ender, og ligase kan også påvirke den tilsynelatende looping hastighet gjennom mekanismer som for eksempel ikke-spesifikk binding. Her viser vi hvordan du kan måle dsDNA looping kinetikk uten ligase ved å oppdage forbigående DNA sløyfe dannelsen av FRET (fluorescens Resonance Energy Transfer). dsDNA molekyler er bygget ved hjelp av en enkel PCR-basert protokoll med en FRET pair og en biotin linker. Looping sannsynlighetstetthet kjent som J-faktor er hentet fra looping rente og annealing hastighet mellom to utkoblingted klebrige ender. Ved å teste to dsDNAs med forskjellige iboende kurva viser vi at den J-faktoren er følsom for den iboende form av dsDNA.
Introduction
Forstå de mekaniske egenskapene til dsDNA er av fundamental betydning i grunnleggende fag og tekniske applikasjoner. Strukturen i dsDNA er mer komplisert enn en rett spiral stige fordi roll, tilt, og vri vinkler mellom påfølgende basepar kan variere med sekvens. Termiske svingninger kan føre dsDNA å gjennomgå ulike moduser av konformasjonsforandringer svingninger som bøying, vridning og stretching. Overganger som smelte og knekking kan også oppstå under ekstreme forhold.
Blant disse bevegelser, har dsDNA bøying den mest merkbare biologiske innvirkning en. dsDNA bøyning er assosiert med genet undertrykkelse eller aktivering ved å bringe to fjerntliggende steder i nærheten av hverandre. Det spiller også en viktig rolle i DNA emballasjen i cellekjernen eller et viralt kapsid. Bøying deformasjon av dsDNA kan visualiseres eksperimentelt ved høy oppløsning mikroskopi (AFM 2 og TEM 3), og THERMODYNAmics og kinetikk kan studeres ved looping analyser, som kjemisk lenker inntilliggende områder av dsDNA.
En slik analyse er ligase avhengig syklisering fire. I denne analysen blir dsDNA-molekyler med "klebrige" (kohesive) ender sirkulariserte eller dimerisert ved DNA-ligase. Ved å sammenligne ratene sirkel og dimer-dannelse, kan man oppnå en effektiv molare konsentrasjon av den ene enden av DNA i nærheten av den andre ende, som er kjent som J-faktor. Denne J-faktoren er dimensjonelt ekvivalent til sannsynlighetstettheten for å finne den ene enden av DNA ved en kort avstand fra den andre enden, og således reflekterer fleksibilitet av DNA. Måling av J-faktor som en funksjon av DNA lengde avslører mange karakteristikker om DNA mekanikk inkludert utholdenhet lengde 4,5.
Ormen-lignende kjede (WLC) modell har blitt ansett som den kanoniske polymer modell for dsDNA mekanikk basert på sin suksess i forklaringining forlengelses kraft-kurver innhentet i DNA trekke eksperimenter 6, og riktig forutsi J faktorer av dsDNAs lenger enn 200 bp 7. Men ved å bruke cykliseringen analysen på dsDNA molekyler så kort som 100 bp, Cloutier og Widom målte J faktorer å være flere størrelsesordener høyere enn WLC modell prediksjon åtte. Et år senere, Du et al. produsert J faktorer i samråd med WLC modellen ved hjelp cykliseringen analysen med lavere konsentrasjoner av ligase og tilskrives den avvikende resultat fra Widom gruppen for høye ligase konsentrasjoner brukt ni. Denne kontrovers eksemplifiserer den uunngåelige innvirkning av DNA-ligase ved syklisering kinetikken ved hjelp av konvensjonell analyse 9.. Videre kan DNA-ligase også påvirke DNA struktur og stivhet gjennom ikke-spesifikk binding 10,11.
For å eliminere de tekniske bekymringene til protein-avhengige looping analyser, vi nylig demonstrert en protEin fritt looping analysen basert på fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) 12. I denne metoden, blir løkker konformasjonen detektert av FRET mellom donor-og akseptor festet i nærheten av de klebrige ender av et DNA-molekyl. En objektiv-type total intern refleksjon fluorescens mikroskop (TIRFM) brukes til å registrere baner av reversibel looping og unlooping hendelser fra overflate immobilisert én DNA-molekyler for en lengre periode. Denne metoden har PCR-basert montering av DNA-molekyler for å generere feiltilpasnings-fri DNA-molekyler, noe som er en viktig forbedring i forhold til en lignende metode med Vafabakhsh og Ha 13.. Den enkelt-molekyl aspekt av denne protokollen tillater måling av fordelingene i tillegg til ensemble gjennomsnitt mens FRET aspektet gjør det mulig å måle DNA looping dynamikk flere ganger fra det samme molekylet, selv under forhold som kan svekke ligase aktivitet.
Den TIRFM oppsettet er vist i figur 1. En tilpasset-Designet prøven scenen er plassert over en Olympus IX61 mikroskop kroppen. 532 nm og 640 nm lasere er innført fra siden og blir reflektert av ørsmå elliptiske speil 14 inn i den høye NA mål å oppnå kritisk innfallsvinkel på dekkglass-vann-grenseflaten. Vi merker oss at mer utbredt gjennom-objektiv TIR hjelp dichroic speil eller prisme-baserte TIR oppsett kan også brukes til dette FRET søknad. Fluorescens bilde dannet av mikroskopet er delt i donor-og akseptor-bilder av et dikroisk speil. De blir deretter gjen avbildet på to halvdeler av en EMCCD. Andre lang-pass emisjonsfiltre blir brukt for å redusere bakgrunnssignalet.
Temperaturkontroll er viktig for å skaffe reproduserbare kinetiske data. For temperaturkontroll er det formål skilt fra munnstykket av mikroskopet organ for å minimere varmeoverføring, og vann fra et temperaturkontrollert kjøle / varmeapparat blir sirkulert gjennom en messingkrage som er tett passerrundt den indre metall under objektivet jakke. Denne konfigurasjonen er i stand til å oppnå robust temperaturkontroll på dekkflaten mellom 15 og 50 ° C (figur 2). I dette arbeidet ble prøven temperaturen holdes på 24 ° C.
Følgende protokoll presenterer trinn-for-trinn prosedyre for DNA konstruksjon, estimering av DNA form, single-molekyl eksperiment, og J-faktor besluttsomhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. DsDNA Prøvepreparering
- Utform globalt bøyde DNA'er ved å gjenta en 10-mer-sekvensen. For eksempel, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'er et 186-bp DNA buet hvor X er en tilfeldig ekstra base og sekvensen som flankerer det gjentatte 10-mer-sekvensen er adaptersekvenser.
MERK:. I dette eksempelet to 10-mers med motsatte preferanser til nukleosom dannelse basert på en storstilt nukleosom belegg studie av Kaplan et al 15 ble valgt. Ettersom den spiralformede gjentakelse av dsDNA er nær 10 bp, vil noen netto avbøyning av det skruelinjeformede aksen av 10-mer akkumuleres for å produsere en form som en sirkulær bue (figur 3A). Ettersom den spiralformede perioden er nærmere 10.5 bp, er en ekstra basen settes inn etter hver to gjentakelser for å holde de buede struktur så plan som mulig. Disse sekvensene kortere enn 200 bp kan bestilles fra Companies at tilbudet genet syntese service. Det er praktisk å flanke disse sekvensene med felles adapter sekvenser for etterfølgende trinn. Prosedyren er skjematisert i figur 3B. - Utfør PCR med Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) og Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). MERK: Primer to er merket med FRET donor Cy3 på 5 'enden. En typisk PCR oppskrift og sykkel protokoll er presentert i tabell 1 og 2.
- Utfør PCR med Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) og Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). MERK: Primer 3 er merket med FRET akseptor Cy5 gjennom ryggraden, og biotin-linkeren på 5'-enden. PCR oppskrift og sykling protokollen er som ovenfor.
- Rense PCR produktene ved hjelp av en PCR opprydding kit.
- Bland Cy3-merket produkt og Cy5-merket produkt i et buffer for tråd veksling (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) ved sluttkonsentrasjoner på 0,4 &Nr. 181, M og 0,1 uM, respektivt. NB: Det overskytende Cy3-DNA øker konsentrasjonen av duplex bærer både Cy3 Cy5 og som et resultat av tråd utveksling.
- Veksling tråder av inkubering ved 98,5 ° C i 2 min, gradvis avkjøling til 5 ° C med rampe hastighet på 0,1 ° C / sek, og inkubering ved 5 ° C i 2 timer.
2. Gel elektroforese å oppdage dsDNA Curvature
- Hell polyakrylamidgel 16,17 ved blanding av akrylamid og bis-akrylamid-løsninger ved 29.2:0.8 ratio, 5% (w / v) i 1X Tris / borat / EDTA (TBE)-buffer ved pH 8,0. Merk: 10 ml av gel-løsning inneholder: 1,217 ml 40% akrylamid, 0,667 ml 2% bis-akrylamid, 1 ml TBE 10X, er 100 l ammoniumpersulfat (APS) 10%, 10 L TEMED, og resten dH 2 O. Fullstendig størkning av gelen tar omtrent 30 min.
- Legg polyakrylamidgel med DNA-prøver og DNA stigen i 1X lastebuffer (5% glycerol, 0,03% (w / v) bromfenol blue) og kjøre gel på 5-8 V / cm ved 4 ° C i 45 minutter eller inntil fargestoffet fram nærmer seg enden av gelen.
- Flekk gelen ved hjelp 1X TBE-buffer som inneholder 0,5 g / ml etidiumbromid i 30 min. Identifisere DNA band under UV-belysning. Sammenlign band posisjoner med størrelsen markør (100 bp DNA-stige) å beregne den tilsynelatende størrelser av DNA-molekyler. MERK: Buet DNAS generelt bevege seg saktere enn rette DNAS.
Tre. Flow Cell Forberedelse
- Bor 6-7 par av hullene langs to motstående kanter av en glass-slide (3'' x 1'') ved hjelp av en drill trykk og diamant borekroner. Etter boring, gni raset i rennende vann for å fjerne synlig glass pulver. MERK: Hullene tjene som perfusjon innløp og utløp. Under boring, avkjøling glide med vann er viktig for å hindre sprekkdannelse.
- Plasser lysbildene oppreist i en glasskrukke og fyll den med vann. Sonicate i 15 min, og overføre dem til en annen glasskrukke dedicated for aceton rengjøring. Fyll den med aceton og sonicate i 15 min. Vask objektglassene med etanol ved hjelp av en sprayflaske, og deretter med vann. Legg dem i en polypropylen krukke, fyll den med 5 M kaliumhydroksid, og sonicate for 15 min. Endelig sonicate lysbildene i vann i 15 min. Rens Dekk (nr. 1, 24 x 40 mm) med den samme protokollen. MERK: Rensede lysbilder og dekkglass kan lagres i dH 2 O for langsiktig bruk.
- Bland 1 mg biotin-PEG-silan (MW 3400) med 80 mg av mPEG-silan (MW 2000) i 340 L av 0,1 M natrium-bikarbonat-løsning. Bland godt og sentrifuger blandingen kort for å kvitte seg med bobler. BEMERK: funksjonalisering av overflaten med polyetylenglykol (PEG) bidrar til å redusere ikke-spesifikk binding av DNA til overflaten.
- Sett 80 L av PEG løsning på hvert lysbilde og forsiktig senke et dekkglass over det. Vent i 45 min. Separer dekkglass fra raset med pinsett, skyll dem med store mengder dH 2 O og la them tørr i friluft.
- Plasser tynne strimler av dobbel-stick tape over lysbildet å danne kanaler. Juster et dekk over det og trykk den godt dekk mot raset for å danne vanntette kanaler. Bruk 5 minutter epoxy for å forsegle kantene av kanalene.
4. Utarbeidelse av Trolox Solution
- Sett ~ 30 mg Trolox og 10 ml dH 2 O i en kolbe og bruke en magnet oppsikt bar å røre løsningen i friluft for 18 hr.
- Filtrer løsningen ved hjelp av et 0,2 mikrometer filter og justere pH til 7 ved tilsetning av ~ 6 pl av 1 M Tris basen (pH 11). Merk: Trolox er en anti-blinkende reagens som vanligvis brukes i single-molekyl studerer 18. Den antifading handling av Trolox kommer fra sin oksidert derivat som er til stede i delvis degradert Trolox løsning 19. Raskt oppløsende Trolox i metanol eller høy pH Tris-løsning bør unngås på grunn av ineffektiv oksidasjon.
5. Single-molecule Imaging
- Injiser 15 mL av NeutrAvidin-løsning (0,5 mg / ml) inn i kanalen, og vente på 2 min før skylling med 100 mL av T50-buffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,0).
- Injiser 50 ul av DNA-prøve (50-100 pM) inn i kanalen. Vent i 5 minutter og skyll det ubundne DNA bort med 100 L av T50-buffer. MERK: DNA-molekyler vil spesifikt binde til overflaten gjennom NeutrAvidin-biotin interaksjon.
- Fyll kanalen med bildebuffer som inneholder en oksygenfjemende system 20 (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox, og 500 mM NaCl).
- Sett EMCCD i ramme-overføringsmodus til å streame 2 x 2 binned bilder (256 x 256) til datamaskinen ved 25 bilder per sekund.
- Sett immersjonsolje på mikroskop mål, og fikse strømningscellen på mikroskopet scenen ved hjelp av prøveklipp. Grov justere fokus ved å se på laser refleksjon mønster på veggen. Finjustere fokus ved hjelp av live view av fluorescens imaldre på skjermen.
- Begynn datainnsamling med 532 nm laser på. Sjekk live view og justere fokus hvis det er nødvendig. Stopp datainnsamling når de fleste molekyler har photobleached.
MERK: I dette anlegget, er en lab-skrevet C-program for å styre mikroskopet og vise levende bilder på skjermen som de er lagret på harddisken som brukes.
6. Bildebehandling og dataanalyse
MERK: En tidsserie av 256 x 256 bilder blir behandlet av en MATLAB-kode for å generere single-molekyl tids spor av Cy3 og Cy5 intensiteter. Slik parer piksler mellom donor-kanalen og akseptor kanalen av split-view image, 6-7 par Cy3 og Cy5 flekker, hvert par fra samme molekylet jevnt spredt over hele synsfeltet, blir manuelt plukket, og en affine transformasjonen beregnes ved hjelp av koordinatene for disse plassene som ankerpunkt.
- Ved hjelp av en MATLAB skript, se gjennom alle single-molekyl tid sporer that vise flere overganger mellom lave og høye FRET signaler. Identifiser løkker og unlooped stater.
MERK: FRET-signalet er definert som Cy5 intensiteten (I a) dividert med summen av Cy3 Cy5 og intensiteter (I a + I d). Loopet staten har høy FRET verdi mens unlooped staten har lav FRET verdi. Histogrammet av FRET signaler fra en enkelt molekyl er bimodally distribuert på grunn av reversibel looping og unlooping. - Finn terskelen som skiller de to fordelingene ved å bestemme skjæringspunktet mellom de to utstyrt Gaussisk kurver.
- Beregn FRET effektivitet som
og tilordne løkker stater med høy FRET verdier og de unlooped stater med lav FRET verdier. - Ved hjelp av en MATLAB script, analysere den kumulative antall molekyler (N (t)) som løkker (ellernådde den høye FRET stat) ved ulike tidsbortfaller siden starten av datainnsamlingen. MERK: Siden en dsDNA molekyl kan starte i noen konformasjon av unlooped staten ved starten av datainnsamlingen, veksttakten i den løkke befolkningen reflekterer gjennomsnittlig looping hastighet midlet over innledende konformasjoner. Pakk ut looping rente k løkke ved å montere N (t) med en eksponentiell funksjon:
Hvis økninger biphasically, kan den utstyres med en dobbel eksponentiell funksjon: 
I dette tilfellet er k sløyfe erholdt fra: 
MERK: Teoretisk, er overlevelsen sannsynligheten for at en polymer ikke har loopet på tidspunkt t ikke en enkel eller dobbel eksponentiell funksjon 12. Eksponentiell fitting er brukt som en praktisk måte for å trekke ut den gjennomsnittlige looping tid.
og tilordne løkker stater med høy FRET verdier og de unlooped stater med lav FRET verdier. 
Hvis økninger biphasically, kan den utstyres med en dobbel eksponentiell funksjon: 
I dette tilfellet er k sløyfe erholdt fra: 
MERK: Teoretisk, er overlevelsen sannsynligheten for at en polymer ikke har loopet på tidspunkt t ikke en enkel eller dobbel eksponentiell funksjon 12. Eksponentiell fitting er brukt som en praktisk måte for å trekke ut den gjennomsnittlige looping tid. 7. Bestemme J Factor
MERK: J faktoren angir hvor konsentrert ene ende av en dsDNA er rundt den andre ende. Det kan fastslås ved å interpolere den konsentrasjon av den ene ende segment av DNA som vil produsere den samme reaksjonshastighet med den andre endesegment som målt sløyfefrekvens. Eksperimentelt, er den ene ende segment immobilisert på overflaten, og den andre endesegment innføres ved en viss konsentrasjon c. Hvis den målte annealing frekvensen mellom de to endene er k anneal, blir deretter den J-faktor 21 gitt av 
. Den annealing Hastighetskonstanten (k anneal = k anneal / C) er uavhengig av sonden konsentrasjon.
- Flow 20 mL av 30-50 pM biotin-Cy5 oligo (Primer 3) jegnto en NeutrAvidin belagt kanal. Skyll kanal med 100 pl T50 for å vaske bort ikke-bundne oligoer.
- Klargjør bildebuffer som beskrevet i del 5 med tillegg av Cy3 oligo (Primer 2) ved en sluttkonsentrasjon på 50 nM. Flow denne bildebuffer inn i kanalen.
- Mens du holder den 532 nm laser på, kort snu 640 nm laser på å identifisere steder av overflate-bundet Cy5 oligos. Slå av 640 nm laser og begynne å overvåke FRET signal.
MERK: Ved hybridisering av en Cy3 oligo til en overflate-bundet Cy5 oligo, vil Cy5 fluorescens oppstå fra FRET. - Ved hjelp av en MATLAB script, analysere antallet molekyler som starter i ubundet tilstand (lav Cy5 intensitet), men senere omdannes til herdet tilstand (høy Cy5 intensitet) som en funksjon av tid fra Cy5 intensitets spor.
- Plott dette nummeret av glødet molekyler vs tid. Monter denne kurven med en enkelt eksponentiell funksjon (
(k anneal). - Gjenta dette forsøk ved forskjellige Cy3 oligo-konsentrasjoner (60, 100 og 180 nM) for å bekrefte linearitet mellom annealing frekvensen og reaktant-konsentrasjonen. Pakk den andre-order annealing hastighetskonstanten (k anneal ) Fra skråningen.
- Beregn J faktor fra
, Hvor k sløyfe er sløyfefrekvens målt i den samme buffer tilstand.
(k anneal). 
, Hvor k sløyfe er sløyfefrekvens målt i den samme buffer tilstand. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA-molekyler som benyttes til looping studie består av en duplex-regionen i variabel sekvens, og lengde-og enkelt-trådede overheng som er komplementære til hverandre. De overheng, som er 7-basen lang, kan varmebehandles til hverandre for å fange opp den bøyde tilstand. Hver overheng inneholder enten Cy3 eller Cy5 som er koblet i DNA-ryggraden gjennom amidite kjemi. Den Cy5-overheng er også knyttet til biotin-TEG (15-atom Tetra-etylenglykol spacer) for overflate immobilisering (se figur 4A). Alle disse modifikasjoner kan inngå i dsDNA følge en PCR-basert protokoll (Protokoll 1 og figur 3B). Den valgte lengden og rekkefølgen av de overheng fungere godt å gi målbare og reversible FRET hendelser i normale eksperimentelle forhold. Den looping og unlooping kinetikken av DNA sløyfen er følsomme overfor omgivelsestemperaturen, og derfor er avgjørende for reproduserbarhet en temperaturregulator. En slik controller kan lett innlemmes i mikroskop (figur 2).
Ved hjelp TIRFM, anti-korrelert svingninger Cy3 (donor) og Cy5 (akseptor) signaler fra overflate immobilisert dsDNA-molekyler ble observert (Figur 4B). I den bøyde tilstand, er avstanden mellom to fargestoffer som er mindre enn 5 nm, noe som ville resultere i høye Cy5 signal og lav Cy3 signal på grunn av høy virkningsgrad FRET (figurene 4A og 4C). Flere kontroll-eksperimenter ble utført for å bevise at den høye FRET tilstanden representerer den bøyde tilstand. Levetiden av den høye FRET tilstand økte med økende overheng lengde, noe som tyder på at høye FRET tilstanden stabiliseres ved baseparing mellom de to overheng. Levetiden til høy FRET staten også redusert med synkende DNA lengde, noe som er forventet fordi loop fri energi øker som sløyfen blir mindre 12. Basert på dette beviset, høy og lav FRET states kan tildeles til de løkker og unlooped stater, henholdsvis.
For å teste effekten av indre krumning av dsDNA i sløyfe, ble to 186 bp dsDNAs med forskjellige kurvaturer konstruert, som er kalt "straight" (S-DNA) og "buet" (C-DNA) basert på deres krumning. Den gjentatte 10-mer-sekvensen er TTTATCATCC for C-DNA og TGACAGCAAC for S-DNA. Den totale krumning av hver av disse dsDNAs ble undersøkt ved PAGE (polyakrylamidgel-elektroforese), som er den mest brukte metode for å estimere dsDNA kurvatur 16,22. Figur 5 viser at S-DNA-løper på samme måte som DNA av samme størrelse i DNA-stige (sammenlign felt 1 og felt 2 i figur 5). På den annen side viser den C-DNA større tilsynelatende størrelse i forhold til sitt motstykke i DNA-stige (~ 1,2 større enn den virkelige størrelse, se kolonne 1, og felt 3). Denne observasjonen tyder på at C-DNA i besittelse av en større indre curvature enn S-DNA.
Figur 6 viser et representativt fluorescens tid spor fra det C-DNA (figur 6A), og det tilsvarende spor FRET (figur 6B). Sammenlignet med S-DNA (Tall 4B og 4C), C-DNA produserer mer høy FRET begivenheter i samme tidsrom; C-DNA-sløyfer 4-ganger hyppigere enn den S-DNA i løpet av samme registreringstid (figur 7). Dette resultatet demonstrerer at indre krumning av DNA kan påvirke looping dynamikk betydelig.
For å trekke ut J faktor fra looping rente, må man måle konsentrasjonen uavhengig andre-order hastighetskonstanten for hybridisering mellom to løsrevne overheng. En realisering av en slik måling er vist i figur 8A. Hybridisering av Cy3 oligo til immobilisert Cy5 oligo produserer Cy5 intensitet bursts grunn til å ergre. Fra flere meaaging med forskjellige Cy3-oligo-konsentrasjoner (se figur 8B), kan man trekke i en statistisk robust måte. I våre forsøk ble annealing hastighetskonstanten mellom de to oligoer i 500 mM NaCl bestemt til å være 0,45 ± 0,04 x 10 6 M -1 -1 sek. Den J-faktor ble beregnet ved å dividere looping hastighet (k loop) av det andre-ordens annealing hastighetskonstanten (k 'anneal). Det var 61 ± 3 nM for S-DNA og 265 ± 48 nM for C-DNA. Den J-faktor av S-DNA (figur 9) er i virkelig overensstemmelse med tidligere målinger ved tilsvarende lengde 7..
Figur 1. Objective-type TIRFM. A) Eksitasjon optikk. De 532 nm og 640 nm lasere er kollimert separat til en similar diameter, fusjonert inn i samme bane av en dichroic speil, og fokusert på en liten elliptisk speil plassert under målet tilbake blenderåpning. Det er viktig å bruke en akromatisk linse for å fokusere for å minimere kromatisk aberrasjon. B) Mikroskop optikk. Den sideveis plassering av miniatyr speilet må finjusteres slik at den kan reflektere laserstrålen gjennom målet, mens minimal blokkering av fluorescensemisjonen. Derfor må den være montert på en liten translasjon stadium. Et annet speil på motsatt side gjenspeiler den utgående laser for å hindre at det kommer inn i deteksjons optikk. I bildeplanet utenfor mikroskop kroppen, er en justerbar sliss egnet til å tilpasse bildet til halve størrelsen av registreringsområdet av CCD. Den fluorescensemisjonen er delt av et dikroisk speil inn i to kanaler, og releet linser danne det andre bildet på CCD med 1:1 forstørrelse. En av de reflekterende speil er svakt roteres for å kompensere for donorog akseptor bilder. En båndpass og en longpass filtre brukes til å redusere bakgrunnen i donor og akseptor kanaler, henholdsvis. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Temperaturregulering for single-molekyl eksperimenter. Den innstilte temperaturen (T s) er lesing på vannkjøleren / varmeapparat. Den virkelige temperatur (T a) er målt ved et termoelement i kontakt den øvre overflate av dekkglass på mikroskopet. Handlingen i de faktiske temperaturene vs seks forskjellige set temperaturer (svarte firkanter) viser svært god linearitet (grønn stiplet linje). Robustheten kontrolleren er vist ved tilfeldige målinger gjort på senere tidspunkt (røde ruter). Det innfelte er bildet av temperatur controlling enhet og objektiv i sin sluttmontering. Den røde linjen representerer en skråning av enhet. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. DNA Design. A) Buet dsDNA. En 10-mer dsDNA er representert som et buet rør-segmentet, og de to enkle tråder som stiplede linjer. Den spiralformede akse i alle 10-mer-DNA ikke er fullstendig rett, og dermed hver sammensetning av et slikt 10-mer vil føre til inkremental helnings til den heliksformede akse i samme retning. Denne effekten kan utnyttes til å generere en plan, superhelical molekyl. B) PCR-basert utarbeidelse av dsDNA. Enkelt-strandet DNA-molekyler er vist som en horisontal linje. Deres krumningen er ikke avbildet her. Den sentrale delen i svart representerer unike delen av DNA-fragmentet. Vist i lysegrå er adaptersekvenser som er felles for alle DNA-molekyler brukt i denne studien. Primer 1 og 4 anneal til de foran og bak adaptere, henholdsvis. Primer 2 er merket med Cy3 på 5'-enden. Primer 3 har et biotin-koden på 5'-enden og en internt koblet Cy5. De lyseblå regionene Primer 2 og 3 inneholder komplementære sekvenser som fungerer som klebrige ender. Enten et plasmid eller genomisk DNA som inneholder sekvensen av interesse er brukt som mal i to separate PCR-reaksjoner. Cy3-merket dsDNA blir produsert ved bruk av primer 1 og 2, og biotinylert Cy5-merket DNA blir fremstilt ved hjelp av primer 3 og 4. Disse to PCR-produkter er oppvarmet og avkjølt sammen for tråd utveksling. Fire forskjellige dsDNAs er dannet, bare en av dem inneholder Cy3, Cy5, og biotin. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4 Experimental ordningen.. A) Single-molekyl FRET eksperiment. dsDNA-molekyler som er merket med Cy3 (grønn) på den ene side og Cy5 (rød) på den andre siden er immobilisert på PEG (polyetylenglykol)-belagte overflate. Reversibel looping og unlooping av dsDNAs resultere i høy FRET (løkker) og lav FRET (unlooped) stater, henholdsvis. B) En typisk single-molekyl tid spor av donor (grønn) og akseptor (rød) fluorescensintensiteter. De høye og lave FRET stater er identifisert som løkker og unlooped stater, henholdsvis. Også angitt er den første sløyfe tid som brukes til å beregne den sløyfefrekvens. (Innfelt) The zoom-in Figuren viser den anti-korrelasjon av Cy3 og Cy5 intensiteter. C) En gang spor av FRET effektivitet beregnet fra donor og akseptor intensitet spor i B. Figur 4B og
Figur 5. Polyakrylamidgelelektroforese (29.2:0.8 akrylamid / bis-akrylamid, 5% i TBE buffer, pH 8,0) av syntetiske DNA-molekyler. Fra venstre til høyre, banene inneholder en kb markør, den 186 bp Rett DNA og 186 bp Buet DNA. Dette tallet er delvis tilpasset fra en tidligere publikasjon 12 med tillatelse. Klikk her for å se større bilde.
Figur 6. Representative spor fra den buede DNA (C-DNA) (A) og den tilsvarende FRET spor (B). Sammenligning av intensiteten og FRET spor mellom S-DNA (figurene 4B og 4C), og C-DNA (Fig. 6A og 6B) viser klart at den krumme DNA løkker hyppigere enn den rette DNA i den samme buffer tilstand. (Innfelt) The zoom-in Figuren viser den anti-korrelasjon av Cy3 og Cy5 intensiteter. Klikk her for å se større bilde.
Figur 7. Middelverdien første looping tider av rette og buede DNAS. Hver time ble hentet fra ~ 500 molekyler i fem ulike felt. De feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se større bilde.
Figur 8. Bestemme annealing rente konstant fra oligo hybridisering. A) Skjematisk oversikt over annealing måling. Cy5 primer immobiliseres på overflaten, og Cy3 primer er til stede ved 50 til 180 nM. Binding og uforpliktende av Cy3 primer på 50 nM skje reversibelt og føre til detekterbare akseptor bursts, som er vist i den innfelte. B) Den annealing frekvensen avhenger lineært av konsentrasjonen av den frie oligo. Helningen på linjen representerer den andre-order annealing hastighetskonstanten (k 'Annea l). Klikk her for å se større bilde.
Figur 9 J faktorer av de rette og buede DNAS beregnet i NM J-faktor ble fastsatt på grunnlag av to measurables:... Looping rente av dsDNA sløyfe og annealing hastighetskonstanten av de frie komplementære overheng Klikk her for å se større bilde .
| Komponent | Volume/50 mL reaksjon | Endelig konsentrasjon |
| 36 mL | ||
| 5x Phusion buffer | 10 ul | 1x |
| 10 mM dNTPs | 1 mL | 200 uM hver |
| Forward primer (25 mm) | 1 mL | 0,5 mikrometer |
| Reverse primer (25 mm) | 1 mL | 0,5 mikrometer |
| Phusion varm start DNA polymerase (2 U / mL) | 0,5 mL | 0,02 U / mL |
| Mal DNA | 0,5 mL | ~ 1 ng |
Tabell 1. PCR reaksjon mix. Protokollen er optimalisert for Phusion DNA polymerase. Elementer bør legges i denne rekkefølgen.
| Cyklustrinn | Temperatur | Tid | Antall sykluser |
| Initial denaturering | "> 95 ° C30 sek | 1 | |
| Denaturering | 95 ° C | 5 sek | 30 |
| Annealing | 60 ° C | 10 sek | |
| Extension | 72 ° C | 15 sek / kb | |
| Endelig forlengelse | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 & #176, C | hold |
Tabell 2. PCR sykkel instruksjoner. Annealing temperaturen fastsettes basert på smeltetemperaturer på primere. Forlengelsen tid er optimal for den Phusion DNA polymerase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel enkelt-molekylet assay basert på FRET ble brukt til å studere kinetikken for looping DNA'er av forskjellige iboende former. Sving DNA-molekyler, kan fremstilles ved å gjenta en 10-mer-sekvens i fase med det skruelinjeformede periode på 10,5 bp, og deres krumninger kan estimeres ved hjelp av PAGE. Disse dsDNAs er utformet med klebrige endene til å tillate forbigående sløyfe stabilisering. Vi pakket ut looping sats fra den eksponentielle økningen i antall løkker molekyler over tid. Den annealing hastighetskonstanten mellom de frakoplede klebrige endesegmentene blir brukt til å bestemme konsentrasjonen ekvivalent av looping sannsynlighetstetthet, noe som er kjent som J-faktor.
I en ligase baserte DNA cyklisering analysen, er måling av DNA lukke sannsynlighet følsom for ligase konsentrasjon, og J-faktoren kan bli overestimert hvis ligase er overdreven 9.. Ikke-spesifikk binding av DNA-ligase til DNA kan også påvirke løkker 10.. Videre Ligase-aktivitet, avhenger av salt og avtar over tid. Således er det vanskelig å undersøke DNA looping i suboptimale betingelser for ligase aktivitet. I motsetning til dette er et FRET-assay basert looping fri for alle disse problemer.
Vår eksperimentelle protokollen er lik som Vafabakhsh og Ha 13 unntatt to viktige aspekter som er verdig diskusjon. Vafabakhsh og Ha 13 konstruert sine dsDNA molekyler av liga flere syntetiske oligos. Selv om feilen (innsetting, sletting, eller substitusjon) satsen per nukleotid i oligo syntese er ubetydelig (f 0,181%) 23, den brøkdel av utilsiktede DNA-sekvenser øker lineært med oligo lengde. Derfor kan en 100-bp duplex prøve utarbeidet av denne protokollen inneholde opp til ~ 33% ufullkomne tomannsboliger som kan resultere i høyere looping sats 24. Til sammenligning bruker vår protokoll polymerase chain reaction (PCR) for å syntetisere dsDNA molekyler, som har en mye høyere kvalitet enn DNA chemosynthesis 25. Ifølge produsentens data, ville det hi-fi-polymerase brukte vi generere en korrekt 100-bp DNA-molekyl på 99,8% sannsynlighet etter 30 sykluser med PCR-amplifikasjon.
En annen viktig forskjell mellom de to studiene er overflaten immobilisering ordningen. I denne studien, er DNA-molekyler festet til overflaten via sine ender, mens det i protokollen ved Vafabakhsh Ha og 13, er de festet ved hjelp av en intern base. Det ble spådd at basert på den innesperring effekt alene, kan en internt låste dsDNA sløyfe oftere enn en gratis dsDNA, opp til en faktor på fem avhengig av plasseringen av interne låsing 26. Derfor, ved måling av J-faktor som en funksjon av DNA kontur lengde, kan interne låsing innføre uventet variasjon. Det er også mulig at den modifiserte basen med linkeren har en svakere base sammenkobling evne, noe som kan resultere i en høyere looping hastighet. Men despite disse tilsynelatende forskjeller, de to protokollene produsere lignende J faktorer på 100 bp (~ 3 nM vs ~ 2 nM).
Denne FRET-assay basert looping holder løftet for å studere en rekke fenomener relatert til dsDNA looping inkludert effekten av uoverensstemmelser, hakk eller hull på dsDNA løkker 27, virkningen av DNA-bindende proteiner på dsDNA looping, og temperaturavhengigheten til dsDNA fleksibilitet. Disse emnene vil være vanskelig å løse med den konvensjonelle ligase baserte cyklisering. Den FRET-baserte looping Målingen kan også brukes til å måle J-faktor vs konturen lengde, noe som er standard for å teste forholdet polymer modeller. Men protokollen vi presenteres her er ikke godt egnet til å studere looping av dsDNA kortere enn 100 bp. Under denne lengden, blir dsDNA looping ekstremt treg, og derfor den målte hastigheten vil bli påvirket av andre utilsiktede prosesser som fotobleking. Man kan akselerere den tilsynelatende looping kinetikk av ossing med høy salt-konsentrasjon ([Na +]> 500 mM), men fysiologiske betydningen av en slik måling blir tvilsom. Derfor vil etterforskningen av dsDNA bøying på lengdeskala under 100 bp dra nytte av en tilnærming vinkelrett syklisering-baserte analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker James Waters, Gable Wadsworth og Bo Broad for kritisk lesing av manuskriptet. Vi takker også fire anonyme anmeldere for å gi nyttige kommentarer. Vi erkjenner økonomisk støtte fra Georgia Institute of Technology, Burroughs Wellcome Fund Career Award på Scientific Interface, og studenten forskningsnettverket stipend fra NSF Physics of Living Systems.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).
