Summary
Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.
Abstract
Iki-şeritli DNA (dsDNA) eğilmesi gibi DNA-protein tanıma ve nükleozom içine DNA paket gibi birçok önemli biyolojik süreçler ile ilişkilidir. DsDNA bükme Termodinamik kovalent bir dsDNA'nın kısa yapışkan uçlarını birleştiren DNA ligaz dayanan bir yöntem denilen siklizasyonu tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu gibi bağlama verimliliği DNA katılan yapışkan uçlarını çevreleyen yapı ve ligaz gibi döngü dsDNA ile ilişkili olmayan bir çok faktör tarafından etkilenebilir, aynı zamanda, non-spesifik bağlanma gibi mekanizmalar yoluyla belirgin ilmek hızını etkileyebilir. Burada, biz FRET (Floresan Rezonans Enerji Transferi) tarafından geçici DNA döngü oluşumunu tespit ederek ligazın olmadan dsDNA ilmek kinetik ölçmek için nasıl göstereceğim. dsDNA molekülleri, FRET çifti ve bir biyotin bağlayıcı ile basit PCR tabanlı bir protokol kullanılarak inşa edilmektedir. J faktörü olarak bilinen döngü olasılık yoğunluk kapa iki döngü arasındaki oran ile tavlama oranı elde edilirted yapışkan biter. Farklı içsel eğriliğe sahip iki dsDNAs test ederek, J faktör dsDNA iç şekline duyarlı olduğunu göstermektedir.
Introduction
DsDNA'nın mekanik özelliklerini anlama, temel bilimler ve mühendislik uygulamalarında temel bir öneme sahiptir. Ardışık baz çiftleri arasına rulo, eğim ve büküm açıları dizisi ile değişebilir çünkü dsDNA'nın yapısı düz bir sarmal merdiven daha karmaşıktır. Termal dalgalanmalar dsDNA gibi, bükme büküm ve germe gibi yapısal dalgalanmalara farklı modları geçmesi neden olabilir. Bu eritme ve dolanmaya olarak geçişleri de aşırı koşullarda oluşabilir.
Bu hareketler arasında, dsDNA bükme en çok dikkat çeken biyolojik etkiye sahiptir 1. dsDNA eğilme birbirine yakın iki uzak siteleri getirerek gen baskıyla veya aktivasyonu ile ilişkilidir. Ayrıca, DNA hücre çekirdeğinin içine ambalaj veya bir viral kapsid önemli bir rol oynar. DsDNA bükülmesi deformasyonu yüksek çözünürlüklü mikroskopisi (AFM 2 ve 3 TEM) ve Thermodyn ile deneysel olarak görselleştirilebiliramics ve kinetik kimyasal dsDNA'nın yan yana sitelere link loop tahliller ile ele alınabilir.
Böyle bir deney, ligaz bağımlı siklizasyon 4'tür. Bu testte, 'yapışkan' (yapışkan) uçları ile dsDNA moleküller sirküle veya DNA ligazı ile dimerize. Daire ve dimer oluşumunun oranlarını karşılaştırarak, bir J faktör olarak bilinen diğer ucu, yakın DNA'nın bir ucunun etkin bir molar konsantrasyon elde edebilir. Bu, J faktör diğer ucunda, kısa bir mesafede, DNA'nın bir ucu bulma olasılığı yoğunluğuna boyutlu eşdeğerdir ve bu şekilde DNA'nın bir esneklik göstermektedir. DNA uzunluğunun bir fonksiyonu olarak J faktörünün ölçülmesi kalıcı uzunluğu 4,5 'da dahil olmak üzere bir DNA ile ilgili birçok mekanik özelliklerini ortaya koymaktadır.
Solucan benzeri zincir (WLC) modeli yaygın bir açıklamaya onun başarısına dayanan dsDNA mekaniği için kanonik polimer modeli olarak kabul edilmiştirDNA deneyleri 6 çekerek, doğru ve uzun 200 bp 7 daha dsDNAs arasında J faktörleri tahmin elde kuvvet-uzatma eğrileri adencilik. Bununla birlikte, 100 bp kadar kısa dsDNA moleküller üzerinde siklizasyon deneyi kullanılarak, Cloutier ve Widom WLC modeli tahmin 8 daha yüksek, birkaç kat olmak J faktörleri ölçülür. Bir yıl sonra, Du ve ark. ligazı düşük konsantrasyonları ile siklizasyon deneyi kullanılarak WLC modeli ile uyum içinde J faktörleri üretilen ve Widom gruptan 9 ligaz kullanılan yüksek konsantrasyonlara anormal sonucu bağlanabilir. Geleneksel tahlil 9 kullanırken bu tartışma siklizasyonudur kinetik DNA ligaz kaçınılmaz etkisini örneğidir. Ayrıca, DNA ligaz, aynı zamanda non-spesifik bağlanma 10,11 aracılığıyla gerçekleştirilen DNA yapısı ve sertlik etkileyebilir.
Protein-bağımlı ilmek testlerin teknik endişelerini ortadan kaldırmak için, son zamanlarda bir prot gösterdiFlüoresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) 12 göre ein içermeyen döngü deneyi. Bu yöntemde, döngüye konformasyonları bir DNA molekülünün yapışkan uçlarının yakınında bağlı verici ve alıcı arasında FRET ile tespit edilir. Objektif tipi toplam iç yansıma flüoresans mikroskobu (TIRFM) geri loop ve uzun bir süre için hareketsiz kılınmış yüzeye tek bir DNA moleküllerinden unlooping etkinlikleri yörüngeleri kaydetmek için kullanılır. Bu yöntem, Vafabakhsh Ha ve 13 ile benzer bir yöntem üzerinde çok önemli bir gelişmedir uyumsuzluk içermeyen DNA molekülleri oluşturmak için DNA moleküllerinin PCR tabanlı bir montaj sağlar. Bu protokol, tek moleküllü bir yönü, FRET yönü bir hatta ligaz aktivitesi bozabilir koşullarda, aynı molekülde tekrar tekrar DNA ilmek dinamikleri ölçmek için sağlar Buna ek olarak dağılımlarının ölçüm ortalamalar topluluğa sağlar.
TIRFM düzeneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Özel bir-Tasarlanmış numune aşama bir Olympus IX61 mikroskop vücuda yerleştirilir. 532 nm ve 640 nm lazerler tarafından tanıtıldı ve lamel-su arayüzünde geliş kritik açıyı elde etmek için yüksek NA objektif içine küçük eliptik ayna 14 tarafından yansıtılır. Daha yaygın bir dikroik ayna veya prizma bazlı TIR kurulumları kullanılarak objektif TIR da FRET, bu uygulama için kullanılabilir unutmayın. Mikroskop ile oluşan floresan görüntü bir dikroik ayna, verici ve alıcı görüntüleri ayrılmıştır. Daha sonra, bir EMCCD iki yarısı üzerine yeniden görüntülü. Ek uzun geçiş filtresi emisyon arka plan sinyali azaltmak için kullanılır.
Sıcaklık kontrolü tekrarlanabilir kinetik verileri elde etmek için gereklidir. Sıcaklık kontrolü için, objektif, sıcaklık kontrollü bir soğutucu / ısıtıcı ısı transferi, ve su en aza indirmek için mikroskop vücudun burun parçası ayrılır sıkıca oturan bir pirinç bileziği yoluyla sirküle ediliramaç kılıfın altında iç metal etrafında. Bu kurulum 15 ve 50 ° C arasında lamel yüzey (Şekil 2) sağlam sıcaklık kontrolünü sağlamak mümkün. Bu çalışmada, örnek sıcaklığı 24 ° C'de muhafaza edilmiştir
Aşağıdaki protokol DNA yapımında, DNA şekil tahmini, tek molekül deney ve J faktör belirlenmesi için adım adım işlemi sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DsDNA Numune Hazırlama
- 10-mer dizisini tekrarlayarak küresel kavisli DNA'lar tasarlayın. Örneğin, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 ', bir 186-bp X kavisli rastgele bir ilave baz DNA ve tekrar 10-mer dizisini kuşatan sekans adaptör dizileri olmasıdır.
Not:. Bu örnekte Kaplan ve arkadaşları tarafından, büyük ölçekli nükleozom doluluk çalışmaya dayanarak nükleozom oluşumuna karşı tercihler iki 10-mer 15 seçilmiştir. DsDNA sarmal tekrar 10 bp yakın olduğu için, 10-mer sarmal eksen herhangi bir net saptırma dairesel bir yay (Şekil 3A) gibi bir şekil üretilmesi için birikecektir. Sarmal süresi 10.5 bp yakın olduğundan, ekstra bir baz olabildiğince düzlemsel olarak kavisli yapısını korumak için her iki tekrarlar sonra eklenir. 200 bp daha kısa Bu diziler Companie sipariş edilebilirs sunan gen sentezi hizmet. Bu daha sonraki aşamalar için ortak bir adaptör dizisiyle birlikte, bu sekansları yan yüzey için uygundur. Bu prosedür Şekil 3B'de şematize edilmiştir. - Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) ve Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG) ile PCR yapın. Not: Primer 2 5 'ucunda FRET verici Cy3 ile etiketlenir. Tipik bir PCR protokol tarifi ve bisiklet Tablolar 1 ve 2'de sunulmuştur.
- Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) ve Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG) ile PCR gerçekleştirin. NOT: Primer 3 5 'ucunda omurga ve biyotin bağlayıcı aracılığıyla FRET alıcı Cy5 ile etiketlenir. PCR tarifi ve bisiklet protokol yukarıdaki gibidir.
- Bir PCR temizleme kiti kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır.
- 0.4 ve nihai konsantrasyonlarda iplik değişimi için bir tampon (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA) içinde Cy3-etiketli ürün ve Cy5 etiketli ürünün karıştırın# 181; sırasıyla M ve 0.1 mcM. Not: aşırı Cy3-DNA şerit değişimi sonucu Cy3 ve Cy5 hem taşıyan çift yönlü konsantrasyonunu arttırır.
- 2 dakika için 98.5 ° C 'de enkübe edilerek Değişim şeritler, yavaş yavaş 5 soğutulduktan ° C 0.1 ° C / sn bir artış hızı ile ve 5 de inkübe 2 saat boyunca ° C.
2.. Jel Elektroforez dsDNA Eğrilik Algılama
- 29.2:0.8 oranında akrilamid ve bis-akrilamid solüsyon karıştırılarak bir poliakrilamid jeli 16,17 dökün,% 5 (ağ / hac) pH 8.0 'de 1X Tris / borat / EDTA (TBE) tamponu. Not: jel solüsyonu 10 mi içerir: 1.217 ml% 40 akrilamit, 0.667 ml% 2 bis-akrilamid, 1 mi TBE 10X, 100 L amonyum persülfat (APS) 10,% 10, L TEMED, ve geri kalan dH 2 O olduğu Jelin tam katılaşması yaklaşık 30 dakika sürer.
- DNA örnekleri ve 1X yükleme tamponu içinde DNA merdiveni (% 5 gliserol,% 0.03 (ağırlık / hacim) bromofenol bl ile poliakrilamid jel yükue) ve 5-8 de jel de 45 dakika boyunca 4 ° C'de veya boya ön kadar V / cm jel sonuna yaklaşır.
- 30 dakika için 0.5 g / ml etidyum bromid içeren 1X TBE tamponu kullanılarak jel leke. UV ışık altında DNA bantları belirlenmesi. DNA moleküllerinin belirgin boyutlarını hesaplamak için boyut markeri (100 bp DNA merdiven) ile bant pozisyonları karşılaştır. NOT: Kavisli DNA'lar genellikle düz DNA'ların daha yavaş hareket eder.
3.. Hücre Hazırlama Akış
- Bir matkap basın ve elmas matkap kullanarak bir cam slayt iki zıt kenarları (3'' x 1'') boyunca delik 6-7 çiftleri delin. Delindikten sonra, görünür cam tozunu su akan slayt ovmak. NOT: delik perfüzyon giriş ve çıkışları olarak hizmet vermektedir. Sondaj esnasında su ile slayt soğutma çatlamasını önlemek için önemlidir.
- Cam bir kavanoza dik slaytlar yerleştirin ve su ile doldurun. 15 dakika boyunca sonikasyon ve başka bir cam kavanoz de içine aktarabilirsinizaseton temizlik için endikedir. 15 dakika boyunca aseton ve sonikasyon ile doldurun. Daha sonra bir sprey şişesi ve su kullanılarak, etanol ile slaytlar durulayın. Polipropilen kavanoza koyun, 5 M potasyum hidroksit ile doldurun ve sonicate 15 dakika için. Son olarak, 15 dakika boyunca su içinde slaytlar sonikasyon. Aynı protokolü kullanarak lamelleri (No. 1, 24 x 40 mm) temizleyin. NOT: Temizlenmiş slaytlar ve lamelleri uzun süreli kullanım için dH 2 O saklanabilir.
- 0.1 M sodyum bikarbonat çözeltisi 340 L mPEG-silan 80 mg (MW 2000) ile biotin-PEG-silan, 1 mg (MW 3400) karıştırın. İyice karıştırın ve baloncuklar kurtulmak için kısaca karışımı santrifüj. NOT: Polietilen glikol (PEG) ile yüzeyin işlevselleştirme yüzeyine spesifik olmayan DNA bağlanma azaltmaya yardımcı olur.
- Her slaytta PEG çözeltisi 80 L koyun ve hafifçe üzerine bir lamel düşük. 45 dakika boyunca bekleyin. , Cımbız ile slayt lamel ayırın dH 2 O bol miktarda durulayın ve izin taçık havada hem kuru.
- Kanallar oluşturmak üzere slaytta çift-çubuk ince şerit bant yerleştirin. Bunun üzerine bir lamel hizalayın ve sıkıca sıvı geçirmez kanallar oluşturmak üzere slayt karşı lamel basın. Kanalların kenarları mühür 5 dakika epoksi kullanın.
Trolox Çözüm 4. Hazırlanması
- Bir şişe içinde ~ 30 mg troloks ve 10 ml dH 2 O koyun ve 18 saat süre ile açık havada solüsyonu karıştırmak için bir mıknatıs karıştırma çubuğu kullanmaktadır.
- Bir 0.2 mikron filtre kullanılarak filtre edilir ve çözelti 1 M Tris bazı (pH 11)-6 ul ekleyerek pH 7'ye ayarlanır. Not: Trolox genel olarak 18 çalışmalar, tek bir molekül olarak kullanılan bir anti-yanıp sönen reaktiftir. Trolox ® solmaya hareket kısmen bozulmuş Trolox ® çözeltisi 19 içinde mevcut olan kendi oksitlenmiş türevi gelmektedir. Metanol ya da yüksek hızlı bir şekilde pH Tris Trolox ® çözeltisi içinde çözündürülmesi için yetersiz oksidasyon kaçınılmalıdır.
5. Tek molecule Görüntüleme
- Kanala NeutrAvidin çözeltisi (0.5 mg / ml) 15 ul enjekte edilir ve T50 tampon 100 ul (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.0) ile yıkamadan önce 2 dakika boyunca bekleyin.
- Kanalın içine DNA örneği (50-100 pM), 50 ul enjekte edilir. 5 dakika bekleyin ve T50 tampon 100 L uzakta ilişkisiz DNA durulayın. Not: DNA molekülleri, özellikle NeutrAvidin-biyotin etkileşimi yoluyla yüzeye bağlanacaktır.
- Bir oksijen tutucu sistem 20 (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox ve 500 mM NaCl) içeren bir görüntüleme tamponu ile kanal doldurun.
- Saniyede 25 kare bilgisayara 2 x 2 binned görüntüleri (256 x 256) akışı çerçeve transfer modunda EMCCD ayarlayın.
- Mikroskop objektif üzerinde daldırma yağ koymak, ve numune klipsler kullanılarak mikroskop sahnede akış hücresi düzeltmek. Duvara lazer yansıma şekline bakarak odağı kaba ayarlayın. Floresan im canlı görünümünü kullanarak odağı İnce ayarımonitörde yaş.
- Üzerinde 532 nm lazer ile veri toplama başlar. Canlı görünümünü kontrol edin ve gerekirse odağı ayarlayın. En molekülleri photobleached olduğunda veri toplama durdurun.
NOT: Bu tesiste, mikroskop kontrol ve sabit diske kaydedilmiş olarak monitörde canlı görüntüleri görüntülemek için bir laboratuvar-C yazılı programı kullanılmıştır.
6.. Görüntü İşleme ve Veri Analizi
NOT: 256 x 256 görüntülerin bir zaman serisi Cy3 ve Cy5 şiddetlerinde tek-molekül zaman izlerini oluşturmak için bir MATLAB kodu tarafından işlenir. Donör kanal ve bölünmüş görünüm görüntü alıcı kanal arasındaki pikselleri eşleştirmek için, Cy3 ve Cy5 noktalar 6-7 çifti, eşit görüş alanına yayılmış aynı molekülün her çifti, elle bir afin dönüşüm aldı, ve vardır çapa noktaları olarak bu noktalar koordinatları kullanılarak hesaplanır.
- MATLAB komut dosyası kullanarak, tüm tek-molekül süre bakmak t izleridüşük ve yüksek FRET sinyalleri arasında şapka gösterisi çoklu geçişler. Döngüye ve unlooped durumlarını belirlemek.
Not: FRET sinyali Cy5 yoğunluğu olarak tanımlanan (I a) Cy3 ve Cy5 yoğunluklarının toplamı (I I a + d) bölünür. Unlooped hali düşük FRET değere sahip iken döngüye devlet yüksek FRET değeri vardır. Tek bir molekülden FRET sinyallerinin histogram bimodally için geri loop ve unlooping arasında dağıtılır. - İki monte Gauss eğrileri arasındaki kesişim belirleyerek iki dağılımları ayıran eşik bulun.
- FRET verimliliği gibi hesaplayın
ve yüksek FRET değerleri ve düşük FRET değerleri ile unlooped devletlerle döngüye durumları atayın. - MATLAB komut dosyası kullanarak, moleküllerin (N (t)) kümülatif sayısını analiz o döngüye (veyaveri toplama başından bu yana farklı zaman geçerse de yüksek FRET devlet) ulaştı. NOT: dsDNA molekül veri toplama başında unlooped devletin herhangi bir yapısındaki başlayabilirsiniz yana, ilmekli nüfus artış oranı ortalama döngü oranı ilk konformasyonlar üzerinden ortalama yansıtır. Üstel fonksiyonu ile N (t) takarak döngü oranı k döngü Özü:
Biphasically artarsa, o bir çift üstel fonksiyonu ile donatılmış olabilir: 
Bu durumda, k döngü elde edilir: 
Not: Teorik olarak, bir polimer t zamanında döngüye olmadığını hayatta kalma olasılığı, tek veya çift üstel fonksiyon 12 değildir. Üstel fitting ortalama döngü süresini elde etmek için pratik bir araç olarak kullanılır.
ve yüksek FRET değerleri ve düşük FRET değerleri ile unlooped devletlerle döngüye durumları atayın. 
Biphasically artarsa, o bir çift üstel fonksiyonu ile donatılmış olabilir: 
Bu durumda, k döngü elde edilir: 
Not: Teorik olarak, bir polimer t zamanında döngüye olmadığını hayatta kalma olasılığı, tek veya çift üstel fonksiyon 12 değildir. Üstel fitting ortalama döngü süresini elde etmek için pratik bir araç olarak kullanılır. 7. J Factor Belirlenmesi
Not: J faktörü dsDNA bir ucu diğer ucunda yaklaşık kadar konsantre edildi temsil eder. Bu döngü oranı olarak ölçülen diğer ucu bölümü ile aynı reaksiyon oranını üretecektir DNA'nın bir ucu diliminin konsantrasyonunu interpolasyonuyla belirlenebilir. Deneysel olarak, bir uç kademeli bir yüzeyi üzerinde immobilize edilir ve diğer uç kademeli bir belirli konsantrasyon ° C'de ilave edilir. Iki ucu arasındaki ölçülen bağlanma oranı k tavlama ise, J faktörü 21 ile verilir 
. Tavlama oranı sabiti (k tavlama = k tavlama / C), prob konsantrasyonu bağımsızdır.
- 30-50 pM biotin-Cy5 oligo 20 ul (Primer 3) akış iBir NeutrAvidin kaplı kanal nto. Ilişkisiz oligolarını yıkayacak 100 ul T50 ile kanal durulayın.
- 50 nM'lik bir nihai konsantrasyonda Cy3 oligo (Primer 2) ilavesi ile kısmen 5'te tarif edildiği gibi görüntüleme tamponu hazırlayın. Kanala bu görüntüleme tampon akış.
- Üzerinde 532 nm lazer tutarken, kısaca yüzey bağlı Cy5 Oligoların konumlarını belirlemek için 640 nm lazer açın. 640 nm lazer kapatın ve FRET sinyal izleme başlar.
NOT: Bir yüzeye bağlı Cy5 oligo için bir Cy3 oligo hibridizasyon üzerine, Cy5 floresans FRET dan ortaya çıkacaktır. - MATLAB komut dosyası kullanılarak, ilişkisiz devlet (düşük yoğunluklu Cy5) başlar ama daha sonra Cy5 yoğunluk izlerinden zamanın bir fonksiyonu olarak tavlı devlet (yüksek Cy5 yoğunluğu) dönüşmesi moleküllerinin sayısını analiz.
- Tavlı moleküllerin karşı zaman bu sayı çiziniz. Tek bir üstel fonksiyonu ile (bu eğrinin
(k anneal) elde edilmiştir. - Tavlama oranı ve reaktan konsantrasyonu arasında lineer teyit etmek için farklı oligo Cy3 konsantrasyonda (60, 100 ve 180 nM) bu deney tekrarlayın. Ikinci dereceden tavlama oranı sabiti (k tavlama Özü ) Yamaç.
- J faktör hesaplayın
, K döngü aynı tampon durumda ölçülen döngü hızıdır.
(k anneal) elde edilmiştir. 
, K döngü aynı tampon durumda ölçülen döngü hızıdır. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ilmekleme çalışma için kullanılan DNA molekülleri değişken sırasının uzunluğu ve her bir diğerine tamamlayıcı olan tek şeritli çıkıntılarının bir çift yönlü bölge oluşur. 7-baz uzunluğunda olan çıkıntılar, ilmekli durumunu yakalamak için birbirine bağlandığı olabilir. Her bir çıkıntı sitidin kimya yoluyla DNA omurgada bağlantılıdır Cy3 veya Cy5 ya da içerir. Cy5-çıkıntı da hareketsizleştirme yüzeyi (Şekil 4A) için biotin-TEG (15-atom Tetra-Etilen Glikol aralayıcı) ile bağlantılıdır. Tüm bu modifikasyonlar, PCR tabanlı bir protokol (Protokol 1 ve Şekil 3B) sonra dsDNA katılabilecektir. Çıkıntılarının seçilen uzunluk ve sekans, normal deneysel koşullarda tespit ve geri dönüşümlü FRET olayları üretmek için iyi çalışır. Döngü ve DNA döngünün kinetik unlooping çevreleyen sıcaklığa duyarlıdır ve bu nedenle, bir sıcaklık kontrol cihazı yeniden üretilebilirlik için gereklidir. Böyle bir controller kolayca mikroskop (Şekil 2) içine dahil edilebilir.
TIRFM kullanarak, Cy3 (verici) ve Cy5 yüzey hareketsiz dsDNA moleküllerinden (akseptör) sinyalleri gözlendi (Şekil 4B) dalgalanmaları anti-korelasyon gösterdi. Ilmekli halde, iki boyalar arasındaki mesafe nedeniyle, yüksek verimlilik, FRET (Şekil 4A ve 4C) yüksek Cy5 sinyali ve düşük Cy3 sinyali olmasına neden olur ki, 5 nm daha küçüktür. Çeşitli kontrol deneyleri yüksek FRET devlet ilmekli devleti temsil ettiğini kanıtlamak için yapılmıştır. Yüksek FRET devletin ömrü, yüksek FRET devletin iki çıkıntılar arasındaki baz eşleşmesi tarafından stabilize olduğunu göstermektedir ki, artan çıkıntı uzunluğu artmıştır. Yüksek FRET devletin ömrü de döngü olarak döngü serbest enerjisi artar 12 küçük olur çünkü beklenen DNA uzunluğu, azalmasıyla. Bu kanıtlar, yüksek ve düşük FRET sta dayanaraktes sırasıyla döngüye ve unlooped devletler atanabilir.
Döngü üzerinde dsDNA iç kavis etkisini test etmek için, farklı bir eğriliğe sahip iki 186 bp dsDNAs 'düz' (S-DNA) olarak adlandırılır, hangi inşa ve bunların kavis göre 'eğri' (Cı-DNA). Tekrar 10-mer sekans S-DNA için C-DNA ve TGACAGCAAC için TTTATCATCC olduğunu. Bu dsDNAs her birinin genel eğriliği PAGE dsDNA eğrilik 16,22 tahmin etmek için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir (poliakrilamid jel elektroforezi) ile kontrol edilmiştir. Şekil 5 S-DNA aynı boyutta DNA benzer şekilde çalışır olduğunu göstermektedir DNA merdiveni (Şerit 1 ve Şekil 5'te şerit 2 karşılaştırın). Öte yandan, C-DNA, DNA merdiveni muadili ile karşılaştırıldığında daha geniş bir boyutlarını göstermektedir (~ gerçek boyutundan daha büyük 1.2, şerit 1 ve şerit 3). Bu gözlem, C-DNA daha büyük bir iç cu sahip olduğunu göstermektedirS-DNA daha rvature.
Şekil 6, C-DNA (Şekil 6A) ve karşılık gelen izleme FRET (Şekil 6B) için temsili bir floresan zaman izini gösterir. S-DNA (Şekil 4B ve 4C) ile karşılaştırıldığında, C-DNA zaman aynı dönemde daha yüksek FRET olaylar üretir; C-DNA, aynı zamanda satın alma esnasında S-DNA (Şekil 7) daha sık 4-kez döner. Bu sonuç, DNA içsel eğriliği anlamlı dinamiklerini döngü etkileyebildiğini göstermektedir.
Döngü oranından J faktörü çıkarmak için, bir ya da iki kesilmiş çıkıntılar arasındaki hibridizasyon için konsantrasyon bağımsız ikinci dizi oranı sabiti ölçülmesi gerekmektedir. Bu tür bir ölçü gerçekleşme Şekil 8A'da gösterilmiştir. Hareketsizleştirilmiş Cy5 oligo için Cy3 oligo hibridizasyonu FRET nedeniyle Cy5 yoğunluk patlamaları üretir. Birden mea GönderenFarklı Cy3-oligo konsantrasyonlarda surements (Şekil 8B bakınız), biri istatistiksel olarak sağlam bir şekilde elde edebilirsiniz. Deneyde, 500 mM NaCl, iki oligo arasındaki bağlanma oranı sabiti 0.45 ± 0.04 x 10 6 M-1 saniye-1 olarak belirlenmiştir. J faktörü ikinci dereceden tavlama oranı sabiti (k 'tavlama) ile döngü oranı (k döngü) bölünmesi ile elde edilmiştir. Bu, C-DNA için S-DNA ve 265 ± 48 nM için 61 ± 3 nM idi. S-DNA (Şekil 9) J faktörü benzer uzunlukta 7 de önceki ölçümler ile adil anlaşma olduğunu.
Şekil 1. Objective-tipi TIRFM. A) Uyarma optik. 532 nm ve 640 nm lazerler benzer fiyatları ayrı ayrı collimated edilirar çapı, bir dikroik ayna ile aynı yolu birleştirilecek ve objektif arka diyafram altına yerleştirilen küçük bir eliptik ayna üzerine odaklanmıştır. Bu renk sapmaları. B) Mikroskop optik en aza indirmek için, odaklama için bir akromatik lens kullanmak önemlidir. Minyatür aynanın yanal konumu minimal floresan emisyonu bloke ederken bu amaç ile lazer ışınını yansıtmak, böylece ince ayarlanmalıdır. Bu nedenle, küçük bir çeviri aşamasında monte edilmelidir. Karşı tarafında bir başka ayna optik algılama girmesini önlemek için giden lazer yansıtır. Mikroskop vücut dışında görüntü düzleminde, ayarlanabilir bir yarık CCD algılama alanının yarısı boyutuna görüntüyü kırpmak için yerleştirilir. Floresans emisyon iki kanal içine bir dikroik ayna tarafından bölünmüş, ve röle lensler 01:01 büyütme ile CCD üzerinde ikinci bir görüntü oluşturmak edilir. Yansıtan aynalar biri biraz donör dengelemek için döndürülürve alıcı görüntüler. Bir bant geçiren ve bir longpass filtreleri sırasıyla verici ve alıcı kanallarda arka plan azaltmak için kullanılır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Tek-molekül deneyler için Şekil 2. Sıcaklık kontrolü. Set sıcaklığı (T ler) su soğutucu / ısıtıcı üzerinde okuma. Gerçek sıcaklık (T a) mikroskop lamel üst yüzeyine temas eden bir termokup ile ölçülmüştür. Gerçek sıcaklıklara karşı altı farklı set sıcaklıkları (siyah kareler) arsa mükemmel doğrusallık (yeşil kesikli çizgi) gösterir. Kontrolörün sağlamlığı sonraki zamanlarda (kırmızı elmas) yapılan rastgele ölçümler gösterilir. Inset sıcaklık co resimnihai montaj birimi ve objektif ntrolling. Kırmızı çizgi birlik bir eğim gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3.. DNA Tasarım. A) dsDNA'yı Eğri. Bir 10-mer dsDNA kavisli boru kesimi, ve kesikli çizgiler olarak iki tek şerit olarak temsil edilir. Herhangi bir 10-mer DNA sarmal eksen mükemmel düz değildir ve bu nedenle bu tür bir 10-mer, her birleştirme ile aynı yönde sarmal ekseninin artan eğim yol açacaktır. Bu etki bir düzlemsel, süpersarmal molekül. B) dsDNA'nın PCR tabanlı hazırlık oluşturmak için kullanılabilir. Tek-kollu DNA'lar, yatay bir çizgi olarak gösterilmiştir. Bunların gerçek eğrilik burada tasvir edilmemiştir. Siyahlı merkezi kesimi temsil DNA fragmanının eşsiz bir parçasıdır. Bu çalışmada kullanılan tüm DNA'lar için ortak adaptör dizileri açık gri renkte gösterilmiştir. Ön ve arka adaptörlere Primer 1 ve 4 tavlama sırasıyla. Primer 2 5'-ucunda Cy3 ile etiketlenir. Primer 3, 5'-ucunda bir biyotin etiketi ve içsel olarak bağlanmış Cy5 sahiptir. Primer 2 ve 3'ün açık mavi bölgeler olarak işlev yapışkan uçlarını tamamlayıcı olan dizileri içerir. Ilgilenilen dizisini içeren bir plasmid ya da genomik DNA ya iki ayrı PCR reaksiyonlarında şablon olarak kullanılır. Cy3-etiketli dsDNA astar 1 ve 2 kullanılarak üretilir ve biyotinile Cy5-etiketli DNA astar 3 ve 4 kullanılarak üretilir. Bu iki PCR ürünleri ısıtılır ve iplik değişimi için bir araya getirilmiştir. Dört farklı dsDNAs Cy3, Cy5 ve biotin içeren yalnızca bir tanesi, oluşur. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Deneysel şeması. A) Tek molekül FRET deney. diğer bir yan ve Cy5 (kırmızı) Cy3 (yeşil) ile etiketlenmiş dsDNA molekülleri, PEG (polietilen glikol) ile kaplanmış yüzey üzerinde immobilize edilir. DsDNAs Tersinir loop ve unlooping yüksek FRET (döngülü) ve düşük FRET (unlooped) devletler, sırasıyla. B) donör (yeşil Tipik bir tek-molekül zaman iz) ve alıcı (kırmızı) floresan yoğunlukları sonuçlanabilir. Yüksek ve düşük FRET devletler sırasıyla döngüye ve unlooped devlet olarak tanımlanır. Ayrıca, döngü oranını hesaplamak için kullanılan ilk döngü zamanı göstermiştir. (Ankastre) zoom-in şekil. C) donör ve alıcı yoğunluğu hesaplanır FRET verimliliği bir zaman iz B izleri Cy3 ve Cy5 yoğunlukları, anti-korelasyon göstermektedir. Şekil 4B ve
Şekil 5,. Poliakrilamid jel elektroforezi (29.2:0.8 akrilamid / bis-akrilamid, TBE tampon maddesi, pH 8.0 içinde% 5), sentetik DNAların. Soldan sağa, kulvarlar 1 kb işaretleyici, 186 bp DNA düz ve 186 bp içerir Eğri DNA. Bu rakam kısmen izni ile bir önceki yayın 12 uyarlanmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 6,. Eğimli DNA (Cı-DNA) (A) ve karşılık gelen izleme FRET (B) Örnek izler. Yoğunluğu karşılaştırılması ve S-DNA (Şekiller 4B ve 4C) ve C-DNA (Şekil 6A izleri arasında FRET ve 6B) açık bir şekilde kavisli DNA daha sık aynı tampon durumda düz DNA'dan daha döngüler olduğunu göstermektedir. (Ankastre) zoom-in şekil Cy3 ve Cy5 yoğunlukları, anti-korelasyon göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 7,. Düz ve kavisli DNA'ların ortalama ilk döngü kez. Her time 5 farklı alanlarda ~ 500 moleküllerinden ekstre edilmiştir. Hata çubukları 3 bağımsız deneyler hesaplanan ortalama (SEM), standart hata temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 8,. Oligo melezleştirme arasındaki bağlanma oranı sabiti belirlenmesi. Tavlama hızı ölçümü A) şematik görünümü. Cy5 astar yüzeyi üzerinde hareketsiz, ve Cy3 primer 50-180 nM'de mevcut olmasıdır. 50 nM'de bağlama ve Cy3 primerin unbinding tersine çevrilebilir ortaya çıkar ve tavlama oranı, serbest oligo konsantrasyonuna doğrusal olarak bağlıdır ek. B) 'de gösterilen tespit alıcı patlamaları, yol açar. Çizginin eğimi, ikinci dereceden tavlama oranı sabiti (k 'annea temsil eder l). resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 9 nM hesaplanan düz ve kavisli DNA'ların J faktörler J faktör iki measurables göre belirlendi:... DsDNA döngü ve ücretsiz tamamlayıcı çıkıntılarının tavlama sabit oranının döngü oranı büyük resmi görebilmek için tıklayın .
| Bileşen | Volume/50 ul reaksiyon | Nihai konsantrasyon |
| 36 ul | ||
| 5x Phusion tampon | 10 ul | 1x |
| 10 mM dNTP | 1 ul | 200 uM her bir |
| İleri primer (25 uM) | 1 ul | 0.5 uM |
| Ters primer (25 uM) | 1 ul | 0.5 uM |
| Phusion sıcak başlangıç DNA polimeraz (2 U / ul) | 0.5 ul | 0.02 U / ul |
| Şablon DNA | 0.5 ul | ~ 1 ng |
Tablo 1. PCR reaksiyon karışımı. Protokol Phusion DNA polimerazı için optimize edilmiştir. Öğeler, bu sırayla ilave edilmelidir.
| Döngü adım | Sıcaklık | Zaman | Döngü Sayısı |
| İlk denatürasyon | "> 95 ° C30 sn | 1 | |
| Denatürasyonu | 95 ° C | 5 sn | 30 |
| Tavlama | 60 ° C | 10 sn | |
| Uzatma | 72 ° C | 15 sn / kb | |
| Final uzantı | 72 ° C | 5 dakika | 1 |
| 4 & #176; C | tutmak |
Tablo 2. PCR çevrim talimatlar. Tavlama sıcaklığı primerlerin erime sıcaklıklarına göre belirlenir. Uzatma süresi Phusion DNA polimerazı için optimize edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET göre basit bir tek-molekül deney farklı şekillerde iç DNA'ların ilmek kinetiğini incelemek için kullanılmıştır. Eğimli DNA'lar 10.5 bp'lik sarmal süresi ile aynı fazda bir 10-mer dizisini tekrar ile hazırlanabilir, ve eğrilikleri PAGE kullanılarak tahmin edilebilir. Bu dsDNAs geçici döngü stabilizasyonu sağlamak için yapışkan uçları ile tasarlanmıştır. Zamanla döngüye moleküllerin sayısındaki artıştan üstel döngü hızı ekstre edilmiştir. Kesilmiş yapışkan uç kesimleri arasındaki bağlanma oranı sabiti, J faktörü olarak bilinen döngü olasılık yoğunluk, konsantrasyonu eşdeğer belirlemek için kullanılır.
Bir ligaz tabanlı DNA siklizasyon tahlilde, DNA kapatma olasılık ölçüm ligaz konsantrasyona kadar hassastır ve ligaz 9 fazla ise J faktörü fazla tahmin edilebilir. DNA DNA ligazı Spesifik olmayan bağlanma, aynı zamanda ilmek 10 etkileyebilir. Ayrıca, ligase aktivitesi tuz bağlıdır ve zaman içinde azalır. Böylece ligaz aktivitesi için optimal koşullar altında DNA döngü çalışma zordur. Bunun aksine, FRET tabanlı bir döngü deneyi, bu kaygıları her arınmış.
Bizim deneysel protokol tartışma değer olan iki önemli açıdan dışında Vafabakhsh Ha ve 13 ile benzerdir. Vafabakhsh Ha ve 13 çeşitli sentetik oligos bağlanması suretiyle dsDNA molekülleri inşa edilmiştir. Oligo sentezi nükleotid başına hata (ekleme, silme ya da ikame) ile 23 (% 0.181 f) göz ardı edilebilir olmasına rağmen, istenmeyen DNA dizilerinin fraksiyonu oligo uzunluğuna sahip doğrusal olarak artar. Dolayısıyla, bu protokol tarafından hazırlanan 100-bp dubleks örnek yüksek döngü oranı 24 neden olabilir ~ kadar% 33 kusurlu dubleksler içerebilir. Buna karşılık, protokol DNA che çok daha yüksek aslına uygunluk sahip dsDNA moleküllerini sentezlenmesi için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanırmosynthesis 25. Üreticinin verilerine göre, kullanılan yüksek kalitede polimeraz PCR amplifikasyonu 30 devir sonra,% 99.8 bir olasılık da doğru bir 100-bp DNA molekülünü oluşturmak olacaktır.
Iki çalışma arasındaki bir diğer önemli fark, yüzey immobilizasyon düzenidir. Vafabakhsh Ha ve 13 ile protokolde, bu bir iç taban boyunca bağlandıkları ise Bizim çalışmamızda, DNA molekülleri, bunların uçları boyunca yüzeye bağlıdır. Tek başına sınırlandırıcı etkisine göre, bir dahili olarak sabitlenmiş dsDNA beş kat kadar daha sık serbest dsDNA daha döngü, 26 iç iğneleme yere bağlı olduğunu tahmin edilmiştir. DNA çevre uzunluğunun bir fonksiyonu olarak J faktörünün ölçülmesi, bu nedenle, iç çivileme beklenmedik değişkenlik neden olabilir. Bu, bağlayıcı ile değiştirilmiş baz, daha yüksek bir döngü hızı olmasıyla sonuçlanabilir zayıf bir baz eşleştirme yeteneğine sahip olması da mümkündür. Bununla birlikte, despBu belirgin farklılıkları ite, iki protokol 100 bp (~ 3 nM vs ~ 2 nM) benzer J faktörleri üretir.
Bu FRET tabanlı loop tahlil 27 döngü dsDNA'nın üzerine uyumsuzlukları, sıyrık veya boşlukların etkisi, DNA dsDNA loop üzerinde bağlayıcı proteinlerin etkisi ve dsDNA esneklik sıcaklık bağımlılığı da dahil olmak üzere dsDNA ilmeklemeye ilgili olayların geniş bir yelpazede eğitim için umut vaat ediyor. Bu konular, geleneksel ligaz tabanlı siklizasyondan ile hitap etmek zor olacaktır. FRET tabanlı döngü deneyi, aynı zamanda, polimer modelleri test için standart bir ilişkidir kontur uzunluğu genel J faktörü ölçmek için kullanılabilir. Ancak, burada sunulan protokol 100 bp daha kısa dsDNA döngü okuyan için çok uygun değildir. Bu uzunluk altında, dsDNA döngü son derece yavaş ve dolayısıyla ölçülen hızı, ışıkla ağartma gibi diğer istenmeyen süreçleri etkilenecektir olur. Bir bize göre belirgin ilmek kinetik hızlandırabiliryüksek tuz konsantrasyonu ([Na +]> 500 mM), ancak bu ölçüm fizyolojik önemi ing şüpheli hale gelir. Bu nedenle, 100 bp altındaki uzunluk ölçeklerinde bükme dsDNA araştırılması siklizasyon tabanlı deneyleri için bir yaklaşım dik yararlanacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Biz eleştirel yazının okunması için James Waters, Gable Wadsworth'u ve Bo Broadwater teşekkür ederim. Biz de yararlı yorumlar sağlamak için dört anonim yorumcular teşekkür ederim. Biz Georgia Teknoloji Enstitüsü, Bilimsel Arakesitte Burroughs Wellcome Fonu Kariyer Ödülü ve Yaşam Sistemleri NSF Fizik gelen öğrenci araştırma ağı hibe mali destek kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).
