Summary
Este estudio presenta un procedimiento experimental detallado para medir la dinámica de bucle de ADN de doble cadena utilizando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). El protocolo también se describe cómo extraer la densidad de probabilidad de bucle llamado factor J.
Abstract
De flexión de ADN de doble cadena (dsDNA) se asocia con muchos procesos biológicos importantes, tales como el reconocimiento de DNA-proteína y el empaquetamiento del ADN en nucleosomas. Termodinámica de ADN de doble cadena de flexión se ha estudiado mediante un método denominado ciclación que se basa en la ADN ligasa para unir covalentemente los extremos pegajosos cortos de un ADN de doble cadena. Sin embargo, la eficiencia de la ligadura puede verse afectada por muchos factores que no están relacionados con dsDNA bucle tales como la estructura del ADN que rodea los extremos pegajosos unidas, y ligasa también puede afectar a la velocidad de bucle evidente a través de mecanismos tales como la unión no específica. Aquí, se muestra la forma de medir la cinética de bucle de ADN bicatenario sin ligasa mediante la detección de la formación de bucle de ADN transitoria por FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente). moléculas de ADN de doble cadena se construyen usando un simple protocolo basado en PCR con un par de FRET y un enlazador biotina. La densidad de probabilidad de bucle conocido como el factor de J se extrae de la tasa de bucle y la tasa de recocido entre dos desconexiónted extremos pegajosos. Al poner a prueba dos dsDNAs con diferentes curvaturas intrínsecas, se muestra que el factor J es sensible a la forma intrínseca de la ADN de doble cadena.
Introduction
La comprensión de las propiedades mecánicas de ADN de doble cadena es de importancia fundamental en las ciencias básicas y aplicaciones de ingeniería. La estructura de ADN de doble cadena es más complicado que una escalera helicoidal recto debido ángulos de balanceo, inclinación y giro entre pares de bases sucesivas pueden variar con la secuencia. Fluctuaciones térmicas pueden provocar dsDNA a someterse a diversos modos de fluctuaciones conformacionales como la flexión, torsión y estiramiento. Transiciones de fusión tales como el retorcimiento y también pueden ocurrir en condiciones extremas.
Entre estos movimientos, dsDNA flexión tiene el impacto biológico más sensible 1. ADN de doble cadena de flexión está asociada con la represión de genes o la activación por la unión de dos sitios distantes cerca uno del otro. También juega un papel importante en el empaquetamiento del ADN dentro del núcleo de la célula o de una cápside viral. Deformación por flexión de ADN de doble cadena se puede visualizar experimentalmente por microscopía de alta resolución (AFM 2 y TEM 3), y la Thermodynamics y cinéticas pueden ser estudiadas mediante ensayos de bucle, que enlazan químicamente sitios yuxtapuestos del ADN de doble cadena.
Uno de tales ensayos es ligasa dependiente de ciclación 4. En este ensayo, las moléculas de ADN de doble cadena con extremos 'pegajosos' (cohesivos) se circularized o dimerizados por ADN ligasa. Mediante la comparación de las tasas de círculo y la formación de dímero, se puede obtener una concentración molar eficaz de uno de los extremos del ADN en la proximidad del otro extremo, que se conoce como el factor de J. Este factor J es dimensionalmente equivalente a la densidad de probabilidad de encontrar un extremo del ADN a una distancia corta desde el otro extremo, y por lo tanto refleja la flexibilidad del ADN. Medir el factor de J como una función de la longitud del ADN revela muchas características acerca de la mecánica de ADN incluyendo el 4,5 longitud de persistencia.
La cadena de gusano-como modelo (WLC) ha sido ampliamente considerado como el modelo canónico de polímero para la mecánica dsDNA en función de su éxito en la explicaciónnando las curvas fuerza-extensión obtenidos en el ADN tirando experimentos 6 y predecir correctamente los factores de J dsDNAs más de 200 pb 7. Sin embargo, usando el ensayo de ciclación en las moléculas de ADN de doble cadena tan cortos como 100 pb, Cloutier y Widom midieron los factores J ser varios órdenes de magnitud mayor que la predicción del modelo WLC 8. Un año más tarde, Du et al. producido J factores de acuerdo con el modelo WLC usando el ensayo de ciclación con concentraciones más bajas de ligasa y atribuido el resultado anómalo del grupo Widom a concentraciones altas ligasa utilizada 9. Esta controversia es un ejemplo de la influencia inevitable de la ADN ligasa en la cinética de ciclación cuando se utiliza el ensayo convencional 9. Por otra parte, la ligasa de ADN también puede afectar a la estructura del ADN y la rigidez a través inespecífica 10,11 vinculante.
Para eliminar los problemas técnicos de los ensayos de bucles de proteínas dependientes, hemos demostrado una protensayo de bucle ein-gratuito basado en energía de resonancia fluorescente Transfer (FRET) 12. En este método, las conformaciones en bucle se detectan por FRET entre el donante y aceptor unido cerca de los extremos pegajosos de una molécula de ADN. Un microscopio de fluorescencia de reflexión total interna de tipo objetivo (TIRFM) se utiliza para registrar las trayectorias de bucle reversible y eventos unlooping de moléculas individuales de ADN inmovilizado en la superficie por un período de tiempo prolongado. Este método cuenta con el montaje basado en la PCR de moléculas de ADN para generar moléculas de ADN-desajuste libre, que es una mejora crucial en un método similar por Vafabakhsh y Ha 13. El aspecto de una sola molécula de este protocolo permite la medición de distribuciones en adición a Ensemble promedios mientras que el aspecto de FRET permite medir la dinámica de bucle de ADN repetidamente de la misma molécula, incluso en condiciones que pueden afectar la actividad ligasa.
La configuración TIRFM se muestra en la Figura 1. Una costumbrePlatina de diseño se coloca sobre un cuerpo del microscopio Olympus IX61. 532 nm y 640 nm láser se introducen desde el lado y son reflejados por espejos diminutos elípticas 14 en el alta NA objetivo de lograr ángulo crítico de incidencia en la interfaz agua-cubreobjetos. Observamos que más generalizada-a través de objetivo TIR utilizando espejos dicroicos o configuraciones de TIR a base de prisma también se puede utilizar para esta aplicación de FRET. La imagen de fluorescencia formado por el microscopio se divide en donante y aceptor de imágenes por un espejo dicroico. Ellos se vuelven a reflejados en dos mitades de una EMCCD. Filtros de emisión de paso de largo adicionales se utilizan para reducir la señal de fondo.
El control de temperatura es esencial para la adquisición de los datos cinéticos reproducibles. Para el control de la temperatura, el objetivo se separa de la pieza de nariz del cuerpo del microscopio para minimizar la transferencia de calor, y el agua de un enfriador controlada / calentador de la temperatura se hace circular a través de un collar de latón que encaja herméticamentealrededor del metal interior debajo de la chaqueta objetivo. Esta configuración es capaz de alcanzar control de la temperatura robusta en la superficie cubreobjetos entre 15 y 50 ° C (Figura 2). En este trabajo, la temperatura de la muestra se mantuvo a 24 ° C.
El protocolo siguiente se presenta el procedimiento paso a paso para la construcción de ADN, la estimación de la forma de ADN, el experimento de una sola molécula, y la determinación del factor J.
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Protocol
1. Preparación de la muestra de ADN bicatenario
- Diseñar ADNs curvas a nivel mundial mediante la repetición de una secuencia de 10-mer. Por ejemplo, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'es un ADN curvada 186-pb donde X es una base adicional al azar y la secuencia que flanquea la secuencia de 10-mer repitiendo son secuencias adaptadoras.
NOTA: En este ejemplo se seleccionaron dos 10-meros con preferencias opuestas a la formación de nucleosomas en base a un estudio a gran escala de ocupación nucleosoma por Kaplan et al 15.. Desde la repetición helicoidal de ADN de doble cadena es cerca de 10 pb, cualquier desviación neta del eje helicoidal de la 10-mer se acumulan para producir una forma como un arco circular (Figura 3A). Desde el período helicoidal está más cerca de 10,5 pb, una base extra se inserta después de cada dos repeticiones para mantener la estructura curvada como plana como sea posible. Estas secuencias más cortas de 200 pb se pueden pedir a companies que el servicio de síntesis de genes oferta. Es conveniente para flanquear estas secuencias con secuencias adaptadoras comunes para las etapas subsiguientes. El procedimiento se esquematiza en la Figura 3B. - Lleve a cabo PCR con cebador 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) y cebador 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Cebador 2 se etiqueta con el Cy3 donante de FRET en el extremo 5 '. Una receta típica PCR y protocolo de ciclos se presentan en las tablas 1 y 2.
- Lleve a cabo PCR con Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) y Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Cebador 3 está etiquetado con el aceptor Cy5 FRET a través de la columna vertebral y la biotina-enlazador en el extremo 5 '. Receta PCR y protocolo de ciclos son como anteriormente.
- Purificar los productos de PCR utilizando un kit de limpieza de PCR.
- Mezclar el producto marcado con Cy3 y el producto marcado con Cy5 en un tampón para el intercambio de cadenas (100 mM NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, EDTA 1 mM) a concentraciones finales de 0,4 y# 181; M y 0,1 M, respectivamente. NOTA: El exceso de Cy3-ADN aumenta la concentración del dúplex que lleva tanto Cy3 y Cy5 como resultado de la línea de cambio.
- Tipo de hebras por incubación a 98,5 ° C durante 2 min, enfriar gradualmente a 5 ° C con velocidad de rampa de 0,1 º C / seg, e incubando a 5 ° C durante 2 horas.
2. Electroforesis en gel para detectar ADN de doble cadena Curvatura
- Verter el gel de poliacrilamida 16,17 mezclando soluciones de acrilamida y bis-acrilamida en relación 29.2:0.8, 5% (w / v) en 1X Tris / borato / EDTA (TBE) tampón a pH 8,0. Nota: 10 ml de solución de gel contiene: 1,217 ml de 40% de acrilamida, 0,667 ml de 2% de bis-acrilamida, 1 ml de TBE 10X, 100 persulfato L de amonio (APS) 10%, 10 L de TEMED, y el resto es dH 2 O. Solidificación completa del gel tarda unos 30 min.
- Cargar el gel de poliacrilamida con muestras de ADN y la escalera de ADN en tampón de carga 1X (5% de glicerol, 0,03% (w / v) de bromofenol BLue) y ejecutar el gel a 5-8 V / cm a 4 ° C durante 45 min o hasta que el frente del colorante se acerca el final del gel.
- Tinción del gel usando tampón TBE 1X que contiene 0,5 g / ml de bromuro de etidio durante 30 min. Identificar las bandas de ADN bajo iluminación UV. Comparar posiciones de las bandas con el marcador de tamaño (100 pb escalera de ADN) para calcular los tamaños aparentes de las moléculas de ADN. NOTA: Curved ADN generalmente se mueven más lento que los ADN rectas.
3. De flujo Preparación de células
- Perforar 6-7 pares de agujeros a lo largo de dos bordes opuestos de una lámina de vidrio (3'' x 1'') usando un taladro y brocas de diamante. Después de la perforación, frote la diapositiva de agua que fluye para quitar polvo de vidrio visible. NOTA: Los agujeros sirven como entradas de perfusión y puntos de venta. Durante la perforación, el enfriamiento de la diapositiva con agua es importante para prevenir el agrietamiento.
- Colocar los portaobjetos en posición vertical en un frasco de vidrio y llenarlo con agua. Déjelos en remojo durante 15 min y transferirlos a otro frasco de vidrio dedicated para la limpieza acetona. Rellenar con acetona y déjelos en remojo durante 15 min. Enjuagar los portaobjetos con etanol utilizando una botella de spray y luego con agua. Colóquelos en un recipiente de polipropileno, llenarlo de 5 M de hidróxido de potasio y déjelos en remojo durante 15 min. Por último, sonicar las diapositivas de agua durante 15 min. Limpiar los cubreobjetos (n º 1, 24 x 40 mm) utilizando el mismo protocolo. NOTA: diapositivas y cubreobjetos limpios pueden almacenarse en dH 2 O para el uso a largo plazo.
- Mezclar 1 mg de biotina-PEG-silano (MW 3400) con 80 mg de mPEG-silano (MW 2000) en 340 L de solución de bicarbonato de sodio 0,1 M. Mezclar bien y centrifugar la mezcla brevemente para eliminar las burbujas. NOTA: La funcionalización de la superficie con polietilenglicol (PEG) ayuda a reducir la unión no específica de ADN a la superficie.
- Ponga 80 L de la solución de PEG en cada diapositiva y bajar suavemente un cubreobjetos sobre ella. Espere 45 min. Separe el cubreobjetos de la diapositiva con pinzas, enjuáguelos con abundante cantidad de dH 2 O y dejar que tseco dobladillo al aire libre.
- Coloque tiras delgadas de cinta adhesiva de doble cara en toda la diapositiva para formar canales. Alinear un cubreobjetos sobre ella y presione firmemente el cubreobjetos contra la corredera para formar canales estancos a los líquidos. Utilice 5 minutos epoxi para sellar los bordes de los canales.
4. Preparación de la solución de Trolox
- Ponga ~ 30 mg Trolox y 10 ml de dH2O en un matraz y usar una barra de agitación imán para agitar la solución al aire libre durante 18 horas.
- Filtrar la solución usando un filtro de 0,2 micras y ajustar el pH a 7 mediante la adición de ~ 6 l de 1 M Tris base (pH 11). Nota: Trolox es un reactivo anti-parpadeo que se utiliza comúnmente en una sola molécula estudia 18. La acción antifading de Trolox proviene de su derivado oxidado que está presente en la solución de Trolox parcialmente degradada 19. Disolviendo rápidamente Trolox en metanol o una solución de Tris pH alto se debe evitar debido a la oxidación ineficiente.
5. Individual-molImaging ecule
- Inyectar 15 l de solución de NeutrAvidin (0,5 mg / ml) en el canal y esperar durante 2 minutos antes de enjuagar con 100 l de tampón de T50 (10 mM de Tris-HCl, NaCl 50 mM, pH 7,0).
- Inyectar 50 l de muestra de ADN (50-100 pM) en el canal. Esperar 5 minutos y enjuagar el ADN no unido de distancia con 100 L de tampón de T50. NOTA: moléculas de ADN se unirán específicamente a la superficie a través de la interacción biotina-NeutrAvidin.
- Llenar el canal con el buffer de imágenes que contiene un sistema de eliminación de oxígeno 20 (100 mM de PCD, 5 mM de PCA, 1 mM de Trolox, y NaCl 500 mM).
- Ajuste el EMCCD en modo de transferencia de fotogramas para transmitir 2 x 2 imágenes agrupadas (256 x 256) a la computadora a 25 fotogramas por segundo.
- Poner el aceite de inmersión sobre el objetivo del microscopio, y fijar la celda de flujo en la platina del microscopio utilizando clips de muestra. De grano grueso, ajuste el enfoque mirando el patrón de reflexión láser en la pared. Ajuste con precisión el enfoque utilizando la visualización en vivo de fluorescencia imlas edades en el monitor.
- Comience la adquisición de datos con el láser de 532 nm en. Compruebe la vista en vivo y ajuste el enfoque si es necesario. Deje de adquisición de datos cuando la mayoría de las moléculas han photobleached.
NOTA: En esta instalación, se utiliza un programa de laboratorio-escrito C para controlar el microscopio y visualizar imágenes en directo en el monitor, ya que se guardan en el disco duro.
6. Procesamiento de imágenes y análisis de datos
NOTA: Una serie de tiempo de 256 x 256 imágenes son procesadas por un código de MATLAB para generar una sola molécula de rastros de tiempo de Cy3 y Cy5 intensidades. Para emparejar píxeles entre el canal de donante y el canal aceptor de la imagen de vista dividida, 6-7 pares de Cy3 y Cy5 manchas, cada par de la misma molécula uniformemente dispersado a través del campo de vista, son recogidos manualmente, y una transformación afín se calcula utilizando las coordenadas de estos lugares como puntos de anclaje.
- El uso de un script de MATLAB, mirar a través de todos los tiempos de una sola molécula traza tsombrero muestran múltiples transiciones entre las señales de baja y alta traste. Identificar los estados en bucle y unlooped.
NOTA: La señal de FRET se define como la intensidad de Cy5 (I a) dividido por la suma de Cy3 y Cy5 intensidades (I A + Id). Estado en bucle tiene un alto valor FRET mientras que el estado unlooped tiene valor bajo FRET. El histograma de las señales de FRET de una sola molécula se distribuye bimodal porque de bucle reversible y unlooping. - Encontrar el umbral que separa las dos distribuciones mediante la determinación de la intersección entre las dos curvas gaussianas armarios.
- Calcular la eficiencia de FRET como
y asignar los estados en bucle con altos valores de FRET y los estados unlooped con valores bajos de FRET. - El uso de un script de MATLAB, analizar el número acumulado de moléculas (N (t)) que en bucle (oalcanzado el estado alto FRET) en diferentes lapsos de tiempo desde el inicio de la adquisición de datos. NOTA: Dado que una molécula de ADN de doble cadena puede iniciar en cualquier conformación del estado unlooped en el inicio de adquisición de datos, la tasa de aumento en la población en bucle refleja la tasa de bucle medios promediados sobre conformaciones iniciales. Extraer el bucle tasa de bucle K mediante el ajuste de N (t) con una función exponencial:
Si aumenta bifásica, que puede ser equipado con una función doble exponencial: 
En este caso, el bucle k se obtiene a partir de: 
NOTA: En teoría, la probabilidad de supervivencia que un polímero no ha enrollado en el tiempo t no es un simple o doble función exponencial 12. Fitt Exponencialción se utiliza como un medio práctico para extraer el promedio de tiempo de bucle.
y asignar los estados en bucle con altos valores de FRET y los estados unlooped con valores bajos de FRET. 
Si aumenta bifásica, que puede ser equipado con una función doble exponencial: 
En este caso, el bucle k se obtiene a partir de: 
NOTA: En teoría, la probabilidad de supervivencia que un polímero no ha enrollado en el tiempo t no es un simple o doble función exponencial 12. Fitt Exponencialción se utiliza como un medio práctico para extraer el promedio de tiempo de bucle. 7. Determinación del factor J
NOTA: El factor J representa cómo concentrada uno de los extremos de un ADN de doble cadena es alrededor del otro extremo. Se puede determinar por interpolación la concentración de un segmento extremo del ADN que produciría la misma velocidad de reacción con el otro segmento final como la tasa de bucle medido. Experimentalmente, un segmento extremo está inmovilizado sobre la superficie, y el otro segmento extremo se introduce a una cierta concentración c. Si la tasa de recocido medida entre los dos extremos es k recocido, entonces el factor de J 21 está dada por 
. La constante de velocidad de recocido (k = k recocido recocido / C) es independiente de la concentración de la sonda.
- Caudal 20 l de 30-50 pM biotina-Cy5 oligo (Primer 3) iONT un canal recubierto de NeutrAvidin. Enjuague el canal con 100 l T50 para lavar oligos no consolidados.
- Preparar el tampón de formación de imágenes tal como se describe en la parte 5 con la adición de Cy3 oligo (cebador 2) a una concentración final de 50 nM. Este flujo de buffer de imágenes en el canal.
- Mientras se mantiene el láser 532 nm, gire brevemente el láser de 640 nm a identificar la ubicación de la superficie determinada Cy5 oligos. Apague el láser de 640 nm y empezar a monitorizar la señal de FRET.
NOTA: Tras la hibridación de un oligo Cy3 a un Cy5 oligonucleótido unido a la superficie, Cy5 fluorescencia surgirá de FRET. - El uso de un script de MATLAB, analizar el número de moléculas que comienzan en el estado no ligado (baja intensidad de Cy5), pero más tarde se convierten en el estado (alta intensidad de Cy5) recocido como una función del tiempo a partir de los restos de intensidad Cy5.
- Trace ese número de moléculas en función del tiempo de recocido. Ajuste esta curva con una sola función exponencial (
(k recocido). - Repita este experimento a diferentes concentraciones Cy3 oligo (60, 100, y 180 nm) para confirmar la linealidad entre la tasa de recocido y la concentración de reactivo. Extracto de la constante de velocidad de recocido de segundo orden (k recocido ) A partir de la pendiente.
- Calcular el factor J de
, Donde bucle k es la tasa de bucle medido en las mismas condiciones tampón.
(k recocido). 
, Donde bucle k es la tasa de bucle medido en las mismas condiciones tampón. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Moléculas de ADN utilizados para el estudio de bucle consisten en una región dúplex de la secuencia y longitud variables y salientes monocatenarios que son complementarios entre sí. Los salientes, que son 7 bases de longitud, pueden hibridar entre sí para capturar el estado de bucle. Cada saliente contiene ya sea Cy3 o Cy5 que está vinculado en la columna vertebral del ADN a través de la química amidita. El Cy5-alero también está vinculado con biotina-TEG (15-átomo de Tetra-etilenglicol espaciador) para la inmovilización de superficie (ver Figura 4). Todas estas modificaciones se pueden incorporar en el ADN de doble cadena después de un protocolo basado en la PCR (Protocolo 1 y la Figura 3B). La longitud elegida y la secuencia de los salientes funcionan bien para producir eventos de FRET detectables y reversibles en las condiciones experimentales normales. El bucle y la cinética unlooping del bucle de ADN son sensibles a la temperatura ambiente, y por lo tanto, un controlador de temperatura es esencial para la reproducibilidad. Tal controller se puede incorporar fácilmente en el microscopio (Figura 2).
Usando TIRFM, las fluctuaciones de Cy3 (donante) y Cy5 (aceptor) señales de las moléculas de ADN bicatenario superficie inmovilizada fueron observados (Figura 4 B) anti-correlacionada. En el estado de bucle, la distancia entre dos colorantes es menor que 5 nm, lo que resultaría en alta señal de Cy5 y Cy3 señal baja debido a la alta eficiencia de FRET (figuras 4A y 4C). Varios experimentos de control se realizaron para demostrar que el estado de alta FRET representa el estado en bucle. El tiempo de vida del estado de alta de FRET aumentó al aumentar la longitud del voladizo, lo que sugiere que el estado de alta de FRET se estabiliza por apareamiento de bases entre los dos voladizos. El tiempo de vida del estado de alta FRET también disminuyó con la disminución de la longitud del ADN, que se espera debido a que los libre de bucle aumenta la energía como el lazo se hace más pequeño 12. Con base en esta evidencia, la estación de alta y baja FRETtes pueden ser asignados a los estados en bucle y unlooped, respectivamente.
Para probar el efecto de la curvatura intrínseca del ADN de doble cadena en bucles, se construyeron dos dsDNAs 186 pb con diferentes curvaturas, nombrados (ADN-S) "recto" y (C-DNA) 'curva' en función de su curvatura. La secuencia de 10-mer repitiendo es TTTATCATCC para la ADN-C y TGACAGCAAC para la ADN-S. La curvatura global de cada uno de estos dsDNAs se comprobó mediante PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida), que es el método más ampliamente utilizado para estimar dsDNA curvatura 16,22. Figura 5 muestra que el S-ADN se ejecuta de manera similar a la de ADN del mismo tamaño en la escalera de ADN (comparar los carriles 1 y el carril 2 en la Figura 5). Por otro lado, la ADN-C muestra un tamaño aparente más grande en comparación con su contraparte en la escalera de ADN (~ 1,2 más grande que su tamaño real, ver carril 1 y el carril 3). Esta observación indica que el C-ADN posee una Cu intrínseca mayorrvature que el ADN-S.
La figura 6 muestra una fluorescencia representante tiempo de traza de la ADN-C (Figura 6A) y la correspondiente huella de FRET (Figura 6B). En comparación con el ADN-S (Figuras 4B y 4C), el ADN-C produce más eventos de alto FRET durante el mismo período de tiempo; ADN-C bucles 4 veces más frecuentemente que el ADN-S durante el mismo tiempo de adquisición (Figura 7). Este resultado demuestra que la curvatura intrínseca de ADN puede afectar significativamente la dinámica de bucle.
Para extraer el factor J de la tasa de bucle, es necesario medir la constante de velocidad de segundo orden independiente de la concentración para la hibridación entre dos voladizos desconectados. Una realización de tal medición se muestra en la Figura 8A. La hibridación del oligo Cy3 al oligo Cy5 inmovilizada produce Cy5 ráfagas de intensidad debido al traste. De múltiples measurements con diferentes concentraciones de Cy3-oligo (ver Figura 8B), se puede extraer de una manera estadísticamente robusta. En nuestro experimento, la constante de velocidad de recocido entre los dos oligos en NaCl 500 mM, se determinó que era 0,45 ± 0,04 x 10 6 M -1 seg -1. El factor de J se calculó dividiendo la tasa de bucle (bucle k) por la constante de velocidad de recocido de segundo orden (k 'recocido). Fue 61 ± 3 nM para la ADN-S y 265 ± 48 nM para la ADN-C. El factor J de la ADN-S (Figura 9) está de acuerdo razonable con mediciones anteriores en longitud similar 7.
Figura 1. Tipo Objetivo TIRFM. A) de excitación óptica. Las 532 nm y 640 nm láseres son colimados por separado a un simildiámetro ar, combina en el mismo camino por un espejo dicroico, y se centró en un pequeño espejo elíptico colocado debajo de la abertura de la espalda objetivo. Es importante utilizar una lente acromática para el enfoque para minimizar la aberración cromática. B) La óptica del microscopio. La posición lateral del espejo en miniatura tiene que ser ajustado con precisión para que pueda reflejar el haz de láser a través de el objetivo mientras mínimamente el bloqueo de la emisión de fluorescencia. Por lo tanto, debe estar montado en una pequeña etapa de traducción. Otra espejo en el lado opuesto refleja el láser saliente para evitar que entre en la óptica de detección. En el plano de la imagen fuera del cuerpo del microscopio, una rendija ajustable se coloca para recortar la imagen a la mitad del tamaño de la zona de detección de la CCD. La emisión de fluorescencia se divide por un espejo dicroico en dos canales, y las lentes de relé formar la segunda imagen en el CCD con un aumento de 1:1. Uno de los espejos reflectores se gira ligeramente para compensar el donantey aceptores de imágenes. Un paso de banda y unos filtros de paso largo se utilizan para reducir el fondo de los canales de donante y receptor, respectivamente. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Control de temperatura para los experimentos de una sola molécula. La temperatura ajustada (T s) es la lectura en el enfriador de agua / calentador. La temperatura real (T a) se mide por un termopar en contacto con la superficie superior del cubreobjetos en el microscopio. La trama de las temperaturas reales frente a seis temperaturas nominales diferentes (cuadrados negros) muestra una excelente linealidad (verde línea discontinua). La robustez del controlador se muestra mediante mediciones aleatorias realizadas en épocas posteriores (rombos rojos). La inserción es la imagen de la co temperaturaunidad y el objetivo ntrolling en su montaje final. La línea roja representa una pendiente de la unidad. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. ADN Design. A) Curved dsDNA. Un ADN de doble cadena 10-mer se representa como un segmento de tubo curvado, y las dos hebras sencillas como líneas de trazos. El eje helicoidal de cualquier ADN 10-mero no es perfectamente recto, y por lo tanto cada concatenación de un 10-mer tal dará lugar a la inclinación incremental del eje de la hélice en la misma dirección. Este efecto puede ser explotado para generar un plano, molécula superhelicoidal. B) preparación basada en PCR de ADN de doble cadena. Los ADN de cadena simple se muestran como una línea horizontal. Su curvatura real no se representa aquí. El segmento central en negro representa la parte única del fragmento de ADN. Se muestra en gris claro son las secuencias adaptadoras comunes a todas las AND utilizados en este estudio. Primer 1 y 4 hibridan con los adaptadores delanteros y traseros, respectivamente. Primer 2 está marcado con Cy3 en el extremo 5 '. Primer 3 tiene una etiqueta de biotina en el extremo 5 'y un Cy5 vinculado internamente. Las regiones de color azul claro de cebador 2 y 3 contienen secuencias complementarias que funcionan como extremos pegajosos. Cualquiera de un plásmido o ADN genómico que contiene la secuencia de interés se utiliza como plantilla en dos reacciones de PCR separadas. Se produce Cy3 marcado con ADN de doble cadena usando el cebador 1 y 2, y el ADN marcado con Cy5 biotinilado se produce usando el cebador 3 y 4. Estos dos productos de PCR se calienta y se enfría en conjunto para el intercambio de cadenas. Cuatro dsDNAs diferentes se forman, sólo uno de los cuales contiene Cy3, Cy5, y biotina. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 4. Esquema experimental. A) Single-molécula FRET experimento. moléculas de ADN de doble cadena marcado con Cy3 (verde) en un lado y Cy5 (rojo) en el otro se inmovilizan en el PEG (polietilenglicol), revestida superficialmente. Looping reversible y unlooping de dsDNAs resultado (unlooped) estados de alta FRET (bucle) y baja FRET, respectivamente. B) Una curva del tiempo de una sola molécula típica de los donantes (verde) y aceptor (rojo) las intensidades de fluorescencia. Los estados FRET altas y bajas se identifican como los estados en bucle y unlooped, respectivamente. También se indica la primera vez bucle que se utiliza para calcular la tasa de bucle. (Recuadro) El zoom en el gráfico muestra el anti-correlación de las intensidades de Cy3 y Cy5. C) Una marca temporal de la eficiencia FRET calculado a partir de la intensidad de los donantes y aceptor traza en B. Figura 4B y
Figura 5. Electroforesis en gel de poliacrilamida (29.2:0.8 acrilamida / bis-acrilamida, 5% en tampón TBE, pH 8,0) de ADN sintéticos. De izquierda a derecha, los carriles contienen 1 kb marcador, el ADN recto 186 pb y 186 pb de la ADN curvado. Esta figura es una adaptación parcial de una publicación previa 12 con permiso. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 6. Trazas representativas de la curva de ADN (ADN-C) (A) y su traza de FRET correspondiente (B). Comparación de la intensidad y la FRET trazas entre S-ADN (Figuras 4B y 4C) y C-ADN (Figuras 6A y 6B) muestra claramente que el ADN curvada bucles con más frecuencia que el ADN directamente en las mismas condiciones tampón. (Recuadro) La cifra de zoom-in muestra el anti-correlación de las intensidades de Cy3 y Cy5. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 7. Los medios primeras veces de bucle de la recta y los ADN curvas. Cada time fue extraído de ~ 500 moléculas en 5 campos diferentes. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) calculada a partir de 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 8. Determinación de la constante de velocidad de recocido de la hibridación de oligo. A) Vista esquemática de la medición de la frecuencia de recocido. Cebador Cy5 se inmoviliza sobre la superficie, y el cebador Cy3 está presente en 50-180 nM. Unión y separación de la imprimación Cy3 a 50 nM producen de forma reversible y conducir a estallidos aceptores detectables, que se muestra en el recuadro. B) La tasa de recocido depende linealmente de la concentración de la oligo libre. La pendiente de la línea representa la constante de velocidad de recocido de segundo orden (k 'ANNEA l). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 9 Los factores J de los ADN rectas y curvas calculadas en nM El factor J se determinó sobre la base de dos mensurables:... La tasa de bucle del bucle dsDNA y la constante de velocidad de hibridación de los salientes complementarios gratis Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
| Componente | Volume/50 l reacción | La concentración final |
| 36 l | ||
| Búfer phusion 5x | 10 l | 1x |
| MM dNTPs 10 | 1 l | 200 M cada uno |
| Cebador directo (25 M) | 1 l | 0,5 M |
| Cebador inverso (25 M) | 1 l | 0,5 M |
| Phusion arranque en caliente ADN polimerasa (2 U / l) | 0.5 l | 0,02 U / l |
| Plantilla de ADN | 0.5 l | ~ 1 ng |
Tabla 1. Mezcla de reacción PCR. El protocolo se ha optimizado para la ADN polimerasa Phusion. Los productos que se deben agregar en este orden.
| Etapa del ciclo | Temperatura | Tiempo | Número de ciclos |
| La desnaturalización inicial | "> 95 ° C30 seg | 1 | |
| La desnaturalización | 95 ° C | 5 seg | 30 |
| Recocido | 60 ° C | 10 seg | |
| Extensión | 72 ° C | 15 seg / KB | |
| La extensión final | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 y #176; C | mantener |
Tabla 2. Instrucciones de los ciclos de PCR. La temperatura de hibridación se determina basándose en las temperaturas de fusión de los cebadores. El tiempo de extensión se ha optimizado para la ADN polimerasa Phusion.
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Discussion
Se utilizó un ensayo simple de una sola molécula basado en FRET para estudiar la cinética de bucle de ADN de diferentes formas intrínsecas. ADNs curvados se pueden preparar mediante la repetición de una secuencia de 10-mer, en fase con el período helicoidal de 10,5 pb, y sus curvaturas pueden ser estimados utilizando la página. Estos dsDNAs están diseñados con extremos pegajosos para permitir la estabilización transitoria de bucle. Se extrajo la tasa de bucle desde el aumento exponencial en el número de moléculas en bucle en el tiempo. La constante de velocidad de recocido entre los segmentos extremos pegajosos desconectados se utiliza para determinar la concentración equivalente de la densidad de probabilidad de bucle, que se conoce como el factor de J.
En un ensayo de ciclación de ADN basado en la ligasa, la medición de la probabilidad de cierre de ADN es sensible a la concentración de la ligasa, y el factor de J puede ser sobreestimado si ligasa es excesiva 9. Vinculante de ADN ligasa de ADN no específico también puede afectar a la de bucle 10. Por otra parte, las Ligasactividad de correo depende de sal y se desintegra con el tiempo. Por lo tanto, es difícil de estudiar bucle de ADN en condiciones subóptimas para la actividad ligasa. En contraste, un ensayo de bucle basado en FRET está libre de todas estas preocupaciones.
Nuestro protocolo experimental es similar a la de Vafabakhsh y Ha 13 excepto dos aspectos importantes que son digno de discusión. Vafabakhsh y Ha 13 construyeron sus moléculas de ADN de doble cadena mediante la ligación de varios oligos sintéticos. Aunque el error (inserción, supresión, o sustitución) tasa por nucleótido en la síntesis de oligo es insignificante (f 0,181%) 23, la fracción de secuencias de ADN no deseadas aumenta linealmente con la longitud del oligo. Por lo tanto, una muestra duplex de 100 pb preparado por este protocolo puede contener hasta ~ 33% dúplex imperfectos que pueden resultar en una mayor tasa de bucle 24. En comparación, nuestro protocolo utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para sintetizar las moléculas de ADN de doble cadena, que tiene una fidelidad mucho mayor que Che ADNmosynthesis 25. De acuerdo con los datos del fabricante, la polimerasa de alta fidelidad se utilizó generaría una molécula de ADN 100 pb correcta en 99.8% de probabilidad después de 30 ciclos de amplificación por PCR.
Otra diferencia clave entre los dos estudios es el esquema de inmovilización superficie. En nuestro estudio, moléculas de ADN están unidos a la superficie a través de sus extremos, mientras que en el protocolo por Vafabakhsh y Ha 13, están unidos a través de una base interna. Se predijo que basado en el efecto de confinamiento solo, un ADN de doble cadena fijada internamente puede bucle con más frecuencia que un ADN de doble cadena libre, hasta un factor de cinco dependiendo de la ubicación de fijar interna 26. Por lo tanto, al medir el factor de J como una función de longitud de contorno de ADN, los clavos interna puede introducir variabilidad inesperada. También es posible que la base modificada con el enlazador tiene una capacidad de apareamiento de bases más débil, lo cual puede resultar en una tasa de bucle superior. Sin embargo, despite estas aparentes diferencias, los dos protocolos producen factores J similares en 100 pb (~ 3 nM vs ~ 2 nm).
Este ensayo de bucle basado en FRET es una promesa para el estudio de una amplia gama de fenómenos relacionados con looping dsDNA incluyendo el efecto de los desajustes, muescas o huecos en dsDNA bucle 27, el efecto de la unión al ADN proteínas en dsDNA looping, y dependencia de la temperatura de la flexibilidad dsDNA. Estos temas serían difíciles de abordar con la ciclación a base de ligasa convencional. El ensayo de bucle basado en FRET también puede ser utilizado para medir el factor J vs la longitud de contorno, que es la relación estándar para probar los modelos de polímero. Sin embargo, el protocolo que presentamos aquí no es muy adecuado para el estudio de un bucle de ADN de doble cadena más corta que 100 pb. Por debajo de esta longitud, ADN de doble cadena de bucle se convierte en extremadamente lenta, y por lo tanto la velocidad medida se verá afectado por otros procesos no deseados tales como fotoblanqueo. Se puede acelerar la cinética de bucle aparentes por nosotrosing alta concentración de sal ([Na +]> 500 mM), pero relevancia fisiológica de dicha medición se convierte en cuestionable. Por lo tanto, la investigación de ADN de doble cadena de flexión en escalas de longitud por debajo de 100 pb se beneficiará de un ortogonal enfoque para ensayos basados en ciclación.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Damos las gracias a James Waters, Gable Wadsworth y Bo Broadwater para la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos a cuatro revisores anónimos por proporcionar comentarios útiles. Reconocemos el apoyo financiero del Instituto de Tecnología de Georgia, el premio a la Trayectoria Fondo Burroughs Wellcome en la interfaz de la Ciencia y la concesión de la red de investigación de estudiantes de la NSF Física de Sistemas Vivos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
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