Summary
Это исследование представляет подробный экспериментальную процедуру для измерения динамики Зацикливание двухцепочечной ДНК с использованием одиночных молекул флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET). Протокол также описывает, как извлечь циклическую плотность вероятности называемый фактор J.
Abstract
Гибка двухцепочечной ДНК (дцДНК) связана со многими важными биологическими процессами, такими как признание ДНК-белок и ДНК упаковки в нуклеосом. Термодинамика днДНК изгиба была изучена с помощью метода циклизации которая опирается на ДНК-лигазы ковалентно присоединиться короткие липкие концы двухцепочечной ДНК. Тем не менее, эффективность перевязки может зависеть от многих факторов, не связанных с двухцепочечной ДНК цикла, таких как структуры ДНК, окружающей присоединились липкие концы, и лигазы также может повлиять на видимую скорость перебора таких механизмов, как неспецифическое связывание. Здесь мы покажем, как измерить дцДНК LOOPING кинетики без лигазы путем обнаружения переходных образование петли ДНК по FRET (флуоресценции резонансный перенос энергии). дц-молекул ДНК построены с использованием простой ПЦР на основе протокола с парой рвать и биотин линкера. Цикла плотность вероятности известны как фактор J извлекается из перекручивания скорости и скорости отжига между двумя выключениеТед липкие концы. Тестируя два dsDNAs с различными внутренними кривизны, мы покажем, что фактор J чувствителен к внутренней форме двухцепочечной ДНК.
Introduction
Понимание механических свойств двухцепочечной ДНК имеет принципиальное значение в основных инженерных приложений наук и. Структура двухцепочечной ДНК является более сложным, чем прямой винтовой лестнице, потому что углы крена, наклона и поворот между последовательными парами оснований могут варьироваться в зависимости от последовательности. Тепловые флуктуации могут привести к двухцепочечной ДНК пройти различные режимы конформационных колебаний, таких как гибка, скручивание и растяжение. Переходы, такие как плавление и изгибов может также происходить в экстремальных условиях.
Среди этих движений, двухцепочечной ДНК изгиб имеет наиболее заметное биологическое воздействие 1. дцДНК изгиба связано с репрессии генов или активации путем приведения два отдаленных местах близко друг к другу. Он также играет важную роль в упаковке ДНК внутри ядра клеток или вирусного капсида. Гибка деформация дцДНК могут быть визуализированы экспериментально путем микроскопии высокого разрешения (АСМ 2 и 3 ТЕА) и thermodynAmics и кинетика могут быть изучены с помощью цикла анализов, которые химически связывают Juxtaposed сайты в двухцепочечной ДНК.
Один из таких анализов является лигазы зависит от циклизации 4. В этом анализе дц-молекул ДНК с "липкими" (липких) концах замыкают в цикл или димеризована ДНК-лигазы. Сравнивая показатели окружности и образование димера, можно получить эффективную молярную концентрацию одного конца ДНК в непосредственной близости от другого конца, который известен как фактор J. Этот фактор J по размерам эквивалентен плотности вероятности нахождения один конец ДНК на небольшом расстоянии с другого конца, и, таким образом, отражает гибкость ДНК. Измерение коэффициента J как функция длины ДНК показывает, многие характеристики около механики ДНК включая длину настойчивость 4,5.
Червеобразные цепи (WLC) модель была широко рассматривается как канонического полимерной модели для двухцепочечной ДНК механики на основе его успеха в объяснениеining кривых сила-расширения, полученных в ДНК потянув экспериментов 6, и правильно предсказывать факторы J из dsDNAs дольше, чем 200 б.п. 7. Тем не менее, с помощью циклизации анализа на дц-молекул ДНК в виде коротких, как 100 б.п., Cloutier и Уидома измеряется факторы J быть на несколько порядков выше, чем предсказания WLC модель 8. Через год, Du и др.. производится J факторы в согласии с моделью WLC с помощью циклизации анализа с более низкими концентрациями лигазы и отнести аномальную результат из группы Уидома высоких лигазы концентрациях используется 9. Это противоречие является примером неизбежный влияние ДНК-лигазы на циклизации кинетики при использовании обычной анализа 9. Кроме того, ДНК-лигазы может также повлиять на структуру ДНК и жесткость через неспецифическое связывание 10,11.
Для устранения технических проблем белковых зависит от циклической обработки анализов, мы недавно продемонстрировали протЭйн-бесплатно петлеобразование анализ, основанный на флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET) 12. В этом методе петлей конформации обнаруживаются FRET между донором и акцептором прикрепленным вблизи липких концов молекулы ДНК. Объективная типа полное внутреннее отражение флуоресценции микроскоп (TIRFM) используется для записи траектории обратимого циклов и unlooping событий из поверхностных иммобилизованными одной молекулы ДНК в течение длительного периода времени. Этот метод имеет ПЦР на основе сборку молекул ДНК для создания несоответствия без молекулы ДНК, что является одним из важнейших улучшение по сравнению с аналогичным методом по Vafabakhsh и Ха 13. Аспект одной молекулы этого протокола позволяет измерение распределений в дополнение к ансамблю в то время как сторона FRET позволяет измерять динамику Циклическое ДНК повторно с той же молекуле, даже в условиях, которые могут ухудшить лигазы активность.
Установка TIRFM показано на рисунке 1. ПользовательскийПродуманные этап образец помещают над микроскопа тела Olympus IX61. 532 нм и 640 нм лазеры введена со стороны, и отражаются от крошечных эллиптических зеркал 14 в высокой цели НС для достижения критического угла падения на поверхности раздела покровное воды. Отметим, что более широкое распространение сквозного цель TIR помощью дихроичных зеркал или призмы на основе МДП установок также могут быть использованы для этой FRET применения. Флуоресценции изображение, сформированное микроскопом разделен на донорных и акцепторных изображений по дихроичного зеркала. Затем они вновь отображены на двух половинок EMCCD. Дополнительные фильтры выбросов длинный-проход используются для уменьшения фонового сигнала.
Контроль температуры имеет важное значение для получения воспроизводимых кинетических данных. Для контроля температуры, цель отделена от носика тела микроскопа чтобы свести к минимуму передачу тепла и воды из контролируемой температурой холодильной отопителя / циркулирует через латунной воротник, который плотно облегаетвокруг внутренней металла под объективной куртки. Эта установка способна добиться надежного контроля температуры в покровное поверхности между 15 и 50 ° С (рис. 2). В этой работе, температура образца поддерживалась на уровне 24 ° С.
Следующий протокол представляет шаг за шагом процедуры для строительства ДНК, оценка формы ДНК, эксперимента одиночных молекул и определения коэффициента J.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка днДНК Образец
- Дизайн глобально изогнутые ДНК, повторяя последовательность из 10-мерный. Например, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'представляет собой 186 п.н. ДНК изогнутые где X является случайной дополнительный база и последовательность фланговые повторяющуюся последовательность 10-мерный являются адаптер последовательности.
ПРИМЕЧАНИЕ:. В этом примере два 10-меров с противоположными предпочтениями в нуклеосомной образования на основе масштабного нуклеосома размещение исследования Kaplan и др. 15 были выбраны. Поскольку винтовой повторение дцДНК близка к 10 п.о., любой чистый прогиб оси спирали от 10-мера будет накапливаться производить форму, как дуги окружности (фиг.3А). Поскольку винтовой период ближе к 10,5 п.н., дополнительный база вставляется после каждых двух повторов, чтобы сохранить изогнутую структуру, как плоских, насколько это возможно. Эти последовательности короче 200 б.п. можно заказать предприяс, что предложение ген синтеза обслуживание. Это удобно с фланга эти последовательности с общих последовательностей адаптер для последующих стадиях. Эта процедура схематически на фигуре 3В. - Выполните ПЦР с Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) и Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). Примечание: Праймер 2 помечен доноров Cy3 FRET на 5'-конце. Типичный ПЦР рецепт и протокол езда на велосипеде, представлены в таблицах 1 и 2.
- Выполните ПЦР с праймером 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) и Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). Примечание: Праймер 3 помечен акцепторной Cy5 FRET через позвоночника и биотин-линкера в 5'-конце. ПЦР рецепт и протокол езда на велосипеде, как указано выше.
- Очищают продуктов ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР.
- Смешайте Cy3-меченого продукта и Cy5-меченый продукт в буфер для обмена нити (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl рН 7,0, 1 мМ EDTA) при конечных концентрациях 0,4 и# 181, М и 0,1 мкМ соответственно. Примечание: избыток Cy3-ДНК увеличивает концентрацию дуплекса, несущей как Су3 и Cy5 в результате цепи обмена.
- Курсы нити путем инкубации при 98,5 ° С в течение 2 мин, постепенно охлаждали до 5 ° C с градиентом скорости 0,1 ° С / сек и инкубированием при 5 ° С в течение 2 часов.
2. Геле для обнаружения двухцепочечной ДНК, кривизну
- Налейте полиакриламидный гель смешением 16,17 акриламид и бис-акриламида решения в соотношении 29.2:0.8, 5% (вес / объем) в 1X Трис / борат / EDTA (КЭ) буфере при рН 8,0. Примечание: 10 мл геля раствора содержит: 1,217 мл 40% акриламида, 0,667 мл 2% бис-акриламид, 1 мл TBE 10X, 100 персульфат L аммония (APS) 10%, 10 л TEMED, а остальное дН 2 O. Полное затвердевание геля занимает около 30 мин.
- Загрузить полиакриламидный гель с образцами ДНК и ДНК маркера в 1X загрузочным буфером (5% глицерина, 0,03% (вес / объем) бромфенола блUE) и запустить гель при 5-8 В / см при 4 ° С в течение 45 мин или до передней красителя приближается к концу геля.
- Пятно гель с использованием 1X TBE буфер, содержащий бромистый 0,5 г / мл этидий течение 30 мин. Определить полосы ДНК при УФ-освещении. Сравните диапазона позиции с размером маркера (на 100 б.п. ДНК зачет) для расчета видимых размеров молекул ДНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Изогнутые ДНК обычно двигаются медленнее, чем прямые ДНК.
3. Расход препарата клеточных
- Дрель 6-7 пары отверстий вдоль двух противоположных краев предметное стекло (3'' х 1''), используя сверлильный станок и алмазные сверла. После сверления слайд в проточной воде, чтобы удалить видимые порошка стекла. ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстия служат перфузии входов и выходов. Во время бурения, охлаждение слайд с водой важно для предотвращения растрескивания.
- Поместите слайды вертикально в стеклянной банке и заполнить его водой. Разрушать ультразвуком в течение 15 мин и передавать их в другой стеклянной банке деdicated для очистки ацетона. Заполните его ацетоном и разрушать ультразвуком в течение 15 мин. Промыть слайды с этанолом с помощью пульверизатора, а затем водой. Поместите их в полипропиленовой банке, заполнить его с 5 М гидроксида калия и соникат в течение 15 мин. Наконец, разрушать ультразвуком слайдов в воде в течение 15 мин. Очистите покровные (№ 1, 24 х 40 мм), используя тот же протокол. ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные горки и покровные могут быть сохранены в дН 2 O для долгосрочного использования.
- Смешайте 1 мг биотин-ПЭГ-силана (MW 3400) с 80 мг MPEG-силана (МВт 2000) в 340 л 0,1 М раствора бикарбоната натрия. Хорошо перемешайте и центрифуги смеси кратко, чтобы избавиться от пузырьков. ВНИМАНИЕ: функционализации поверхности с полиэтиленгликолем (ПЭГ) помогает уменьшить неспецифического связывания ДНК на поверхность.
- Положите 80 л раствора ПЭГ на каждом слайде и осторожно опустите покровное над ним. Подождите в течение 45 мин. Отделите покровное со слайда с помощью пинцета, промойте их обильным количеством дН 2 O, и пусть тподол сухой на открытом воздухе.
- Наведите тонких полосок дважды скотча по слайду, чтобы сформировать каналы. Совместите покровное над ним и плотно прижмите покровное против скольжения для формирования непроницаемого для жидкости каналов. Используйте 5 минутах эпоксидную смолу, чтобы запечатать края каналов.
4. Подготовка Trolox решения
- Поместите ~ 30 мг Trolox и 10 мл дН 2 O в колбу и использовать магнит мешалки перемешивают раствор в открытом воздухе в течение 18 часов.
- Раствор фильтруют с помощью 0,2 мкм фильтр и доведения рН до 7 путем добавления ~ 6 мкл 1 М Трис-основание (рН 11). Примечание: Trolox является анти-мигает реагент, который обычно используется в одиночных молекул изучает 18. Antifading действие Trolox исходит от его окисленного производного, которое присутствует в частично деградированной раствора Trolox 19. Быстро растворения Trolox в метаноле или высокой раствора с рН Трис следует избегать из-за неэффективного окисления.
5. Одно-мольecule изображений
- Введите 15 мкл раствора NeutrAvidin (0,5 мг / мл) в канал и ждать в течение 2 мин до промывки 100 мкл T50 буфера (10 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,0).
- Введите 50 мкл образца ДНК (50-100 пМ) в канал. Подождите 5 минут и промойте несвязанного ДНК от 100 л T50 буфера. Примечание: молекулы ДНК, специфически связываются с поверхности через NeutrAvidin-биотин взаимодействия.
- Заполните канал с буфером изображения, который содержит систему поглощения кислорода 20 (100 мМ PCD, 5 мМ PCA, 1 мМ Trolox, и 500 мм NaCl).
- Установите EMCCD в режиме кадров передачи, чтобы поток 2 х 2 Binned изображений (256 х 256) к компьютеру при частоте 25 кадров в секунду.
- Положите иммерсионное масло на объектив микроскопа, и исправить проточную ячейку на столик микроскопа с помощью образцы клипов. Грубый настроить фокус, глядя на лазер отражения картины на стене. Точно отрегулируйте фокус с помощью живой вид флуоресценции имвозраст на мониторе.
- Начать сбор данных с 532 нм лазера на. Проверьте живой вид и настроить фокус, если необходимо. Остановить сбор данных, когда большинство молекулы photobleached.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом объекте, лаборатория написанная программа C контролировать микроскоп и отображать изображения в реальном времени на мониторе, как они сохраняются на жесткий диск используется.
6. Обработка изображений и анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: время серия 256 х 256 изображений обрабатываются кода MATLAB для создания одной молекулы времени следы Cy3 и Cy5 интенсивности. Для сопряжения пикселей между канала донором и акцептором канала сплит-просмотра изображения, 6-7 пары Cy3 и Cy5 пятен, каждая пара из той же молекулы равномерно рассредоточены по поле зрения, вручную выбрал, и аффинное преобразование рассчитывается с использованием координаты этих точек в качестве опорных точек.
- Использование сценария MATLAB, просматривать все время одиночных молекул следы тшляпа шоу несколько переходы между низкими и высокими сигналов волнуйтесь. Определить петлей и unlooped государства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал FRET определяется как интенсивностью Cy5 (Я) делится на сумму Cy3 и Cy5 интенсивности (я + я D). Изогнутая государство имеет высокое значение FRET а unlooped государство имеет низкое значение волнуйтесь. Гистограмма сигналов FRET из одной молекулы в бимодально распространяется из-за обратимой циклов и unlooping. - Найти порог, разделяющий два распределения путем определения пересечения между двумя встроенными кривых Гаусса.
- Расчет эффективности волнуйтесь, как
и назначить петлю государства с высокими значениями FRET и unlooped государств с низкими значениями волнуйтесь. - Использование сценария MATLAB, анализировать совокупное число молекул (N (T)), что петлю (илидостигли высокого состояния FRET) на различных упущений времени с момента начала сбора данных. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку молекула двухцепочечной ДНК может начаться в любой конформации unlooped государства в начале сбора данных, темпы роста в зацикленной населения отражает скорость цикла среднее усредненное по начальным конформации. Извлеките циклическую тариф K цикл по установке N (T) с экспоненциальной функцией:
Если увеличивается biphasically, она может быть оснащена двойной экспоненциальной функции: 
В этом случае к петля получается из: 
ПРИМЕЧАНИЕ: Теоретически, вероятность выживания, что полимер не передаются в момент времени т не одинарной или двойной экспоненциальной функцией 12. Экспоненциальная ПригоночнаяIng используется в качестве практического средства для извлечения среднее время захвата петли.
и назначить петлю государства с высокими значениями FRET и unlooped государств с низкими значениями волнуйтесь. 
Если увеличивается biphasically, она может быть оснащена двойной экспоненциальной функции: 
В этом случае к петля получается из: 
ПРИМЕЧАНИЕ: Теоретически, вероятность выживания, что полимер не передаются в момент времени т не одинарной или двойной экспоненциальной функцией 12. Экспоненциальная ПригоночнаяIng используется в качестве практического средства для извлечения среднее время захвата петли. 7. Определение J-фактор
Примечание: Коэффициент J представляет, как концентрированный один конец дцДНК вокруг другого конца. Она может быть определена путем интерполяции концентрацию одной концевой сегмент ДНК, который будет производить ту же скорость реакции с другом сегменте как измеренной скорости перекручивания. Экспериментально один конец сегмента иммобилизуют на поверхности, а другой конец сегмента вводят в определенной концентрации с. Если измеренная скорость отжига между двумя концами является к отжиг, то коэффициент 21 J дается 
. Константа скорости отжига (к = к отжига отжига / C) не зависит от концентрации зонда.
- Расход 20 мкл 30-50 пМ биотин-Cy5 олиго (Primer 3) яНТО канала в NeutrAvidin покрытием. Промойте канал с 100 мкл T50, чтобы смыть несвязанных олигонуклеотидов.
- Готовят буфер визуализации, как описано в части 5 с добавлением Cy3 олиго (праймер 2) в конечной концентрации 50 нМ. Поток этот буфер изображений в канал.
- Сохраняя 532 нм лазер на на, на короткое время выключить 640 нм лазер на на для определения мест поверхностных переплете Cy5 олигонуклеотидов. Выключите 640 нм лазер на и начать мониторинг сигнала волнуйтесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: При гибридизации олиго Cy3 к поверхности с привязкой Cy5 олиго, флуоресценция Су5 будут связаны с ладу. - Использование сценария MATLAB, проанализировать количество молекул, которые начинаются в свободном состоянии (низкой интенсивности Су5), но позже превращаются в отожженном состоянии (высокой интенсивности Cy5) как функция времени от следов интенсивности Cy5.
- Участок этот ряд отожженных молекул в зависимости от времени. Установите эту кривую с одной экспонентой (
(к отжига). - Повторите этот эксперимент в различных концентрациях Cy3 олиго (60, 100 и 180 нм), чтобы подтвердить линейность между скоростью отжига и концентрации реагентов. Выписка константу скорости отжига второго порядка (к отжига ) Со склона.
- Рассчитайте коэффициент J от
, Где к цикл цикл скорость измеряется в том же состоянии буфера.
(к отжига). 
, Где к цикл цикл скорость измеряется в том же состоянии буфера. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Молекулы ДНК, используемые для перекручивания исследования состоит из дуплексной области переменной последовательности и длины и одноцепочечных выступами, которые дополняют друг друга. Выступы, которые 7-основа долго, может отжига друг с другом, чтобы захватить петлю состояния. Каждый выступ содержит либо Су3 или Cy5, который связан в основной цепи ДНК через амидита химии. Су5-свес также связано с биотин-ТЭГ (15-атом Тетра-этиленгликоля спейсера) для поверхностной иммобилизации (см. рисунок 4А). Все эти модификации могут быть включены в двухцепочечной ДНК после ПЦР на основе протокола (Протокол 1 и фиг 3б). Выбранный длина и последовательность из выступающих хорошо работать для производства обнаруживаемыми и обратимые FRET событий в нормальных условиях эксперимента. Перекручивание и unlooping кинетика петли ДНК чувствительны к температуре окружающей среды, и, следовательно, регулятор температуры имеет важное значение для воспроизводимости. Такой противоречивыеМюллер могут быть легко включены в микроскоп (рис. 2).
Использование TIRFM, антикоррелированы колебания Cy3 (донора) и Cy5 (акцепторные) сигналов от поверхности с иммобилизованным дц-молекул ДНК наблюдались (рис. 4б). В петлей состоянии, расстояние между двумя красителей меньше, чем 5 нм, что приведет к высоким отношением сигнал Cy5 и низким уровнем сигнала Cy3 из-за высокой эффективности FRET (фиг.4А и 4С). Несколько контрольные эксперименты проводились, чтобы доказать, что высокое состояние FRET представляет замкнутую состояние. Срок службы высоком состоянии FRET увеличивается с увеличением длины свеса, который предполагает, что государство высоко FRET стабилизируется спаривания оснований между двумя заходами. Срок службы высоком состоянии FRET также снизилась с уменьшением длины ДНК, которая, как ожидается, поскольку цикл свободной энергии возрастает по мере цикла становится меньше 12. Основываясь на этих данных, высокой и низкой FRET станцийTES могут быть назначены петельные и unlooped состояниях соответственно.
Для проверки влияния внутренней кривизны двухцепочечной ДНК на цикл, два 186 б.п. dsDNAs с различной кривизны были построены, которые названы "квадратный" (S-ДНК) и «изогнутый» (С-ДНК) в зависимости от их кривизны. Повторяя последовательность 10-Мер является TTTATCATCC для C-ДНК и TGACAGCAAC для S-ДНК. В целом кривизна каждой из этих dsDNAs была проверена PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле), который является наиболее широко используемым методом оценки двухцепочечной ДНК кривизну 16,22. 5 показано, что S-ДНК работает так же, как ДНК и того же размера в лестнице ДНК (сравните дорожка 1 и дорожка 2 на рисунке 5). С другой стороны, C-ДНК показывает больший видимый размер по сравнению с его аналогом в лестницы ДНК (~ 1,2 больше, чем его реальный размер, см. дорожка 1 и дорожка 3). Это наблюдение указывает на то, что C-ДНК обладает большей внутренней кубrvature чем S-ДНК.
На фиг.6 показан репрезентативный флуоресценции времени след от С-ДНК (фиг.6А) и соответствующего FRET следа (фиг.6В). По сравнению с S-ДНК (Цифры 4В и 4С), С-ДНК производит больше высокой FRET события в течение того же периода времени; С-ДНК петли 4 раза чаще, чем S-ДНК в течение того же времени приобретения (рис. 7). Этот результат показывает, что внутренняя кривизна ДНК может существенно повлиять цикла динамику.
Чтобы извлечь фактор J от перекручивания скорости, нужно измерить скорость второго порядка постоянной концентрации независимый для гибридизации между двумя отключенными свесы. Реализация такого измерения показан на рисунке 8А. Гибридизация Cy3 олиго с иммобилизованным Cy5 олиго производит Cy5 всплески интенсивности из-за беспокоиться. От многократного МЭСрения с различной концентрацией Су3 олиго (см. рис 8B), можно извлечь статистически устойчивым образом. В нашем эксперименте константа скорости отжига между двумя олигонуклеотидов в 500 мМ NaCl была определена в 0,45 ± 0,04 х 10 6 М -1 с -1. Коэффициент J была рассчитана путем деления циклическую скорость (к петля) на константу скорости отжига второго порядка (к 'отжига). Это было 61 ± 3 нм для S-ДНК и 265 ± 48 нМ для С-ДНК. Коэффициент J из S-ДНК (рис. 9) находится в удовлетворительном согласии с предыдущими измерениями на аналогичной длины 7.
Рисунок 1. Цель типа TIRFM. A) возбуждения оптика. Нм и 640 нм лазеры 532 коллимируется отдельно к SimilДиаметр ар, объединены в том же пути, с помощью дихроичных зеркал, и сосредоточился на крошечный эллиптическим зеркалом помещен под объективной задней апертуры. Важно использовать ахроматический объектив для фокусировки свести к минимуму хроматической аберрации. Б) оптики микроскопа. Поперечное положение миниатюрного зеркала должна быть точно отрегулирована так, что она может отражать лазерный луч через объектив в то время как минимально блокировки флуоресцентное излучение. Таким образом, он должен быть установлен на малой сцене перевода. Другой зеркало на противоположной стороне отражает исходящий лазер, чтобы предотвратить его попадание оптику обнаружения. В плоскости изображения вне тела микроскопа, регулируемая щель находится, чтобы обрезать изображение до половины размера зоны обнаружения ПЗС. Флуоресценции расщепляется дихроичного зеркала на два канала, и линзы реле формируют второе изображение на ПЗС с масштабом 1:1. Один из отражающих зеркал слегка поворачивается, чтобы компенсировать донораи акцепторные изображения. Полосовой и еще Длинноволновый фильтры используются для снижения фона в донора и акцептора каналов, соответственно. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Контроля температуры для одиночных молекул экспериментов. Заданная температура (Т с) является чтение на чиллера / обогревателя. Фактическая температура (Т) измеряется с помощью термопары, контактирующей с верхней поверхностью покровного стекла на микроскопе. Сюжет о фактических температур против шести различных заданных температурах (черные квадраты) показывает отличную линейность (зеленая пунктирная линия). Надежность контроллера показана случайных измерений, проведенных на более поздние времена (красные ромбы). На вставке является картина температуры соntrolling блок и цели в их окончательной сборки. Красная линия представляет собой наклон единства. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. ДНК Дизайн.) Изогнутые двухцепочечной ДНК. 10-мерный дцДНК представлен в виде сегмента изогнутой трубы и двух одиночных нитей в виде пунктирных линий. Ось спирали любого 10-мерной ДНК не совсем прямо, и, таким образом, каждый конкатенации такой 10-мера приведет к дополнительных наклона винтовой оси в одном направлении. Этот эффект может быть использован для создания плоских, сверхвитков молекулы. B) на основе ПЦР подготовка двухцепочечной ДНК. Одноцепочечные ДНК показаны в виде горизонтальной линии. Их фактическая кривизна не показано здесь. Центральный сегмент в черном представляет уникальная часть фрагмента ДНК. Показанный в светло-серый являются адаптер последовательности, общие для всех ДНК, используемых в данном исследовании. Грунтовка 1 и 4 отжига в передней и задней адаптеров соответственно. Праймер 2 помечен Cy3 на 5'-конце. Праймер 3 имеет тег биотин на 5'-конце и внутренне связанный Cy5. Светло-голубые области Праймер 2 и 3 содержат комплементарные последовательности, которые функционируют как липкие концы. Либо плазмида или геномную ДНК, содержащую последовательность интерес использовали в качестве матрицы в двух отдельных ПЦР-реакций. Cy3 меченных дцДНК производится с использованием праймера 1 и 2, и биотинилированный Cy5-меченого ДНК получают с использованием праймера 3 и 4. Эти два продукта PCR нагревают и охлаждают вместе нити обмена. Четыре различных dsDNAs образуются, только один из которых содержит Су3, Cy5 и биотин. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Схема эксперимента.) Одиночных молекул FRET эксперимент. дц-молекул ДНК, меченные Cy3 (зеленый) с одной стороны и Cy5 (красный), с другой обездвижены на PEG (полиэтиленгликоль) покрытием поверхности. Реверсивный циклов и unlooping из dsDNAs привести к высокой FRET (петлей) и низкой FRET (unlooped) состояний, соответственно. B) Типичный одиночных молекул времени следа доноров (зеленый) и акцептора (красный) интенсивности флуоресценции. Высокие и низкие FRET государства определены как петельные и unlooped государств, соответственно. Кроме того, указывается в первый раз цикл, который используется, чтобы вычислить циклическую частоту. (Вставка) зум-на рисунке показывает анти-корреляции интенсивностей Cy3 и Cy5. C) время след эффективности FRET, рассчитанной по донора и акцептора интенсивности прослеживает в B. 4В и
Рисунок 5. Электрофорез в полиакриламидном геле (29.2:0.8 акриламид / бис-акриламида, 5% в КЭ буфера, рН 8,0) синтетических ДНК. Слева направо, полосы содержат 1 Kb маркер, на 186 б.п. Прямой ДНК и 186 б.п. Изогнутые ДНК. Эта цифра частично заимствована из предыдущей публикации 12 с разрешения. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 6. Характерные следы от изогнутой ДНК (C-ДНК) (а) и соответствующим FRET следа (B). Сравнение интенсивности и FRET следы между S-ДНК (фиг. 4В и 4С) и С-ДНК (фиг. 6A и 6B) четко показывает, что изогнутый ДНК петли чаще, чем прямой ДНК в том же состоянии буфера. (Вставка) зум-в рисунке показана анти-корреляции интенсивностей Cy3 и Cy5. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 7. Средние первый раз Зацикливание прямо и изогнутых ДНК. Каждый тIME экстрагировали из ~ 500 молекул в 5 различных областях. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего (SEM), рассчитанной по 3 независимых экспериментов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 8. Определение константы скорости отжига от олиго гибридизации. А) Схематическое изображение измерения скорости отжига. Cy5 праймер, иммобилизованный на поверхности, а Cy3 праймер присутствует в 50-180 нМ. Связывание и развязывание грунтовки Cy3 в 50 нМ происходят обратимо и привести к обнаружению всплесков акцепторных, которые показаны на вставке. B) скорость отжига линейно зависит от концентрации свободного олиго. Наклон линии представляет собой константу скорости отжига второго порядка (к 'Anneâ л). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 9 В J-факторы прямых и изогнутых ДНК, рассчитанных в нМ фактором J была определена на основе двух measurables:... Цикл курсов из цикла двухцепочечной ДНК и скорости отжига постоянной свободных дополнительных заходами Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
| Компонент | Volume/50 реакция мкл | Конечная концентрация |
| 36 мкл | ||
| 5x Phusion буфер | 10 мкл | 1x |
| 10 мМ дНТФ | 1 мкл | 200 мкМ каждого |
| Прямой праймер (25 мкМ) | 1 мкл | 0,5 мкм |
| Обратный праймер (25 мкМ) | 1 мкл | 0,5 мкм |
| Phusion горячий старт ДНК-полимераза (2 Ед / мкл) | 0,5 мкл | 0.02 ед / мкл |
| Шаблон ДНК | 0,5 мкл | ~ 1 нг |
Таблица 1. Реакции ПЦР смесь. Протокол оптимизирован для полимеразы Phusion ДНК. Детали должны быть добавлены в этом порядке.
| Цикл шаг | Температура | Время | Количество циклов |
| Начальная денатурация | "> 95 ° C30 сек | 1 | |
| Денатурация | 95 ° C | 5 сек | 30 |
| Отжиг | 60 ° C | 10 сек | |
| Расширение | 72 ° C | 15 сек / кб | |
| Финал расширение | 72 ° C | 5 мин | 1 |
| 4 & #176; C | держать |
Таблица 2. Инструкции велосипедные ПЦР. Температура отжига определяется на основании температур плавления праймеров. Время расширение оптимизирован для полимеразы Phusion ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Простой анализ одиночных молекул на основе FRET был использован для изучения LOOPING кинетики ДНК различных внутренних форм. Изогнутые ДНК могут быть получены путем повторения последовательности 10-мерный в фазе с винтовой периода 10,5 п.н., и их кривизны можно оценить с помощью PAGE. Эти dsDNAs разработаны с липкими концами, чтобы обеспечить стабилизацию переходный цикл. Мы извлекли циклическую скорость от экспоненциального роста числа закольцованных молекул с течением времени. Константа скорости отжига между отключенных липких участков торцевых используется для определения концентрации эквивалент перекручивания плотности вероятности, которая известна как фактор J.
В лигазы основе ДНК циклизации анализа, измерение вероятности закрытия ДНК чувствительны к концентрации лигазы, а фактор J трудно переоценить если лигазы является чрезмерным 9. Неспецифического связывания ДНК лигазы с ДНК также может повлиять на циклическую 10. Кроме того, Ligasэ активность зависит от соли и распадается в течение долгого времени. Таким образом, трудно учиться зацикливание ДНК в условиях неоптимальных для лигазы. В противоположность этому, на основе FRET анализ зацикливание свободен от всех этих проблем.
Наш экспериментальный протокол является похож на Vafabakhsh и Ха 13, за исключением двух важных аспектов, которые достойны обсуждения. Vafabakhsh и Ха 13 построили свои дц-молекул ДНК путем лигирования несколько синтетических олигонуклеотидов. Хотя ошибка (вставка, удаление или замена) ставка за нуклеотида в синтезе олиго незначительна (е 0,181%) 23, доля непреднамеренных последовательностей ДНК линейно возрастает с длиной олиго. Таким образом, 100-BP дуплекс образец, полученный этим протоколом может содержать до ~ 33% несовершенные дуплексы которые могут привести к более высокой ставке циклов, 24. Для сравнения, наш протокол использует полимеразной цепной реакции (ПЦР) для синтеза дц-молекул ДНК, который имеет гораздо более высокую точность, чем че ДНКmosynthesis 25. По данным производителя, высококачественный полимеразной мы использовали бы генерировать правильный 100 п.н. молекулу ДНК на 99,8% вероятностью после 30 циклов ПЦР-амплификации.
Еще одно важное отличие между двумя исследованиями является схема поверхности иммобилизации. В нашем исследовании ДНК-молекулы прикреплены к поверхности через их концах, тогда как в протоколе по Vafabakhsh и Ха 13, они связаны через внутреннюю базу. Было предсказано, что на основе удержания эффекта только, внутренне возлагали дц может петля чаще, чем свободного двухцепочечной ДНК, до в пять раз в зависимости от расположения внутреннего закрепления 26. Таким образом, при измерении коэффициента J как функцию длины контура ДНК, внутренний пиннинг можно ввести неожиданное изменчивость. Кроме того, возможно, что модифицированное основание с линкером имеет более слабую возможность спаривания оснований, что может привести к более высокой скорости циклов. Тем не менее, DespITE эти очевидные различия, эти два протокола производят подобные факторы J на 100 б.п. (~ 3 нМ против ~ 2 нм).
Это FRET основе цикла анализа перспективен для изучения широкого круга явлений, связанных с двухцепочечной ДНК петлеобразования включая влияние несоответствия, вмятин или зазоров на двухцепочечной ДНК петлеобразования 27, эффект ДНК-связывающих белков на двухцепочечной ДНК зацикливания, и температурной зависимости днДНК гибкости. Эти темы будет трудно обращаться с обычной лигазного основе циклизации. FRET основе цикла анализа также может быть использован для измерения коэффициента J против длины контура, который является стандартом отношения, чтобы проверить полимерных моделей. Однако протокол мы представили здесь не очень хорошо подходит для изучения зацикливания двухцепочечной ДНК короче 100 б.п.. Ниже этой длины, дц зацикливание становится крайне медленно, и поэтому измеренная скорость будет зависеть от других непреднамеренных процессов, таких как фотообесцвечивания. Можно ускорить очевидные LOOPING кинетики намиING высокую концентрацию соли ([Na +]> 500 мм), но физиологическое значение таких измерений становится сомнительным. Таким образом, исследование двухцепочечной ДНК изгиб на масштабах ниже 100 б.п. выиграют от подхода, ортогональной циклизации на основе анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Джеймс Уотерс, Гейбл Уодсворт и Бо Broadwater для критически чтение рукописи. Мы также благодарим четыре анонимных рецензентов за предоставление полезные комментарии. Мы признаем, финансовую поддержку от Технологического института Джорджии, в Burroughs Wellcome Фонд Карьера премии в научной Interface, и студенческой научно-исследовательской сети грантом NSF физики живых систем.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).
