Summary
Denna studie visar en detaljerad experimentell procedur för att mäta looping dynamik dubbelsträngat DNA med användning av en enda molekyl fluorescensresonansenergiöverföring (FRET). Protokollet beskriver också hur man extrahera looping sannolikhetstätheten kallas J faktorn.
Abstract
Bockning av dubbelsträngat DNA (dsDNA) förknippas med många viktiga biologiska processer som DNA-protein erkännande och DNA-förpackning i nukleosomer. Termo av dsDNA böjning har studerats av en metod som kallas cyklisering som förlitar sig på DNA-ligas för att kovalent ansluta korta klibbiga ändar av en dsDNA. Däremot kan ligation effektivitet påverkas av många faktorer som inte är relaterade till dsDNA looping exempel DNA-strukturen som omger de sammanfogade klibbiga ändarna och ligas kan också påverka de looping hastigheten genom mekanismer som t.ex. icke-specifik bindning. Här visar vi hur man mäter dsDNA looping kinetik utan ligas genom att upptäcka övergående DNA slinga bildas genom FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA-molekyler är uppbyggda med hjälp av en enkel PCR-baserat protokoll med en FRET par och en biotin länkare. Repetitionssannolikhetstäthet känd som J faktorn extraheras från looping hastigheten och glödgning hastigheten mellan två frånkopplingted klibbiga ändar. Genom att testa två dsDNAs med olika inneboende krökningar, visar vi att J faktor är känslig för den inneboende formen av dsDNA.
Introduction
Förstå de mekaniska egenskaperna för dsDNA är av grundläggande betydelse i grundläggande vetenskaper och tekniska tillämpningar. Strukturen för dsDNA är mer komplicerad än en rak spiralstege eftersom rulle, tilt och twist vinklar mellan varandra baspar kan variera med sekvens. Termiska fluktuationer kan orsaka dsDNA att genomgå olika former av konformationsförändringar såsom böjning, vridning och stretching. Övergångar såsom smältning och veck kan också förekomma i extrema förhållanden.
Bland dessa motioner, har dsDNA böjning den mest märkbara biologiska effekter 1. dsDNA böjning är associerad med genen repression eller aktivering genom att två avlägsna platser nära varandra. Den spelar också en viktig roll i DNA-förpackningar inne i cellkärnan eller en viral kapsid. Böjning deformation av dsDNA kan visualiseras experimentellt genom högupplösande mikroskopi (AFM 2 och TEM 3) och thermodynamics och kinetik kan studeras genom att kretsa analyser, som är kemiskt länkar intill varandra belägna platser i dsDNA.
En sådan analys är ligasberoende cyklisering 4. I denna analys är dsDNA-molekyler med "klibbiga" (kohesiva) ändar cirkulariseras eller dimeriseras genom DNA-ligas. Genom att jämföra hastigheterna av cirkeln och dimerbildning kan man erhålla en effektiv molära koncentrationen av den ena änden av DNA i närheten av den andra änden, som är känd som J-faktor. Denna J faktor är dimensions ekvivalent med sannolikhetstätheten för att finna en änden av DNA på ett kort avstånd från den andra änden, och således återspeglar flexibiliteten hos DNA. Mätning av J faktorn som funktion av DNA längd avslöjar många egenskaper om DNA-mekanik inklusive persistens längd 4,5.
Den maskliknande kedja (WLC) modell har allmänt betraktas som den kanoniska polymer modell för dsDNA mekaniker som baseras på dess framgång i förklaringining de kraft-förlängningskurvor som erhållits i DNA drar experiment 6, och korrekt förutsäga J faktorer dsDNAs längre än 200 bp 7. Men med hjälp av cykliseringen analysen på dsDNA-molekyler så korta som 100 bp, Cloutier och Widom mätte J faktorer vara flera tiopotenser högre än WLC modellen förutsägelse 8. Ett år senare, Du et al. producerat J faktorer i samförstånd med WLC modellen med cykliseringssteget analysen med lägre koncentrationer av ligas och ges avvikande resultat från Widom gruppen för höga ligas koncentrationer som används 9. Denna kontrovers exemplifierar den oundvikliga påverkan av DNA-ligas på cykliseringsbetingelser kinetik när du använder den konventionella analysen 9. Dessutom kan DNA-ligas också påverka DNA-strukturen och stelhet genom icke-specifik bindning 10,11.
För att eliminera de tekniska frågorna för proteinberoende looping analyser, nyligen visade vi en protein fria looping analys baserad på fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) 12. I denna metod är slingkopplade konformationer detekteras av FRET mellan givaren och acceptorn fäst nära de klibbiga ändarna av en DNA-molekyl. Ett mål-typ total inre reflektion fluorescensmikroskop (TIRFM) används för att registrera banor av reversibel looping och unlooping händelser från yt-immobiliserade enstaka DNA-molekyler för en längre tid. Denna metod har PCR-baserad sammansättning av DNA-molekyler för att generera mismatch-free DNA-molekyler, vilket är en avgörande förbättring i förhållande till en liknande metod av Vafabakhsh och Ha 13. Den enda molekyl aspekt av detta protokoll möjliggör mätning av distributioner förutom ensemble genomsnitt medan FRET aspekten gör att man kan mäta DNA-looping dynamik upprepade gånger från samma molekyl, även i förhållanden som kan försämra ligas aktivitet.
Den TIRFM installationen visas i figur 1. En anpassadDesignade exemplar skede placeras över en Olympus IX61 mikroskopkroppen. 532 nm och 640 nm lasrar införs från sidan och reflekteras av små elliptiska speglar 14 i den höga NA målet att uppnå en kritisk infallsvinkel på täckglas-vatten-gränssnitt. Vi noterar att mer utbredd genom-mål TIR använder dikroitiska speglar eller prismabaserade TIR uppställningar kan också användas för detta FRET-applikation. Den fluorescensbild som bildas av mikroskopet är uppdelad i donator-och acceptor bilder genom en dikroisk spegel. De är sedan åter avbildas på två halvor av en EMCCD. Ytterligare långpassemissionsfilter används för att reducera bakgrundssignalen.
Temperaturreglering är nödvändig för att förvärva reproducerbara kinetiska data. För temperaturreglering, är målet separeras från nosdel av mikroskopkroppen för att minimera värmeöverföring, och vatten från en temperaturstyrd kylmaskin / värmare cirkuleras genom en mässings krage som tätt passarrunt det inre metallen under målet jacka. Denna inställning kan uppnå robust temperaturkontroll vid täckytan mellan 15 och 50 ° C (figur 2). I detta arbete var provtemperaturen hölls vid 24 ° C.
Följande protokoll visar steg-för-steg förfarande för DNA-konstruktion, uppskattning av DNA-form, enda molekyl experiment och J faktor bestämning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DsDNA Provberedning
- Designa globalt böjda DNA genom att upprepa en 10-mer sekvens. Till exempel, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'är en 186-bp krökt DNA där X är en slumpmässig extra bas och sekvensen som flankerar upprepande 10-mer-sekvens är adaptersekvenser.
OBS. I det här exemplet två 10-merer med motsatta preferenser till nukleosomen formation baserad på en storskalig nukleosomen uthyrnings studie av Kaplan m.fl. 15 valdes. Eftersom den skruvformiga upprepning av dsDNA är nära till 10 bp, kommer någon netto avböjning av den spiralformade axeln för 10-meren ackumuleras för att producera en form som en cirkelbåge (figur 3A). Eftersom den skruvformiga perioden är närmare 10,5 bp, är en extra bas införas efter varje två upprepningarna för att hålla den krökta strukturen så plana som möjligt. Dessa sekvenser är kortare än 200 bp kan beställas från Companies som erbjuder gen syntes service. Det är bekvämt att flankera dessa sekvenser med gemensamma adaptersekvenser för efterföljande steg. Proceduren schematiseras i figur 3B. - Utför PCR med primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) och primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). OBSERVERA: Primer 2 är märkt med FRET-givare Cy3 vid 5'-änden. En typisk PCR-recept och cykling protokoll presenteras i tabell 1 och 2.
- Utför PCR med Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) och primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). OBSERVERA: Primer 3 är märkt med FRET-acceptor Cy5 genom ryggraden och biotin-linker vid 5'-änden. PCR-recept och cykling protokollet är som ovan.
- Rena PCR-produkterna med användning av en PCR Cleanup kit.
- Blanda Cy3-märkta produkten och den Cy5-märkta produkten i en buffert för strängutbyte (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) vid slutkoncentrationer av 0,4 &# 181, M och 0,1 ^ M, respektive. OBSERVERA: Överskottet Cy3-DNA ökar koncentrationen av duplexen som överför både Cy3-och Cy5 som ett resultat av strängutbyte.
- Utbytes strängarna genom inkubation vid 98,5 ° C under 2 min, gradvis kylning till 5 ° C med ramphastighet av 0,1 ° C / sekund, och inkubering vid 5 ° C under 2 timmar.
2. Gelelektrofores att upptäcka dsDNA krökning
- Häll polyakrylamidgel 16,17 genom blandning av akrylamid och bis-akrylamid-lösningar vid 29.2:0.8 Grad, 5% (vikt / volym) i 1 x Tris / Borat / EDTA (TBE)-buffert vid pH 8,0. OBS: 10 ml gel lösning innehåller: 1.217 ml 40% akrylamid, 0,667 ml 2% bis-akrylamid, 1 ml TBE 10X, 100 L ammoniumpersulfat (APS) 10%, 10 L TEMED, och resten dH 2 O. Fullständig stelning av gelén tar ca 30 min.
- Fyll på polyakrylamidgel med DNA-prov och DNA-stege i 1 x laddningsbuffert (5% glycerol, 0,03% (vikt / vol) bromfenol blue) och kör gelén vid 5-8 V / cm vid 4 ° C under 45 min eller tills färgen närmar sig slutet av gelén.
- Färga gelén med användning av 1 X TBE-buffert, som innehåller 0,5 g / ml etidiumbromid under 30 min. Identifiera de DNA-banden under UV-belysning. Jämför bandpositioner med storleksmarkör (100 bp DNA-stege) för att beräkna den skenbara storleken på de DNA-molekyler. OBS: Curved DNA rör sig i allmänhet långsammare än raka DNA.
3. Flödescellberedning
- Borra 6-7 par av hål längs två motsatta kanter av en glasskiva (3'' x 1'') med hjälp av en borr press och diamantborr. Efter borrning, gnugga bilden i strömmande vatten för att avlägsna synliga glaspulver. OBS: Hålen fungerar som perfusion inlopp och utlopp. Under borrning är viktigt för att förhindra sprickbildning kylning sliden med vatten.
- Placera objektglasen i upprätt läge i en glasburk och fylla den med vatten. Sonikera under 15 min och överföra dem till en annan glasburk dedicated för aceton rengöring. Fyll den med aceton och sonikera under 15 minuter. Skölj objektglasen med etanol med hjälp av en sprayflaska och sedan med vatten. Placera dem i en polypropylen-burk, fylla den med 5 M kaliumhydroxid och sonikera under 15 minuter. Slutligen sonikera glasen i vatten under 15 min. Rengör täckglas (nr 1, 24 x 40 mm) med användning av samma protokoll. OBS: Rengjorda diabilder och täckglas kan lagras i dH 2 O för långtidsbehandling.
- Blanda 1 mg biotin-PEG-silan (molekylvikt 3400) med 80 mg mPEG-silan (molekylvikt 2000) i 340 L av 0,1 M natriumvätekarbonatlösning. Blanda väl och centrifugera blandningen snabbt för att bli av med bubblor. OBS: Den funktionalisering av ytan med polyetylenglykol (PEG) hjälper till att minska ospecifik bindning av DNA till ytan.
- Sätt 80 L av PEG-lösningen på varje bild och försiktigt sänka ett täckglas över den. Vänta i 45 min. Separera täckglas från bilden med pincett, skölj med rikligt med dH 2 O och låt tfåll torka i fria luften.
- Placera tunna remsor av dubbelhäftande tejp över bilden för att bilda kanaler. Rikta in ett täckglas över den och tryck fast täckglaset mot bilden att bilda vätsketäta kanaler. Använd 5 minuters epoxy för att försegla kanterna av kanalerna.
4. Beredning av Trolox Solution
- Sätt ~ 30 mg Trolox och 10 ml dH 2 O i en kolv och använda en magnet omrörare för att röra om i lösningen i fria luften i 18 timmar.
- Filtrera lösningen med användning av ett 0,2 pm filter och justera pH till 7 genom tillsats av ~ 6 | il av 1 M Tris-bas (pH 11). Anm: Trolox är ett anti-blinkande reagens som vanligen används i en enda molekyl Studier 18. Den antifading verkan Trolox kommer från dess oxiderade derivat som finns i delvis försämrat Trolox lösning 19. Snabbt upplösa Trolox i metanol eller höga pH Tris-lösning bör undvikas på grund av ineffektiv oxidation.
5. Single-molecule Imaging
- Injicera 15 ul av NeutrAvidin-lösning (0,5 mg / ml) in i kanalen och vänta 2 min före sköljning med 100 | il av T50-buffert (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,0).
- Injicera 50 ìl av DNA-prov (50-100 pM) i kanalen. Vänta i 5 minuter och skölj den obundna DNA undan med 100 L av T50-buffert. OBSERVERA: DNA-molekyler kommer att binda specifikt till ytan via NeutrAvidin-biotin-interaktion.
- Fyll den kanal med bildbuffert som innehåller ett syreupptagningssystem 20 (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox och 500 mM NaCl).
- Ställ EMCCD i ram-överföringsläge för att strömma 2 x 2 arkiveras bilder (256 x 256) till datorn på 25 bilder per sekund.
- Sätt immersionsolja på mikroskop målet, och fixa flödescellen på mikroskop scenen med hjälp av prov klipp. Grov-justera fokus genom att titta på laserreflektionsmönstret på väggen. Fin justera fokus med live view av fluorescens imåldrar på bildskärmen.
- Börja datainsamling med 532 nm laser på. Kontrollera live view och justera fokus om det behövs. Stoppa datainsamling när de flesta molekyler har photobleached.
OBS: I denna anläggning, ett lab-skrivna C-program för att styra mikroskopet och visa live-bilder på skärmen när de sparas på hårddisken används.
6. Bildbehandling och dataanalys
OBS: En tidsserie av 256 x 256 bilder behandlas av en MATLAB-kod för att generera enda molekyl tid spår av Cy3 och Cy5 intensiteter. För att para ihop bildpunkter mellan givaren kanalen och acceptor kanalen i delad vy bild, 6-7 par Cy3 och Cy5 fläckar, varje par från samma molekyl jämnt spridda över synfältet, manuellt plockas, och en affin transformation beräknas med hjälp av koordinaterna för dessa fläckar som förankringspunkter.
- Med hjälp av ett MATLAB-skript, titta igenom alla enda molekyl tiden spårar thatt visar flera övergångar mellan låga och höga FRET signaler. Identifiera de loopas och unlooped stater.
OBS: FRET signal definieras som Cy5 intensitet (I a) dividerat med summan av Cy3-och Cy5-intensiteter (I en + I D). Loopas stat har hög FRET värde samtidigt unlooped stat har låg FRET värde. Histogrammet för FRET signaler från en enda molekyl bimodally fördelad på grund av reversibel looping och unlooping. - Hitta den tröskel som skiljer de två fördelningarna genom att bestämma skärningspunkten mellan de två inpassade gausskurvorna.
- Beräkna FRET effektivitet som
och tilldela sling stater med hög FRET värden och unlooped stater med låga FRET värden. - Med hjälp av ett MATLAB-skript, analysera den kumulativa antalet molekyler (N (t)) som loopas (ellernått höga FRET staten) vid olika förfaller tids sedan början av datainsamling. OBS: Eftersom en dsDNA-molekyl kan börja i någon konformation av unlooped staten i början av datainsamling, ökningstakten i loopas befolkningen speglar den genomsnittliga looping kurs genomsnitt över initiala konformationer. Extrahera looping hastigheten k loop genom att montera N (t) med en exponentiell funktion:
Om ökningar bifasiskt, kan den vara försedd med en dubbel exponentialfunktion: 
I detta fall är k slinga erhållas från: 
NOTERA: Teoretiskt är överlevnadssannolikhet att en polymer inte har loopas vid tiden t inte är en enkel eller dubbel exponentiell funktion 12. Exponentiell fittning används som ett praktiskt sätt att extrahera den genomsnittliga looping tid.
och tilldela sling stater med hög FRET värden och unlooped stater med låga FRET värden. 
Om ökningar bifasiskt, kan den vara försedd med en dubbel exponentialfunktion: 
I detta fall är k slinga erhållas från: 
NOTERA: Teoretiskt är överlevnadssannolikhet att en polymer inte har loopas vid tiden t inte är en enkel eller dubbel exponentiell funktion 12. Exponentiell fittning används som ett praktiskt sätt att extrahera den genomsnittliga looping tid. 7. Fastställande av J Factor
OBS: J faktor representerar hur koncentrerad en ände av en dsDNA är runt den andra änden. Den kan bestämmas genom interpolering av koncentrationen av ett ändsegment av DNA: t som skulle alstra samma reaktionshastighet med den andra änden segment som mätt looping hastigheten. Experimentellt, är ena änden segment immobiliserade på ytan, och den andra änden segmentet införs vid en viss koncentration c.. Om den uppmätta glödgning hastigheten mellan de två ändarna är k glödgning, sedan J faktor 21 som ges av 
. Glödgningen hastighetskonstanten (k glödgning = k hybridiserings / C) är oberoende av sondkoncentrationen.
- Flöde 20 l av 30-50 pM biotin-Cy5 oligo (Primer 3) into en NeutrAvidin belagd kanal. Skölj kanalen med 100 ^ T50 för att tvätta bort obundna oligonukleotider.
- Förbered bildåtergivningsbuffert såsom beskrivs i del 5 med tillägg av Cy3 oligo (primer 2) vid en slutlig koncentration av 50 nM. Flödes denna bildbufferten in i kanalen.
- Samtidigt som 532 nm laser på, slår kort på 640 nm laser för att identifiera platser för yt-bundna Cy5 oligos. Stäng av 640 nm laser och börja övervaka FRET signal.
OBSERVERA: vid hybridisering av en Cy3-oligo till en ytbunden Cy5 oligo kommer Cy5 fluorescens uppstår FRET. - Med hjälp av en MATLAB manus, analysera antalet molekyler som börjar i det obundna tillståndet (låg Cy5 intensitet) men senare visar i glödgat tillstånd (högt Cy5 intensitet) som en funktion av tiden från Cy5 intensitets spår.
- Rita detta antal glödgade molekyler vs tid. Montera denna kurva med en enda exponentiell funktion (
(k glödga). - Upprepa detta experiment vid olika Cy3 oligo koncentrationer (60, 100 och 180 nm) för att bekräfta linearitet mellan glödgningen hastigheten och reaktant-koncentrationen. Extrahera den andra ordningens glödgning hastighetskonstanten (k glödga ) Från lutningen.
- Beräkna J faktor från
, Där k slinga är repetitionshastigheten mätt i samma buffert tillstånd.
(k glödga). 
, Där k slinga är repetitionshastigheten mätt i samma buffert tillstånd. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA-molekyler som används för looping studie består av ett duplex-region av variabel sekvens och längd-och enkelsträngade överhäng som är komplementära till varandra. De överhäng, som är 7-base lång, kan hybridisera till varandra för att fånga upp det slutna tillståndet. Varje överhäng innehåller antingen Cy3 eller Cy5 som är länkad i DNA-ryggraden genom amidit kemi. Den Cy5-överhäng är också kopplad med biotin-TEG (15-atom Tetra-etylenglykol spacer) för ytan immobilisering (se figur 4A). Alla dessa modifikationer kan införlivas med dsDNA efter en PCR-baserat protokoll (protokoll 1 och Figur 3B). Den valda längden och sekvensen av överhäng fungerar bra för att producera detekterbara och reversibla FRET händelser i normala experimentella betingelser. Den looping och unlooping kinetiken för DNA-slinga är känsliga för den omgivande temperaturen, och därför är väsentligt för reproducerbarhet en temperaturregulator. En sådan controller lätt kan införlivas med mikroskop (Figur 2).
Använda TIRFM, anti-korrelerade fluktuationer i Cy3 (donator) och Cy5 (acceptor) signaler från yt-immobiliserade dsDNA-molekyler observerades (Figur 4B). I det slutna tillståndet, är avståndet mellan två färgämnena är mindre än 5 nm, vilket skulle resultera i höga Cy5 signal och låg Cy3 signal på grund av hög FRET effektivitet (fig. 4A och 4C). Flera kontrollexperiment utfördes för att bevisa att den höga FRET tillstånd representerar looped state. Livslängden på den höga FRET tillstånd ökade med ökande överhäng längd, vilket tyder på att den höga FRET tillstånd stabiliseras genom basparning mellan de två överhäng. Livslängden på den höga FRET staten minskade med minskande DNA-längd, vilket förväntas eftersom sling fri energi ökar när slingan blir mindre 12. Baserat på detta bevis, de höga och låga FRET STAtes kan tilldelas till de sling och unlooped stater, respektive.
För att testa effekten av inneboende krökning dsDNA på looping ades två 186 bp dsDNAs med olika krökningar konstrueras, som heter "straight" (S-DNA) och "böjd" (C-DNA) baserat på deras krökning. Den repeterande 10-mer-sekvens är TTTATCATCC för C-DNA och TGACAGCAAC för S-DNA. Den totala krökning av varje av dessa dsDNAs kontrollerades genom PAGE (polyakrylamidgelelektrofores), som är den mest använda metoden för att uppskatta dsDNA krökning 16,22 figur 5. Visar att S-DNA körs på liknande sätt som DNA av samma storlek i DNA-stege (jämför rad 1 och rad 2 i fig 5). Å andra sidan visar den C-DNA en större skenbar storlek jämfört med dess motsvarighet i DNA-stege (~ 1,2 större än dess verkliga storlek, se bana 1 och bana 3). Denna observation visar att C-DNA har en större inneboende curvature än S-DNA.
Figur 6 visar ett representativt fluorescenstidskurva från den C-DNA (figur 6A) och motsvarande FRET spår (Figur 6B). Jämfört med S-DNA (figur 4B och 4C), producerar C-DNA fler höga FRET händelser under samma period; den C-DNA-öglor 4 gånger oftare än S-DNA under samma förvärvstiden (figur 7). Detta resultat visar att inneboende krökning av DNA väsentligt kan påverka looping dynamik.
För utvinning av J faktor från looping hastigheten, måste man mäta koncentrationen oberoende andra ordningens hastighetskonstant för hybridisering mellan två urkopplade överhäng. En realisering av en sådan mätning visas i Figur 8A. Hybridisering av Cy3 oligo till den immobiliserade Cy5 oligo producerar Cy5 intensitet skurar pga att gräma. Från flera meaarna med olika Cy3-oligo koncentrationer (se figur 8B), kan man utvinna i ett statistiskt robust sätt. I vårt experiment glödgningen hastighetskonstanten mellan de två oligos i 500 mM NaCl bestämdes vara 0,45 ± 0,04 x 10 6 M -1 sek -1. J faktorn beräknades genom att dividera den looping hastighet (k slinga) av den andra ordningens glödgning hastighetskonstanten (k 'glödgning). Det var 61 ± 3 nM för S-DNA och 265 ± 48 nM för C-DNA. Den J faktorn för S-DNA (figur 9) är i rättvis överenskommelse med tidigare mätningar vid samma längd 7.
Mål-typ TIRFM. A) Figur 1. Magnetiseringssystem optik. De 532 nm och 640 nm laser kollimeras separat till en similar diameter, slås ihop till samma väg genom en dikroisk spegel, och fokuseras på en liten elliptisk spegel placerad under målet tillbaka bländare. Det är viktigt att använda en akromatisk lins för fokusering för att minimera den kromatiska aberrationen. B) mikroskop optik. Den laterala positionen för miniatyr spegel måste finjusteras så att den kan reflektera laserstrålen genom objektiv medan minimal blockerande fluorescensemission. Därför måste den monteras på en liten translationssteg. En annan spegel på motsatta sidan reflekterar den utgående laser för att förhindra den från att komma in i detektionsoptiken. Vid bildplanet utanför mikroskopkroppen, är en justerbar slits placeras för att beskära bilden till halva storleken av detekteringsområdet av CCD. Fluorescensemissionen är uppdelad av en dikroisk spegel i två kanaler, och relälinser bildar den andra bilden på CCD med 1:1 förstoring. En av de reflekterande speglarna är något roterad för att kompensera den donatoroch acceptor-bilder. En bandpass och ett långpass filter används för att minska bakgrunden i donator och acceptor kanaler, respektive. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Temperaturreglering för enda molekyl experiment. Den inställda temperaturen (T s) är behandlingen av vattenkylare / värmare. Den faktiska temperaturen (T a) mätes med ett termoelement i kontakt med den övre ytan av täckglas på mikroskopet. Handlingen i de faktiska temperaturerna vs sex olika inställda temperaturer (svarta fyrkanter) visar utmärkt linjäritet (grön streckad linje). Robustheten regulatorn visas av slumpvisa mätningar som gjorts på senare tid (röda diamanter). Den infällda bilden är bilden av co temperaturenntrolling enheten och objektiva i sin slutmontering. Den röda linjen representerar en lutning av enighet. Klicka här för att visa en större bild.
DNA design. A) Figur 3. Böjd dsDNA. En 10-mer dsDNA representeras som ett krökt rörsegment, och de två enkelsträngarna som streckade linjer. Den spiralformade axeln för varje 10-mer-DNA: t inte är helt raka, och därmed varje sammansättning av en sådan 10-mer kommer att leda till steg lutningen på spiralaxeln i samma riktning. Denna effekt kan utnyttjas för att skapa en plan, superhelixmolekylen. B) PCR-baserad beredning av dsDNA. Enkelsträngade DNA: n visas som en horisontell linje. Deras faktiska krökning är inte avbildad här. Det centrala segmentet i svart representerar den unik del av DNA-fragmentet. Visat i ljusgrått är de adaptersekvenser som är gemensamma för alla DNA-sekvenser som används i denna studie. Primer 1 och 4 glödga till de främre och bakre adaptrar, respektive. Primer 2 är märkt med Cy3-vid 5'-änden. Primer 3 har en biotin tag vid 5'-änden och ett internt förbundna Cy5. De ljusblå regioner av Primer 2 och 3 innehåller komplementära sekvenser som fungerar som klibbiga ändar. Antingen en plasmid eller genomiskt DNA som innehåller den intressanta sekvensen används som mall i två separata PCR-reaktioner. Cy3-märkta dsDNA framställs med användning av primer 1 och 2, och biotinylerad Cy5-märkt DNA framställs med användning av primer 3 och 4. Dessa två PCR-produkter som värms och kyls tillsammans för strängutbyte. Fyra olika dsDNAs bildas, endast en av dem innehåller Cy3, Cy5, och biotin. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Experimentell system. A) Single-molekyl FRET experiment. dsDNA-molekyler märkta med Cy3 (grön) på ena sidan och Cy5 (röd) på den andra immobiliseras på PEG (polyetylenglykol)-belagd yta. Reversibel looping och unlooping av dsDNAs resultera i hög FRET (loopade) och låg FRET (unlooped) states, respektive. B) En typisk enda molekyl tidskurva för donatorn (grön) och acceptor (röd) fluorescensintensiteterna. De höga och låga FRET tillstånd identifieras som looped och unlooped states, respektive. Också indikerade är första looping tid som används för att beräkna den looping hastigheten. (Infälld) Zoom-i figuren visar den anti-korrelationen av Cy3 och Cy5 intensiteter. C) En tidskurva för FRET effektiviteten beräknad från donator och acceptor intensiteten spår i B. Figur 4B och
Figur 5. Polyakrylamidgelelektrofores (29.2:0.8 akrylamid / bis-akrylamid, 5% i TBE-buffert, pH 8,0) av den syntetiska DNA. Från vänster till höger, de köer som innehåller 1 kb markör, den 186 bp Hetero DNA och 186 bp Böjd DNA. Denna siffra är delvis anpassat från en tidigare publikation 12 med tillåtelse. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 6. Representativa spår från den krökta DNA (C-DNA) (A) och dess motsvarande FRET spår (B). Jämförelse av intensiteten och FRET spår mellan S-DNA (fig 4B och 4C) och C-DNA (Fig. 6A och 6B) visar tydligt att den krökta DNA-loopar oftare än den raka DNA i samma buffert tillstånd. (Infälld) Den zooma in bild visar anti-korrelationen av Cy3 och Cy5 intensiteter. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 7. Medelvärdet första looping tider på raka och böjda DNA. Varje time extraherades från ~ 500 molekyler i fem olika områden. Felstaplarna representerar standardfelet för medelvärdet (SEM) beräknat från 3 oberoende experiment. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 8. Fastställande av glödgning hastighetskonstanten från oligo hybridisering. A) Schematisk vy av mätning härdningshastigheten. Cy5 primer är immobiliserad på ytan och Cy3 primern är närvarande vid från 50 till 180 nM. Bindning och Obunden av Cy3 primer vid 50 nM inträffar reversibelt och leda till påvisbara acceptor skurar, som visas i den infällda bilden. B) Den glödgning räntan beror linjärt på koncentrationen av den fria oligo. Lutningen på linjen representerar den andra ordningens glödgning hastighetskonstanten (k 'Annea l). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 9 J faktorerna i de raka och böjda DNA beräknas i nM J Faktorn bestämdes utifrån två measurables:... Den looping ränta av dsDNA slingan och glödgning hastighetskonstanten för de fria komplementära överhäng Klicka här för att visa en större bild .
| Komponent | Volume/50 il reaktions | Slutlig koncentration |
| 36 | il | ||
| 5x phusion buffert | 10 | il | 1x |
| 10 mM dNTP | 1 pl | 200 ^ M vardera |
| Forward primer (25 pM) | 1 pl | 0,5 pM |
| Omvänd primer (25 pM) | 1 pl | 0,5 pM |
| Phusion hot start-DNA-polymeras (2 U / ^ il) | 0,5 ^ il | 0,02 U / l |
| Mall-DNA | 0,5 ^ il | ~ 1 ng |
Tabell 1. PCR-reaktionsblandningen. Protokollet är optimerad för den Phusion DNA-polymeras. Objekt bör läggas i denna ordning.
| Cycle steg | Temperatur | Tid | Antal cykler |
| Initial denaturering | "> 95 ° C30 sek | 1 | |
| Denaturering | 95 ° C | 5 sek | 30 |
| Glödgning | 60 ° C | 10 sek | |
| Förlängning | 72 ° C | 15 sec / kb | |
| Slutlig förlängning | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 & #176; C | håll |
Tabell 2. PCR-cykelinstruktioner. Glödgningstemperaturen fastställs baserat på temperaturerna hos primrarna smält. Förlängningen gång är optimerad för Phusion DNA-polymeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel enda molekyl analys baserad på FRET användes för att studera looping kinetiken för DNA: n från olika inneboende former. Böjda DNA: n kan beredas genom att upprepa en 10-mer-sekvens i fas med den spiralformade period av 10,5 bp och deras krökningar kan uppskattas med hjälp av PAGE. Dessa dsDNAs är utformade med klibbiga ändar för att tillåta övergående slinga stabilisering. Vi extraherade looping ränta från den exponentiella ökningen av antalet sling molekyler över tiden. Glödgningen hastighetskonstanten mellan de lossade sticky end segment används för att bestämma koncentrationen ekvivalent av looping sannolikhetstätheten, som är känd som J-faktor.
I ett ligas-baserade DNA-cyklisering analysen är mätning av DNA lutningen sannolikhet känsliga för ligaset koncentration och J faktor kan överskattas om ligas är överdriven 9. Icke-specifik bindning av DNA-ligas till DNA kan också påverka looping 10. Vidare Ligase verksamhet beror på salt och sönderfaller med tiden. Således är det svårt att studera DNA-looping under förhållanden suboptimala för ligasaktivitet. I motsats härtill är en FRET-baserad looping assay fri från alla dessa problem.
Vår experimentella protokollet är liknande det i Vafabakhsh och Ha 13 utom två viktiga aspekter som är värda att diskutera. Vafabakhsh och Ha 13 konstruerat sina dsDNA-molekyler genom ligering av flera syntetiska oligonukleotider. Även om felet (insättning, borttagning eller substitution) ränta per nukleotid i oligo syntes är försumbar (f 0,181%) 23, ökar andelen oönskade DNA-sekvenser linjärt med oligo längd. Därför kan en 100-bp duplex prov utarbetats av detta protokoll innehålla upp till ~ 33% ofullkomliga duplex som kan resultera i högre looping kurs 24. I jämförelse, använder våra protokoll polymeraskedjereaktion (PCR) för att syntetisera dsDNA-molekyler, som har en mycket större trohet än DNA chemosynthesis 25. Enligt tillverkarens uppgifter, skulle den hifi-polymeras vi använde generera en riktig 100-bp DNA-molekyl till 99,8% sannolikhet efter 30 cykler av PCR-amplifiering.
En annan viktig skillnad mellan de två studierna är ytan immobilisering systemet. I vår studie, är DNA-molekyler som bundits till ytan genom sina ändar, medan det i det protokoll från Vafabakhsh och Ha 13, de är bundna via en intern bas. Det förutspåddes att utifrån det begränsande effekten enbart ett internt nålas dsDNA kan slinga oftare än en gratis dsDNA, upp till en faktor fem, beroende på var den interna pinning 26. Därför, vid mätning av J faktorn som funktion av DNA konturlängd, kan intern fastlåsning införa oväntade variabilitet. Det är också möjligt att den modifierade basen med linkern har en svagare basparning kapacitet, vilket kan resultera i en högre loophastighet. Emellertid Despite dessa uppenbara skillnader, de två protokollen ge liknande J faktorer vid 100 bp (~ 3 nM vs ~ 2 nM).
Denna FRET-baserade looping analysen har förutsättningar för att studera ett brett spektrum av fenomen relaterade till dsDNA looping inklusive effekten av felpassningar, hack eller luckor på dsDNA looping 27, effekten av DNA-bindande proteiner för dsDNA looping, och beroendet av dsDNA flexibilitet temperatur. Dessa ämnen skulle vara svårt att ta itu med den konventionella ligasbaserade cyklisering. Den FRET-baserade loopanalys kan också användas för att mäta J faktor vs konturlängd, som är den standard relation till testet polymer modeller. Men det protokoll som vi presenterade här är inte väl lämpad för att studera looping av dsDNA kortare än 100 bp. Nedanför denna längd blir dsDNA looping extremt långsam, och därför det uppmätta hastigheten kommer att påverkas av andra oavsiktliga processer såsom fotoblekning. Man kan påskynda de uppenbara looping kinetiken av ossing med hög saltkoncentration ([Na +]> 500 mM), men fysiologiska betydelsen av sådan mätning blir tveksamt. Därför kommer utredningen av dsDNA böja på längdskalor under 100 bp dra nytta av en strategi vinkelrät mot cykliseringsbetingelser baserade analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar James Waters, Gable Wadsworth och Bo Broadwater för kritiskt läsa manuskriptet. Vi tackar också fyra anonyma granskare för att ge användbara kommentarer. Vi erkänner ekonomiskt stöd från Georgia Institute of Technology, den Burroughs Wellcome Fund Karriär Award på den vetenskapliga gränssnitt, och bidrags eleven forskningsnätverk från NSF fysik levande system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).
