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Bioengineering

में गहराई और जानकारीपूर्ण metabolomic विश्लेषण के लिए एकाधिक metabolite यौगिक श्रेणी ठीक करने के लिए कई कदम तैयारी तकनीक

Published: July 11, 2014 doi: 10.3791/51670
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Immunology, National Jewish Health, 2Department of Pharmacology, School of Medicine, University of Colorado Denver

Summary

metabolomics प्रयोगों में परिणामों की विश्वसनीयता नमूना तैयार करने की प्रभावशीलता और reproducibility पर निर्भर करता है. बाद में यौगिकों के हजारों को विश्लेषण करने, या ब्याज की बस यौगिक वर्गों के विकल्प के साथ जैविक तरल पदार्थ से मेटाबोलाइट्स की निकासी के लिए सक्षम बनाता है कि एक कठोर और गहन विधि है वर्णित है.

Abstract

Metabolomics जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के क्रम में रहने वाले जीवों से नमूनों की रूपरेखा के लिए सक्षम बनाता है, जो एक उभरता हुआ क्षेत्र है. Metabolomics का एक महत्वपूर्ण पहलू असंगत तकनीक अविश्वसनीय परिणाम उत्पन्न जिससे नमूना तैयार है. इस तकनीक प्रोटीन तेज़ी, तरल तरल निष्कर्षण, और चार अलग वर्गों में मेटाबोलाइट्स fractionating के एक साधन के रूप में ठोस चरण निष्कर्षण शामिल हैं. संवेदनशीलता में एक परिणामस्वरूप वृद्धि के साथ कम बहुतायत अणुओं के बेहतर संवर्धन प्राप्त है, और अंततः अणुओं की अधिक विश्वास पहचान में यह परिणाम है. इस तकनीक प्लाज्मा, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना तरल पदार्थ, और 50 μl जितनी कम मात्रा के साथ मस्तिष्कमेरु तरल पदार्थ के नमूने के लिए लागू किया गया है. नमूने कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, प्रोटीन तेज़ी से उत्पन्न गोली बाद में विश्लेषण के लिए भंडारित किया जा सकता है. उस कदम से सतह पर तैरनेवाला का उपयोग तरल तरल निष्कर्षण undergoesपानी और हाइड्रोफिलिक और hydrophobic यौगिकों अलग करने के लिए मजबूत कार्बनिक विलायक. Fractionated बार, हाइड्रोफिलिक परत बाद में विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती है या की जरूरत नहीं तो त्याग. हाइड्रोफोबिक अंश आगे फैटी एसिड होता है, तटस्थ लिपिड, और phospholipids में इसे अलग करने के लिए तीन ठोस चरण निष्कर्षण चरणों के दौरान विलायकों की एक श्रृंखला के साथ व्यवहार किया जाता है. इस तकनीशियन यौगिकों के वर्ग विश्लेषण के लिए पसंद किया जाता है जो चुनने के लिए लचीलापन देता है. यह भी रासायनिक वर्ग मौजूद है की कुछ ज्ञान के बाद से और अधिक विश्वसनीय metabolite पहचान करने में सहायता.

Introduction

जैविक प्रतिक्रियाओं सेलुलर प्रक्रियाओं के अंत उत्पादों के रूप में मेटाबोलाइट्स उत्पन्न करते हैं. Metabolomics इन प्रक्रियाओं का एक परिणाम के रूप में एक जीव में मौजूद सभी यौगिकों का एक संग्रह है. यह कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान के एक चित्र प्रदान करता है और बाहरी या आंतरिक उत्तेजनाओं 1, 2 के लिए किसी जीव की प्रतिक्रिया को दर्शाता है. इस तरह की उत्तेजनाओं, पर्यावरण विषाक्तता, औषधीय, आहार, हार्मोन, या रोग से संबंधित हो सकता है. कई metabolomic आवेदन किया है और वर्तमान में शोधकर्ताओं ने अध्ययन किया जा रहा है और biomarker खोज 3, पोषण पढ़ाई 4, खाद्य विज्ञान 5, और नशीली दवाओं के परीक्षण के 6 शामिल हैं. चाहे आवेदन की, डेटा, संदूषण, और झूठी सकारात्मक की उपस्थिति में बदलाव कम या बेहतर हटा दिया जाना चाहिए. Biomarker खोज में या एक जैविक च एक नियंत्रण और एक रोग समूह के बीच मतभेदों को निर्धारित करने, या विषयों पर दवाओं के प्रभाव की जांच के मामले मेंLUID कहा जा रहा प्रश्नों के आधार पर चुना जाता है और मेटाबोलाइट्स के प्रकार 7 की जांच की जा रही है. उदाहरण के लिए, नमूने से पहले ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage द्रव (BALF) में मेटाबोलाइट्स खोज और प्रशासन के बाद तो, अस्थमा के फेफड़ों पर एक साँस दवा की तत्काल प्रभाव का अध्ययन अगर तरजीही होगा. मतभेद वास्तविक जैविक विभिन्नता के बजाय अनुचित नमूना तैयार करने की तकनीक की वजह से कर रहे हैं ने कहा कि यह सुनिश्चित करने के लिए, मानकीकृत और लगातार प्रयोगशाला प्रोटोकॉल 8 आवश्यक है. नमूना जानकारी ध्यान से ऐसे कुछ नाम हैं जैविक तरल पदार्थ, पशु तनाव, नमूने समय, विषय उम्र, लिंग, के रूप में चर, सभी माना जाता है और अध्ययन 9 के लिए किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रलेखित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, प्रदूषण या झूठी सकारात्मक की संभावना को कम करने के लिए, यह विलायक कारतूस और साधन कारतूस 10 विश्लेषण किया जा सिफारिश की है.

इस प्रोटोकॉल के लिए, शब्द "METABOlites "की पहचान की वास्तविक यौगिकों का उल्लेख करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. विक्रेता सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक प्रारंभिक चोटी खोज एल्गोरिथ्म जन वर्णक्रमीय चोटियों का पता लगाने के लिए किया जाता है. इन चोटियों बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी (मी / z) अनुपात और प्रतिधारण समय के आधार पर गठबंधन कर रहे हैं. एक दूसरे एल्गोरिथ्म तो एक ही परिसर में कई सुविधाओं के गठबंधन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह सोडियम, पोटेशियम, या सकारात्मक आयनीकरण मोड में अमोनियम adducts, और नकारात्मक आयन मोड में क्लोराइड के रूप में ऐसी विशेषताएं शामिल हैं. सॉफ्टवेयर में अतिरिक्त विकल्प ऐसे dimers और अन्य adducts के रूप में विशेषताओं में शामिल हैं. 181.0707 मी / z (एम + एच) में चोटियों के साथ, एक उदाहरण के रूप में ग्लूकोज का उपयोग करना, 198.0972 मी / z (एम + एनएच 4), और 203.05261 मी / z (एम + ना), एक ही करने के लिए इसी तीन चोटियों वहाँ होगा पहले कलन विधि का उपयोग यौगिक. आणविक सूत्र पर आधारित है जो दूसरे एल्गोरिथ्म, लागू है, लेकिन जब इन तीन adducts एक परिसर में जिसके परिणामस्वरूप एक साथ समूहीकृत हो जाते हैं.

मेटाबोलाइट्स samp भीतर हस्तक्षेप पैदा कर सकता हैवर्तमान यौगिकों की जटिलता की वजह से लेस. एक नमूना कारणों में मेटाबोलाइट्स के हजारों की उपस्थिति विशेष रूप से कम बहुतायत मेटाबोलाइट्स के दमन का संकेत. नमूना सफाई प्रोटीन दखल को दूर करने के लिए, और कई भागों में बाद जुदाई नमूना जिससे शिखर जुदाई में सुधार के संकल्प में वृद्धि, और metabolite coelution को कम करने की जटिलता कम कर देता है. इसलिए, नमूना सफाई और यौगिकों के बेहतर जुदाई के लिए आवश्यक है. यह भी विभिन्न ध्रुवता विलायकों के उपयोग के साथ अकेले कि प्रोटीन तेज़ी, दिखाया गया है, इस मुद्दे को 11, 12 को हल नहीं कर सकते. हालांकि, बाद में एक fractionation कदम के साथ इस तरह के एमटीबीई के रूप में एक मजबूत कार्बनिक विलायक के संयोजन से, metabolite कवरेज में वृद्धि हुई है. यांग एट अल. 12 संयुक्त एमटीबीई सॉल्वेंट एक्सट्रैक्शन का उपयोग कर 3806 मेटाबोलाइट्स के लिए क्रमश: मेथनॉल या अकेले मेथनॉल इथेनॉल तेज़ी के साथ 1,851 या 2,073 से मेटाबोलाइट्स में वृद्धि की सूचना दीठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) कदम के द्वारा पीछा किया. कम metabolite ओवरलैप, सुधार शिखर जुदाई और बढ़ metabolite बहुतायत इस विधि के साथ मनाया गया.

पॉलिमर जैसे गैर मेटाबोलाइट्स, से संदूषण नमूना संग्रह, सॉल्वैंट्स, या साधन शोर से परिणाम कर सकते हैं, और संभावित महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स के संकेत दमन में परिणाम कर सकते हैं. यह सिफारिश की है कि तकनीशियन (एस) और तैयारी लगातार एक ही ब्रांड, प्रकार और नमूना संग्रह शीशियों, पिपेट सुझाव और नमूने के संग्रह और तैयारी के दौरान इस्तेमाल किसी अन्य ट्यूब के आकार का उपयोग करने के लिए नमूना पहले नमूने इकट्ठा करते हैं. इस डेटा विश्लेषक मनाया परिवर्तन असली और अन्य स्रोतों से पृष्ठभूमि मतभेद की वजह से नहीं कर रहे हैं कि पूर्ण विश्वास है की अनुमति देता है. उपचार प्रभावशीलता, रोग और नियंत्रण समूह, या किसी भी अन्य चयापचय विश्लेषण के बीच विविधताओं फिर बढ़ा विश्वास के साथ जांच की जा सकती है.

मेथआयुध डिपो यहाँ चर्चा प्लाज्मा, BALF, या मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसीएमएस) आधारित विश्लेषण के लिए गैर लक्षित metabolomic रूपरेखा के लिए नमूने के लिए लागू किया जा सकता है जो संयुक्त नमूना तैयार करने के तरीकों 13-15 पर केंद्रित है. तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) और अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी दोनों (UPLC) जुदाई तकनीक इस प्रक्रिया के बाद एमएस के लिए युग्मित किया जा सकता है. Metabolomic पढ़ाई प्रदर्शन कर कई शोधकर्ताओं ने एक प्रोटीन तेज़ी तकनीक और / या एक तरल तरल निष्कर्षण तकनीक 16, 17 या तो उपयोग करें. हमारे अध्ययन में, यह कम मेटाबोलाइट्स पता लगाया जा रहा में हुई. यहां 12 में वर्णित विधि metabolome का एक व्यापक रेंज को कवर, मेटाबोलाइट्स की एक बड़ी संख्या का पता लगाने और पहचान सक्षम बनाता है. यह वृद्धि metabolite कक्षाओं की पूर्व जुदाई की वजह से नमूने और कम मैट्रिक्स प्रभाव के उच्च शुद्धता की वजह से है.

एक प्रारंभिक protEin वर्षा कदम नमूना से प्रोटीन निकालने के लिए ठंड मेथनॉल (MeOH) का उपयोग किया जाता है. मिथाइल tert-butyl ईथर (एमटीबीई) और पानी का उपयोग तरल तरल निष्कर्षण (LLE) हाइड्रोफिलिक और hydrophobic यौगिकों अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फैटी एसिड होता है, तटस्थ लिपिड, और phospholipids - तो फिर ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) तीन वर्गों में हाइड्रोफोबिक यौगिकों को अलग करने के हाइड्रोफोबिक परत पर किया जाता है. हाइड्रोफिलिक अंश पानी में 5% acetonitrile में पुनर्गठित किया जाता है, जबकि हाइड्रोफोबिक भिन्न, 100% मेथनॉल में पुनर्गठित कर रहे हैं. ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) कदम अन्यथा उपस्थित होंगे जो coeluting यौगिकों की संख्या को कम करने से परिणाम में विश्वास का एक जोड़ा स्तर एक जुदाई कदम प्रदर्शन नहीं किया गया था प्रदान करता है.

Protocol

1. प्रारंभिक विचार, उपकरण और मानकों की तैयारी

  1. हमेशा (कांच संस्कृति ट्यूब, कांच autosampler शीशियों) भंडारण या (कांच pipettes) लिपिड और कार्बनिक विलायकों स्थानांतरित करने के लिए कांच का उपयोग करें.
  2. हवा के लिए सभी लिपिड नमूने और मानकों के जोखिम को कम. सील polytetrafluoroethylene (PFTE) एयर जोखिम और वाष्पीकरण से बचने के लिए कसकर टोपी. तुरंत अगले विलायक में सूखे लिपिड resuspend या नाइट्रोजन की एक सतत स्ट्रीम में उन्हें रखने के लिए.
  3. नमूना के 100 μl का प्रयोग करें. अधिक (या कम) नमूना उपलब्ध है जहां उदाहरणों में, तदनुसार संस्करणों को समायोजित. हालांकि राष्ट्रीय राजमार्ग 2 विशेष स्तंभ पर लिपिड विभाजन के दौरान, संकेत और मात्रा रहना चाहिए कहा गया है.
  4. अपकेंद्रित्र को चालू करें और नमूना तैयारी के शुरू करने से पहले 0 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है.
  5. इस तकनीक को कई अस्थिर सॉल्वैंट्स तो नमूना तैयार करने के दौरान छाया हुआ सभी विलायकों रखने का उपयोग करता है.
  6. सिफारिश के अनुसार मानकों की दो प्रकार की तैयारी.
  7. लगातार एकाग्रता में नुकीला में मानकों सभी के शामिल एक नकारात्मक नियंत्रण की तैयारी. यह सभी नमूनों के साथ ही एक बैच क्यूसी (अलग दिनों पर नमूना तैयार reproducibility के इस्तेमाल पर नजर रखने नुकीला जमा नमूना) और साधन के रूप में प्रयोग किया जाता है जो एक जमा नमूना में नुकीला है क्यूसी (जमा नमूने पहले से तैयार उप aliquoted, और करने के लिए इस्तेमाल नुकीला ) विश्लेषण के दौरान और अलग दिनों पर साधन की स्थिति / उतार चढ़ाव की निगरानी.
    1. 1x, 2x, और 4x मानक spikes पर सकारात्मक नियंत्रण की तैयारी. सकारात्मक नियंत्रण सभी नमूनों के साथ ही एक जमा प्लाज्मा नमूना करने के लिए जोड़ रहे हैं और नमूना तैयार कदम और सुनिश्चित करने के लिए डेटा विश्लेषण के दौरान गुना परिवर्तन अंतर का विश्लेषण और पहचान के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई विश्लेषण कदम दोनों के लिए गुणवत्ता नियंत्रण यौगिकों के रूप में उपयोग किया जाता है के सभी पहलुओं तैयारी और वाद्य विश्लेषण सही ढंग से प्रदर्शन किया गया.
  8. -80 डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस और दुकान के नमूने पर स्टोर मानकों कुछ आंतरिक स्टैंडलंबी अवधि के भंडारण के बाद गिरावट होने का खतरा है, जो Ards -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए
  9. यह प्रक्रिया इस तरह एमटीबीई के रूप में, खतरनाक ज्वलनशील या अस्थिर सॉल्वैंट्स का उपयोग आवश्यक है. एक धूआं हुड में सभी चरणों को पूरा करें.

2. आंतरिक मानकों

  1. व्यक्तिगत परियोजनाओं और उनके विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर आंतरिक मानकों (ISTD) चुनें. ऐसे प्लाज्मा, BALF, या मूत्र, इन नमूनों में जैविक रूप से पाए जाने वाले के स्वभाव में समान हैं जो isotopically लेबल ISTDs रूप biofluids के लिए आदर्श होगा. ये शामिल होगा लेकिन अमीनो एसिड, हार्मोन या लिपिड तक सीमित नहीं हैं. संयंत्र metabolomic नमूने लिए, ऐसे flavonoids, या carotenoids के रूप में चिह्नित मानकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. वही अन्वेषक नमूना प्रकार का विश्लेषण किया जा रहा है की प्रतिनिधि है जो एक आंतरिक मानक का चयन करना चाहिए जिससे अन्य metabolomic पढ़ाई करने के लिए लागू होता है.
  2. चुना ISTD वर्णलेख की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल किया गया है कि सुनिश्चित करना; उदाहरण के लिए अगर टीवह अधिग्रहण के समय हर 5 मिनट elute कि मानकों इस्तेमाल किया जा सकता है, 20 मिनट है.
  3. एमएल नमूना विश्लेषण किया जा रहा है एक्सोजेनस हैं जो isotopically लेबल मानकों और / या अन्य ध्रुवीय यौगिकों की एक किस्म का उपयोग कर 2 मिलीग्राम / पर हाइड्रोफिलिक स्टॉक समाधान बनाएँ. एक 25 माइक्रोग्राम / एमएल क्रिएटिनिन डी 3 के अंतिम एकाग्रता, 100 माइक्रोग्राम / एमएल लाइसिन डी 4, और / एमएल valine डी 8 200 माइक्रोग्राम तक सभी मानकों के साथ पानी: प्रत्येक शेयर समाधान से, 1:1 मेथनॉल में एक समाधान बनाने .
  4. नमूना विश्लेषण किया जा रहा है एक्सोजेनस हैं जो isotopically लेबल मानकों और / या अन्य गैर ध्रुवीय यौगिकों की एक किस्म का उपयोग हाइड्रोफोबिक स्टॉक समाधान बनाएँ; 17:00 फैटी एसिड (4 मिलीग्राम / एमएल) के शेयर सांद्रता, 19:01 फैटी एसिड (4 मिलीग्राम / एमएल), 17:00 ceramide (2 मिलीग्राम / एमएल), 17:00 पीई (1.75 मिलीग्राम / एमएल), 15 : 0 पीसी (2 मिलीग्राम / एमएल), और टेस्टोस्टेरोन डी 2 (1 मिलीग्राम / एमएल). प्रत्येक स्टॉक से, 1:1 क्लोरोफॉर्म में एक समाधान बनाने: 50 साल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सभी मानकों के साथ मेथनॉलमाइक्रोग्राम / एमएल 17:00 Ceramide, 100 माइक्रोग्राम / एमएल 15:00 पीसी, 100 माइक्रोग्राम / एमएल टेस्टोस्टेरोन डी 2, 200 माइक्रोग्राम / एमएल 17:00 फैटी एसिड, 200 माइक्रोग्राम / एमएल 19:01 फैटी एसिड, और 200 माइक्रोग्राम / मानक मिश्रण में मिलीलीटर 17:00 पीई.
  5. पता लगाने और इन यौगिकों के लिए साधन के linearity की सीमा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक स्तर के लिए कम से कम पांच अलग सांद्रता का उपयोग कर समय से आगे प्रत्येक मानक के आयनीकरण की डिग्री का परीक्षण करें. प्रत्येक व्यक्ति के मानक के लिए स्टॉक समाधान की एकाग्रता प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अलग अलग होंगे, और संयुक्त नुकीला मानक में प्रत्येक स्तर की एकाग्रता 2 मिलीग्राम / मिलीलीटर मिलीलीटर 20 माइक्रोग्राम / से वे योण कितनी अच्छी तरह पर निर्भर करता लेकर कर सकते हैं.
  6. सकारात्मक नियंत्रण की एक कील मिश्रण बनाने और मात्रात्मक नमूना तैयार करने और वाद्य डेटा की सटीकता की ताकत पर नजर रखने के लिए 1x, 2x, या 4x एकाग्रता स्तर पर नमूने के लिए उन्हें जोड़ने. सकारात्मक नियंत्रण के अंतिम एकाग्रता कर सकते हैंहो: 2 मिलीग्राम / एमएल डी ग्लूकोज, 100 माइक्रोग्राम / एमएल alanine डी 3, 200 माइक्रोग्राम / एमएल methylmalonic एसिड डी 3, 20 माइक्रोग्राम / एमएल ट्राइग्लिसराइड डी 5, और / या अन्य हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक मानकों. विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एमएस और HPLC उपकरण की संवेदनशीलता के आधार पर मानक सांद्रता समायोजित करें.

3. प्रोटीन वर्षा

  1. नीचे वर्णित के रूप में पिघलना आरटी के लिए नमूने और प्रत्येक नमूने के ISTD के 10 μl स्पाइक.
  2. प्रत्येक नमूने के लिए (कदम 2.3 और 2.4 में स्टॉक से बनाई गई) दोनों हाइड्रोफिलिक और hydrophobic मानक समाधान के 10 μl स्पाइक. विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एमएस और HPLC उपकरण की संवेदनशीलता के आधार पर आवश्यक के रूप में मानक सांद्रता समायोजित
    1. प्रत्येक नमूने के लिए 1x, 2x, या 4x सकारात्मक नियंत्रण समाधान (कदम 2.6 में स्टॉक से बनाया) या तो की 10 μl स्पाइक. एमएस और हिमाचल प्रदेश की संवेदनशीलता के आधार पर आवश्यक के रूप में मानक सांद्रता समायोजितविश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया नियंत्रण रेखा इंस्ट्रूमेंटेशन
    2. पूर्व प्रोटीन तेज़ी कदम के लिए 10 सेकंड के लिए भंवर प्रत्येक नमूने
  3. प्रत्येक नमूने के लिए (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) बर्फ ठंड मेथनॉल के 400 μl जोड़ें.
  4. ट्यूब प्रति 10 सेकंड के लिए भंवर.
  5. 18,000 एक्स जी पर 15 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र.
  6. एक नया कांच संस्कृति ट्यूब के लिए सभी स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, और एन 2 के तहत फिर सूखा.
  7. प्रोटीन गोली अंश का विश्लेषण करते हैं, तो कदम 3.8-3.11 के लिए आगे बढ़ें. प्रोटीन गोली का विश्लेषण नहीं करते हैं, तो धारा 4 को छोड़ें.
    नोट: प्रोटीन गोली दवा पढ़ाई करते समय उपयोगी होगा जो उच्च hydrophobicity साथ यौगिक होते हैं 18 मई, खाद्य ऐसे neuronal ceroid-lipofuscinoses 20 और lysosomal लिपिड भंडारण के रूप में बहुत हाइड्रोफोबिक यौगिकों संचित जहां बीमारियों से संबंधित हाइड्रोफोबिक flavonoids 19 या metabolomic पढ़ाई को शामिल विश्लेषण करती है बीमारियों 21.
  8. टी के लिए एमटीबीई के 1 मिलीलीटर जोड़ेंवह सफेद (या बंद सफेद) प्रोटीन गोली, ट्यूब प्रति 30 सेकंड के लिए भंवर, तो एक्स छ 18,000 पर 15 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. एक नया कांच संस्कृति ट्यूब को एमटीबीई परत छानना.
    यह (प्रतिनिधि परिणाम में चित्रा 5) यहाँ त्रुटियों काफी परिणामों को प्रभावित करेगा के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम है.
    1. गोली के आकार के नमूनों के बीच अलग अलग होंगे क्योंकि लगातार सभी नमूनों के लिए एमटीबीई का एक ही राशि aspirate. केवल 900 μl सतह पर तैरनेवाला की कम से कम राशि के साथ नमूने के लिए decanted किया जा सकता है, तो इसलिए, तो सभी नमूनों के लिए 900 μl छानना.
  9. कदम 3.9 दोहराएँ, और कदम 3.7 में तैयार एक ही गिलास संस्कृति ट्यूब के लिए कार्बनिक परत गठबंधन.
  10. 01:01 क्लोरोफॉर्म की 200 μl में 2 एन प्रवाह और resuspend से सूखी नमूने: मेथनॉल. भंवर संक्षिप्त.
  11. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब पर स्थानांतरण. 18,000 XG पर 15 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, तो कांच का उपयोग पेंच टोपी शीशियों autosampler स्थानांतरण सतह पर तैरनेवालाpipettes.

4. तरल तरल निष्कर्षण

  1. एक गिलास पिपेट का उपयोग,, (धारा 3, चरण 6 से) अवशिष्ट सूखे मेथनॉल, भंवर 30 सेकंड के लिए 3 मिलीग्राम एमटीबीई जोड़ने के भंवर फिर, ट्यूब प्रति 10 सेकंड के पानी के 750 μl जोड़ें.
  2. आरटी पर एक अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए ~ 200 XG स्पिन.
  3. महाप्राण एमटीबीई (जल रही बिना) परत और एक साफ ग्लास संस्कृति ट्यूब को हस्तांतरण 2.5 मिलीलीटर.
    नोट: यह यहाँ मतभेद के परिणाम को प्रभावित करेगा के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम है. यह एक निश्चित मात्रा नीचे जलीय परत pipetting बिना निथर करने की अनुमति देता है क्योंकि एमटीबीई की 2.5 मिलीलीटर ध्यान से ऊपर परत से decanted किया जाना चाहिए. प्रयोग के शुरू में नमूने की मात्रा इस विधि के लिए संकेत दिया 100 μl से भी कम था, तो आनुपातिक रूप से इस प्रारंभिक नमूना मात्रा को प्रतिबिंबित करने के एमटीबीई की मात्रा पैमाने.
  4. नमूने के शेष पानी हिस्से के लिए 3 मिलीग्राम एमटीबीई जोड़ें, और ट्यूब प्रति भंवर 10 सेकंड.
  5. स्पिन ~ 200आरटी पर अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए XG.
  6. महाप्राण (जल रही बिना) एमटीबीई के 3 मिलीग्राम और एमटीबीई ट्यूब के साथ गठबंधन.
  7. एन 2 के तहत सूखने से शेष जलीय परत ध्यान लगाओ.
  8. पानी के 100 μl में छाछ फिर से निलंबित.
  9. संक्षेप में कांच संस्कृति ट्यूब, भंवर को बर्फ के ठंडे MeOH के 400 μl जोड़ें, और तब microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण.
  10. 20-30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें. 18,000 एक्स जी पर 15 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन.
    नोट: यह यह किसी भी शेष प्रोटीन मेथनॉल में बाहर वेग करने की अनुमति होगी के रूप में एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पूरे नमूना रैक जगह की सिफारिश की है. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर उपलब्ध नहीं है, तो अन्य विकल्प हैं:, -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने सूखी बर्फ पर नमूने रखने, या एक बर्फ बाल्टी में रखते हुए उन्हें. यह लगातार वर्षा अनुमति देने के लिए एक ठंडे वातावरण में और एक ही तापमान पर नमूने संग्रहीत करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  11. सतह पर तैरनेवाला और हस्तांतरण के महाप्राण 450 μlएक साफ microcentrifuge ट्यूब. कोई और अधिक ° 45 से सेल्सियस पर एक निर्वात केन्द्रापसारक concentrator में पूरी तरह से सूखा (बारे में 1-2 घंटे लगते हैं).
  12. 5% acetonitrile / पानी के 200 μl में सूखे पर तैरनेवाला Resuspend. भंवर संक्षिप्त. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर

5. ठोस चरण निष्कर्षण

  1. नाइट्रोजन का एक अच्छा प्रवाह (लगभग 10-15 मिनट लगते हैं) के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत एमटीबीई अंश सूखी.
  2. जब पूरी तरह से सूखा, नाइट्रोजन के प्रवाह को रोकने के लिए और जल्दी से एक गिलास पिपेट का उपयोग 1 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म (CHCl 3) में resuspend. भंवर संक्षिप्त.
    नोट: इस तरह के CHCl 3 के रूप में सॉल्वैंट्स चिपचिपाहट कम है. Pipetting के दौरान, कम सतह तनाव पिपेट से विलायक हानि का कारण बनता है. यह पिपेट टिप pipetted जा रहा विलायक और पिपेट में अंतरिक्ष के बीच संतुलन अनुमति देने के लिए कम से कम दो बार prewet जा सिफारिश की है. अगर उपलब्ध हो तो गैस तंग सिरिंज का भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. एक विशेष वैक्यूम कई गुना और एनएच 2 सेट अप
  4. गर्म आरटी के लिए नमूने और हमेशा 2 एन की एक सतत प्रवाह के तहत निलंबित कर रखना. आरटी वार्मिंग लिपिड मेजबान की अनुमति देगा और नाइट्रोजन ऑक्सीकरण और लिपिड के polymerization रोकने जाएगा.
  5. 400 μl हेक्सेन के साथ धोने और हालत एसपीई कारतूस 2x. अपशिष्ट त्यागें और नए गिलास संग्रह ट्यूब के साथ बदलें.
  6. एसपीई स्तंभ के लिए नमूना जोड़ें, ग्लास ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा.
  7. कांच विंदुक 02:01 CHCl 3 में से 1 मिलीलीटर जोड़ने के साथ: आईपीए, (इस तटस्थ अंश है) एक ही ग्लास ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा.
  8. ऑक्सीकरण (लगभग 10-15 मिनट लगते हैं) को कम करने के लिए एन 2 के तहत तटस्थ अंश सूखी.
  9. कांच विंदुक Diethyl ईथर में 5% एसिटिक एसिड के 1 मिलीलीटर जोड़ने के साथ, (यह फैटी एसिड अंश है) नई ग्लास ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा.
  10. ऑक्सीकरण (लगभग 10-15 मिनट लगते हैं) को कम करने के लिए एन 2 के तहत फैटी एसिड अंश सूखी.
  11. 800 जोड़ने के लिए प्लास्टिक युक्तियों का उपयोग करें और# 181; एसपीई कारतूस मेथनॉल के एल, और प्रवाह के माध्यम से 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में (इस फॉस्फोलिपिड अंश है) इकट्ठा.
  12. 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों को फॉस्फोलिपिड अंश स्थानांतरण. 45 डिग्री सेल्सियस (लगभग 1-1.5 घंटे लगते हैं) पर एक निर्वात केन्द्रापसारक concentrator साथ नमूने सूखी.
  13. भंडारण के लिए शीशियों पेंच टोपी autosampler के लिए 100% मेथनॉल, भंवर, और हस्तांतरण के 200 μl में तीन भागों से नमूने के प्रत्येक Resuspend.

6. शर्तों का संग्रहण नमूना

  1. साधन विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों की दुकान.
    नोट: कार्बनिक विलायक में पुनर्गठित निकाले नमूने, -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है ब्याज की संभावित मेटाबोलाइट्स इस तापमान पर नीचा दिखाना होगा हालांकि यह अनुशंसित नहीं है. तरल नाइट्रोजन का भंडारण भी जांचकर्ताओं संदूषण के मुद्दों, विशेष भंडारण शीशियों की जरूरत है की सूचना दी है के रूप में सिफारिश की है, और चैम्बर Cau में एकरूपता की कमी है नहीं हैव्यापक तापमान के उतार चढ़ाव गाते हैं.
  2. नमूना संस्करणों (<100 μl) छोटे हैं, भंडारण के दौरान headspace में विलायक वाष्पीकरण को रोकने के लिए शीशियों में सम्मिलित करता है का उपयोग करें.
  3. नमूनों की फ्रीज पिघलना बचें. सही साधन विश्लेषण से पहले केवल एक बार नमूने पिघलना. दोहराया फ्रीज thaws नमूना गिरावट में परिणाम.

7. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी स्थितियां

  1. हाइड्रोफोबिक अंश का विश्लेषण करने के लिए एक सी -18 2.1 मिमी x 12.5 मिमी (5 माइक्रोन) गार्ड स्तंभ के साथ एक सी -18 2.1 मिमी x 50 मिमी (1.8 माइक्रोन) विश्लेषणात्मक स्तंभ का प्रयोग करें.
  2. 4 के लिए autosampler तापमान सेट   डिग्री सेल्सियस, 60 को स्तंभ तापमान   डिग्री सेल्सियस, 0.25 मिलीग्राम / मिनट के लिए 2 μl और प्रवाह की दर को इंजेक्शन मात्रा.
  3. मोबाइल चरण बी के लिए पानी (60:36:4): acetonitrile: मोबाइल चरण एक के लिए पानी में 0.1% चींटी एसिड, और isopropanol में 0.1% चींटी एसिड का प्रयोग करें
  4. निम्नलिखित ढाल क्षालन प्रोफ़ाइल चलाएँ: शुरूटी 30% बी, और 0 से 1 मिनट से 70% बी को बढ़ाने के लिए, फिर 15 मिनट के लिए 1 से 100% बी को बढ़ाने के लिए और 5 मिनट 10% बी धोने और 5 मिनट डाक रन से पीछा किया 5 मिनट के लिए पकड़.
  5. हाइड्रोफिलिक अंश का विश्लेषण करने के लिए एक गार्ड स्तंभ के साथ एक HILIC 2.1 मिमी x 50 मिमी (2.6 माइक्रोन) विश्लेषणात्मक स्तंभ का प्रयोग करें.
  6. 4 के लिए autosampler तापमान सेट   डिग्री सेल्सियस, 20 को स्तंभ तापमान   डिग्री सेल्सियस, 0.5 मिलीग्राम / मिनट के लिए 2 μl और प्रवाह की दर को इंजेक्शन मात्रा.
  7. 10 मिमी अमोनियम एसीटेट, मोबाइल चरण एक के लिए पीएच 5.8, और मोबाइल चरण बी के लिए 10 मिमी अमोनियम एसीटेट पीएच 5.8 में 90% acetonitrile में 50% acetonitrile का प्रयोग करें
  8. निम्नलिखित ढाल क्षालन प्रोफ़ाइल चलाएँ: 0 से 2 मिनट से 100% बी में शुरू, तो 5 मिनट 0% बी धोने और 10 मिनट डाक रन, जिसके बाद 15 मिनट के लिए 2 से 50% बी करने के लिए कम.

Representative Results

पूरे नमूना तैयार करने की तकनीक ऊपर वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था और सबसे महत्वपूर्ण और / या प्रासंगिक पहलुओं नीचे प्रस्तुत कर रहे हैं. हाइड्रोफिलिक और hydrophobic आंतरिक मानकों विभिन्न निष्कर्षण तरीकों का उपयोग आंतरिक मानकों और अंतर्जात metabolite abundances की प्रत्यक्ष तुलना प्रदर्शन करने के लिए जमा प्लाज्मा नमूनों में नुकीला गया. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस) डेटा गुणात्मक और मात्रात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण और उत्कृष्ट वसूली और अंतर्जात यौगिकों और आंतरिक मानकों दोनों के अलग होने के परिणामस्वरूप किया गया था. चित्रा 1 लिपिड मानकों दोनों निकालने में एमटीबीई-एसपीई विधि का प्रभाव दर्शाता है (ए) और अंतर्जात यौगिकों (बी).

कुल मिलाकर, बेहतर निकासी और मेटाबोलाइट्स की कवरेज मेथनॉल निकासी, या 'एमटीबीई ही' निकासी के रूप में अन्य तरीकों की तुलना में प्राप्त किया गया जब संख्या ओच सुविधाओं नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण निम्नलिखित गुणात्मक और मात्रात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की तुलना में था. उदाहरण के लिए, केवल मेथनॉल निकासी का उपयोग, क्रिएटिनिन डी 3 के लिए परिवर्तन 15.2% थी. हालांकि, एमटीबीई LLE साथ, यह 1.04% सीवी के लिए कम हो गया था. एमटीबीई का प्रयोग, लिपिड और जलीय यौगिकों के reproducibility <लिपिड और जलीय यौगिकों के लिए क्रमश: बड़ा 29% की भिन्नता और 15% के परिणामस्वरूप जो एक सरल मेथनॉल निकासी की तुलना में क्रमशः 8% और <5%, थे. लिपिड वसूलियां की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया आंतरिक मानकों - टेस्टोस्टेरोन डी 2, C17 Ceramide, 15:00 पीसी, और अकेले मेथनॉल उपयोग की तुलना में 26%, 200%, 100%, 400% क्रमशः की वृद्धि हुई 17:00 पीई. इसी प्रकार बढ़ता है फैटी एसिड आंतरिक मानकों और phosphotidylcholine और phosphotidylethanolamine अंतर्जात मेटाबोलाइट्स के लिए पाया गया. ऐसे sphingosines, ceramides, diacylglycerols, triacylglycerols, कोलेस्ट्रॉल, और sphingomyelin के रूप में अन्य अंतर्जात मेटाबोलाइट्स नहीं पाया गया या तोमेथनॉल का उपयोग कर या नगण्य स्तर पर पाया गया. हालांकि इन अंतर्जात लिपिड आसानी एमटीबीई निकासी का उपयोग पाया गया.

मानक प्रोटोकॉल की तुलना हमारे विश्लेषण में, निम्न परिणाम प्राप्त किया गया: मेथनॉल वर्षा अकेले 1,851 मेटाबोलाइट्स में हुई, मेथनॉल इथेनॉल तेज़ी 2,073 मेटाबोलाइट्स दिया, तरल तरल निष्कर्षण के साथ एमटीबीई तरल तरल और बरामद ठोस चरण निष्कर्षण के साथ 3,125, और एमटीबीई दिया 3806 मेटाबोलाइट्स. कारण कम आयन दमन और पूर्व नियंत्रण रेखा एमएस करने के क्लीनर के नमूने के लिए सबसे अधिक संभावना निकाला जा रहा मेटाबोलाइट्स की एक बड़ी संख्या में इसलिए इस दृष्टिकोण का परिणाम है.

चित्रा 2 अधिक विश्वास metabolite पहचान के लिए उनके संबंधित रासायनिक वर्गों में हाइड्रोफोबिक मेटाबोलाइट्स को अलग करने में दक्षता को दर्शाता है. एसपीई निम्नलिखित तीन लिपिड भागों में पहचान यौगिकों की न्यूनतम ओवरलैप है. समर्थन में, 3 से पता चलता हैISTD की उनकी रासायनिक वर्ग से संबंधित अंश में eluted थे प्रदर्शित किया कि आंतरिक मानकों की वसूली.

गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने, नमूना तैयार करने की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए विश्लेषण के कई दिनों एक बड़ा नमूना सेट के लिए आवश्यक हैं जब किसी भी बैच प्रभावों का निर्धारण करने के लिए, और साधन reproducibility की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है. Chromatograms नुकीला में मानकों से भी कम ± 5% से भी कम ± 3 पीपीएम और अवधारण समय खिड़की की बड़े पैमाने पर त्रुटि के साथ बरामद 90% से अधिक कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए जांच कर रहे हैं. इन मानदंडों को पूरा नहीं कर रहे हैं, तो नतीजे खारिज कर रहे हैं और नमूने reanalyzed रहे हैं. प्रतिधारण में एक पारी एक बैच के लिए मनाया जाता है जिससे बैच प्रभाव के एक मामले में, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर इस के लिए सही कर सकते हैं. जमा प्लाज्मा नमूनों की एक पहले से तैयार बैच नमूना तैयार कराना पड़ा. भिन्न तो autosampler शीशियों में उप aliquoted और निगरानी उपकरण condi में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गयाहर नमूना विश्लेषण के दौरान माहौल. तालिका 1 इन स्पाइक में मानकों से परिणाम से पता चलता है. नायब नमूना के लिए स्पाइक में मानकों का% सीवी 10% से अधिक था क्योंकि फैटी एसिड नकारात्मक ionization मोड अंश (डेटा तालिका में दिखाया गया है) के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था. उस अंश के लिए डाटासेट इसलिए खारिज कर दिया और साधन का निरीक्षण किया और बनाए रखा गया था. तालिका 2 नमूना तैयार करने और तीन प्रतियों साधन इंजेक्शन के तीन अलग अलग दिनों के बाद नमूने में अंतर्जात मेटाबोलाइट्स से परिणाम से पता चलता है. नमूना तैयार QC नमूने में अंतर्जात मेटाबोलाइट्स नमूना तैयार करने की शक्ति के साथ ही साधन इंजेक्शन reproducibility वाचक, सब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं.

नमूना तैयार चरणों का ठीक से पालन नहीं कर रहे हैं, हालांकि, अविश्वसनीय और असंगत परिणाम प्राप्त कर रहे हैं. चित्रा 4 परिणाम से पता चलता है जब विधि के प्रोटीन तेज़ी कदमउल्लिखित के रूप में पीछे नहीं है. तीन ऑपरेटरों, ए, बी, और सी जमा प्लाज्मा नमूनों पर ही नमूना तैयार करने की प्रक्रिया का प्रदर्शन किया. ऑपरेटर एक, बल्कि प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के अनुसार सतह पर तैरनेवाला के लिए आवश्यक राशि pipetting से, बजाय गोली से कुछ के साथ दोनों washes के लिए> 1 मिलीलीटर pipetted. यह उस अंश के लिए झूठी सकारात्मक की एक उच्च संख्या में हुई, लेकिन डेटा की परिवर्तनशीलता में वृद्धि हुई ही नहीं.

डेटा की chromatographic reproducibility 7 चित्र में देखा जा सकता है. जमा प्लाज्मा नमूनों इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में प्रोटीन तेज़ी, तरल तरल निष्कर्षण, और ठोस चरण निष्कर्षण का उपयोग अलग दिनों पर तीन प्रतियों में तैयार की गई. प्रत्येक अंश प्रोटोकॉल की धारा 7 में वर्णित chromatographic जुदाई का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था. नमूने तो साधन और नमूना तैयार reproducibility के मूल्यांकन करने के लिए नियंत्रण रेखा एमएस पर तीन प्रतियों में इंजेक्ट किया गया. यह लगातार ओवरलैप streng दोनों दर्शातातीन अलग अलग दिनों पर तैयार जब नमूना तैयार करने, साथ ही प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के उत्पादन में chromatographic विधि की ताकत के reproducibility वें. रासायनिक शोर में वृद्धि फैटी एसिड अंश का नकारात्मक ionization मोड के लिए मनाया जाता है. इस वजह से नियंत्रण रेखा एमएस विलायकों में contaminants के लिए हो सकता है और असंगत मात्रात्मक metabolomic परिणामों में परिणाम कर सकते हैं. इसलिए पहले 9 मिनट के लिए eluted जो केवल मेटाबोलाइट्स विश्लेषण किया गया.

लंबे worklists चलाते समय, साधन संवेदनशीलता और बफर सांद्रता में परिवर्तन का एक नुकसान में कमी आई संकेत तीव्रता और अवधारण समय पाली में जिसके परिणामस्वरूप समय के साथ हो सकता है. अवधारण समय ओवरलैप भिन्नता कम से कम 5% है और संकेत तीव्रता भिन्नता कम से कम 10% है, तो डेटा मानक प्रयोगशाला सीमा के भीतर अभी भी है. विश्लेषण सॉफ्टवेयर साधन और अवधारण समय बहाव के लिए सही करने के लिए डेटा पंक्ति में है और मानक के अनुसार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, विभिन्नता LAR है अगरजीई, तो कारण निर्धारित किया है. इस सुधारा है एक बार, नमूने फिर से विश्लेषण किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. निकासी और उलट चरण क्रोमैटोग्राफी (आरपीसी) 12 निम्नलिखित लिपिड ISTDs (ए) और अंतर्जात मेटाबोलाइट्स (बी) की बहुतायत. निकाला गया था और जिसके परिणामस्वरूप नमूने आरपीसी का उपयोग कर अलग हो गए थे और सकारात्मक और नकारात्मक ionization मोड में नियंत्रण रेखा के एमएस का उपयोग का विश्लेषण किया. यह आंकड़ा यांग एट अल, क्रोमैटोग्राफी 1300, 217-226 (2013) के जर्नल से संशोधित किया गया है.

चित्रा 2

चित्रा 2. एमटीबीई-एसपीई की तुलना से 12 अंशों. प्रत्येक fr में पहचान मेटाबोलाइट्सकार्रवाई प्रस्तुत करने के विशेष भाग के दौरान ओवरलैप की राशि की पहचान की तुलना में थे. वेन आरेख में संख्या प्रत्येक अंश में पाया मेटाबोलाइट्स की संख्या को दर्शाते हैं. यहाँ मामूली ओवरलैप विशेष कदम के दौरान सफल परिसर निष्कर्षण और metabolite वर्ग जुदाई का प्रतिनिधित्व तीन भिन्न, के बीच मनाया जाता है. यह आंकड़ा यांग एट अल, क्रोमैटोग्राफी 1300, 217-226 (2013) के जर्नल से संशोधित किया गया है.

चित्रा 3
चित्रा 3. एमटीबीई-एसपीई विधि 12 का उपयोग भागों में ISTDs की वसूली. निकाला गया था और जिसके परिणामस्वरूप नमूने आरपीसी का उपयोग कर अलग हो गए थे और पाठ में वर्णित के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक मोड में एलसीएमएस का उपयोग का विश्लेषण किया. यह आंकड़ा यांग एट अल, 217-226 (2013) क्रोमैटोग्राफी 1300 के जर्नल से संशोधित किया गया है. </ P>

चित्रा 4
चित्रा 4. तीन ऑपरेटरों द्वारा तैयार गोली अंश का परिणाम है. तीन नमूना तैयार ऑपरेटरों ए, बी, और सी जमा प्लाज्मा नमूनों पर ही प्रोटीन तैयारी कदम प्रदर्शन किया. वेन आरेख में संख्या प्रत्येक ऑपरेटर द्वारा पता लगाया मेटाबोलाइट्स की संख्या को दर्शाते हैं. ऑपरेटर एक 500 से अधिक अधिक मेटाबोलाइट्स, बहुमत कि विशिष्ट अंश के लिए झूठी सकारात्मक जा रहा है, जिसके परिणामस्वरूप पूरे सतह पर तैरनेवाला और गोली के कुछ pipetted जबकि ऑपरेटरों बी और सी नमूना तैयार प्रोटोकॉल प्रति अपेक्षित मात्रा pipetted.

चित्रा 5
प्रोटीन तेज़ी चरण के दौरान प्रोटीन गोली की चित्रा 5. संरचना <. / Strong> (ए) मानव प्लाज्मा के 100 μl पूर्व तैयारी नमूने के लिए, (बी) प्लाज्मा बर्फ ठंड मेथनॉल के बाद इसके अलावा, 18,000 एक्स पर 15 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर centrifuging के बाद ट्यूब के तल पर गठित (सी) प्रोटीन गोली जी.

चित्रा 6
तरल तरल निष्कर्षण (LLE) चरण के दौरान हाइड्रोफिलिक और hydrophobic परतों के 6 चित्रा. पृथक्करण. कार्बनिक विलायक मिथाइल tert-butyl ईथर (एमटीबीई) और पानी हाइड्रोफिलिक और hydrophobic मेटाबोलाइट्स अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया. एमटीबीई परत गैर ध्रुवीय यौगिकों भंग कर दिया है और पानी की परत ध्रुवीय यौगिकों भंग कर दिया है (ए) प्लाज्मा सतह पर तैरनेवाला प्रोटीन को हटाने के बाद,. (बी) प्लाज्मा नाइट्रोजन के तहत सुखाने के बाद, एमटीबीई के अलावा के बाद (सी) प्लाज्मा; ओंग> प्लाज्मा और एमटीबीई के लिए पानी का (डी) इसके अलावा, centrifuging के बाद गठित (ई) एमटीबीई पानी परत; शीर्ष एमटीबीई परत की (एफ) को हटाने, (जी) एमटीबीई हटाने के बाद शेष मुख्य रूप से हाइड्रोफिलिक परत.

चित्रा 7
चित्रा 7.. नमूना तैयार करने में तीन अलग जमा प्लाज्मा QC नमूने और प्रत्येक नमूने पर प्रदर्शन किया गया था एक चयनित डाटासेट से अंशों की chromatograms नियंत्रण रेखा एमएस साधन पर तीन प्रतियों में इंजेक्ट किया गया था. विधि प्रोटोकॉल की धारा 7 में संकेत नियंत्रण रेखा एमएस मापदंडों का उपयोग कर हासिल प्लाज्मा नमूनों की कुल आयन chromatograms हैं प्रतिनिधित्व किया. अन्य जैविक तरल पदार्थ की chromatographic प्रतिनिधित्व वजह metabolite संरचना में अंतर करने के लिए अलग अलग होंगे."कश्मीर> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

अंश आयनीकरण मोड आंतरिक मानक n औसत चोटी क्षेत्र चोटी के क्षेत्र% सीवी
जलीय सकारात्मक क्रिएटिनिन डी 3 31 2217311 3.8%
तटस्थ लिपिड सकारात्मक ट्राइग्लिसराइड डी 5 31 4837032 9.9%
C17 Ceramide 31 12736707 7.9%
फॉस्फोलिपिड सकारात्मक 15:00 पीसी 32 1248929 9.3%
17:00 पीई 32 517,234 7.9%

नुकीला आंतरिक मानकों से तालिका 1. गुणवत्ता नियंत्रण का परिणाम है. एक वातस्फीति माउस मॉडल डाटासेट से जमा प्लाज्मा नमूनों इस बहु - सप्ताह के अध्ययन के लिए एक दैनिक आधार पर साधन की स्थिति पर नजर रखने के लिए विश्लेषण किया गया. मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर आंतरिक मानकों (एन साधन क्यूसी इंजेक्शन के = संख्या) के शिखर क्षेत्रों निर्धारित किया गया था.

अंश आयनीकरण मोड अंतर्जात मेटाबोलाइट्स औसत चोटी क्षेत्र चोटी के क्षेत्र% सीवी
जलीय सकारात्मक क्रिएटिनिन 2554574 2.3%
Valine 3712151 3.3%
ग्लूकोज 2669190 6.9%
तटस्थ लिपिड सकारात्मक 3 Dehydrosphinganine 226,644 3.9%
11,301 8.2%
महानिदेशक (पी -14: 0/18: 1) 364,119 1.9%
फॉस्फोलिपिड सकारात्मक पीसी (24:0 / 0:0) 27,599 0.9%
PC16: 0/22: 6) 2873326 4.5%
पीआई (16:0 / 18:1) 112,998 4.4%
फैटी एसिड सकारात्मक 10-oxo-5, 8-decadienoic एसिड 1363284 2.3%
16 Oxo-heptadecanoic एसिड 83,700
2 मिथाइल मुल एसिड 285,782 5.7%
फैटी एसिड नकारात्मक 10-हाइड्रोक्सी 8 octadecenoic एसिड 10042 4.9%
(नि.) laballenic एसिड 173,929 6.5%
2 कीटो मुल एसिड 35,488 6.0%

अंतर्जात मेटाबोलाइट्स से तालिका 2. गुणवत्ता नियंत्रण का परिणाम है. एक मानव रोग डाटासेट से जमा प्लाज्मा नमूनों अलग दिनों पर नमूना तैयार reproducibility नजर रखने के लिए विश्लेषण किया गया. नमूने, तीन दिनों में तीन प्रतियों में तैयार (एन = 9 प्रस्तुत करने का क्यूसी इंजेक्शन) थे.

Discussion

नैदानिक ​​metabolomic एक अध्ययन के लक्ष्य रोग या उपचार से संबंधित metabolome में परिवर्तन की पहचान है. इसलिए नमूना तैयार करने की तकनीक, मजबूत संगत, और तकनीशियन से तकनीशियन को और प्रयोगशाला से प्रयोगशाला 22 को हस्तांतरित करने की जरूरत है. परिणामी डेटा नमूना के प्रतिनिधि होने की जरूरत है, और पहचान परिवर्तन बल्कि नमूना तैयार करने त्रुटियों से सेट नमूना प्रतिबिंबित करने की जरूरत है. इसलिए सही pipetting, सही तापमान, अमिश्रणीय परतों के कुशल decanting, नाइट्रोजन के तहत सुखाने, और कांच के बने पदार्थ और सुझावों की एक ही ब्रांड और आकार के उपयोग के लिए आवश्यक हैं.

प्रोटीन तेज़ी चरण के दौरान, यह समाधान का एक ही राशि के प्रत्येक गोली से निथर जाता है कि महत्वपूर्ण है. यह मात्रा में भिन्नता को कम कर देता है और इस तरह के रूप में नमूना डेटा में भिन्नता कम कर देता है. यह प्रोटीन तेज़ी कदम metabolomic पढ़ाई के लिए आवश्यक है और इसे से प्रोटीन को हटा के बाद से छोड़ी नहीं जा सकतापूर्व छोटे अणु के लिए नमूने मास स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण रूपरेखा. यह रोगजनकों और बड़े अणुओं को समाप्त, और रिलीज प्रोटीन 7 से मेटाबोलाइट्स बाध्य. नमूनों में प्रोटीन संचय का अभाव HPLC स्तंभ जीवनकाल का विस्तार होने और सटीकता और परिणामों की गुणवत्ता. 5 प्लाज्मा नमूनों पर इस तकनीक का प्रदर्शन बनते हैं जब प्रोटीन गोली का चित्रण है आंकड़ा बढ़ जाती है. इस छोटे अणुओं का पता लगाने, आयन बहुतायत को बढ़ाता है, और नमूने में प्रोटीन से मैट्रिक्स प्रभाव कम कर देता है की अनुमति देता है. यह सभी प्रोटीन इस चरण में हटा रहे हैं माना जाता है कि इसके अलावा,, नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण के दौरान पता चला रहे हैं जो एमिनो एसिड चयापचय परिवर्तनों से बजाय प्रोटीन टूटने से उत्पन्न होता है.

यह दो अमिश्रणीय परतों में हाइड्रोफिलिक और hydrophobic मेटाबोलाइट्स अलग करती है क्योंकि तरल तरल निष्कर्षण कदम महत्वपूर्ण है. 6 आंकड़ा LLE प्रक्रिया और एक प्रतिनिधि से पता चलता हैLLE परत की resentation. दो परतों के एक अनुचित जुदाई मेटाबोलाइट्स खो दिया जा रहा है या दोनों भागों में eluted किया जा रहा है या तो में यह परिणाम है. इस कदम से सावधान आवेदन हाइड्रोफोबिक अंश में दिखाई देते हैं जो हाइड्रोफिलिक यौगिकों की संख्या कम कर देता है. यह प्रतिनिधि परिणाम होता है जो अंश निर्धारित नहीं किया जा सकता क्योंकि इन यौगिकों के लिए परिणाम अविश्वसनीय हो गया है. सही ढंग से किया है, metabolite ओवरलैप कम है.

विशेष रूप से लिपिड में भी, लेकिन उदाहरण के लिए thiol समूहों को हो सकती है जो छोटे अणुओं में, oxidative गिरावट को रोकने के लिए, ऑक्सीजन के लिए जोखिम कम से कम रखा जाना है. इसलिए, इस प्रक्रिया हमेशा लिपिड या thiol युक्त यौगिकों के ऑक्सीकरण रोकने / कम करने के लिए नाइट्रोजन के तहत किया जाता है. इसके अलावा, नमूना और / या समाधान के हस्तांतरण के नमूने जल्दी से नीचे करने के लिए सूखी नाइट्रोजन की एक सतत स्ट्रीम के तहत रखा जाता है तो, ऑक्सीजन जोखिम को कम करने के लिए (पहले मिनट के अंदर) तेजी है. एक बार सूखे, वे तुरंत हैंately ऊपर चर्चा कारणों के लिए 100% मेथनॉल में resuspended.

प्रयोगशालाओं तरीकों की एक संख्या में इस व्यापक विधि से लाभ उठा सकते हैं; यौगिकों के एक वर्ग को अलग करने की तलाश में शोधकर्ताओं सबसे अच्छा सूट अपने की जरूरत है, जो विधि के भाग के लिए चुन सकते हैं. केवल मेटाबोलाइट्स के एक पूल प्राप्त करने के लिए एक प्रोटीन तेज़ी प्रदर्शन करने के लिए उन लोगों की तलाश कर सकते हैं. हाइड्रोफिलिक मेटाबोलाइट्स ऐसे कई दवाइयों, अमीनो एसिड, और शक्कर, या केवल हाइड्रोफोबिक मेटाबोलाइट्स ऐसे ट्राइग्लिसराइड्स, epoxides, वसा में घुलनशील विटामिन, और उदाहरण के लिए phospholipids के रूप में, वांछित हैं, तो शोधकर्ताओं तरल तरल निष्कर्षण प्रदर्शन कर सकते हैं, के रूप में वांछित हैं प्रोटीन तेज़ी निम्नलिखित कदम और अवांछित अंश त्यागें. हाइड्रोफोबिक यौगिकों (तटस्थ लिपिड, फैटी एसिड होता है, और phospholipids) के आगे उप वर्गीकरण की आवश्यकता होती है जो जांचकर्ताओं fractionation कदम पर आगे बढ़ सकते हैं.

संग्रहण विचार maintaini में महत्वपूर्ण हैंबाद में विश्लेषण के लिए नमूने की व्यवहार्यता एनजी. नमूनों को गलत तरीके से जमा हो जाती है, तो गिरावट या अपघटन हो सकता है. आदर्श रूप में, नमूने प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रजातियों की गिरावट को रोकने के प्रकाश से दूर पेंच टोपी एम्बर शीशियों में संग्रहित किया जाना चाहिए. नमूने भी metabolite गिरावट 23-25 ​​को रोकने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमी रखा जाना चाहिए. यहां विस्तार से चर्चा नहीं है, नमूने हमेशा नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण के दौरान autosampler ट्रे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है. यह सभी नमूने एक लगातार तापमान में और परिवेश के तापमान में परिवर्तन के नमूनों की चिपचिपाहट, विलेयता, या स्थिरता को प्रभावित नहीं करते कि रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करता है. यह ऐसी LLE और विशेष रूप में इस प्रक्रिया का मार्गदर्शन पहलुओं, शामिल कदम के साथ आत्मविश्वास और आराम हासिल करने के लिए अभ्यास किया जा सिफारिश की है.

कुछ सीमाएँ इस तकनीक के लिए मौजूद हैं. हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक मेटाबोलाइट्स के विचारशील जुदाई कुछ यौगिकों inher के रूप में होगा इसकी गारंटी नहीं हैently कारण उनकी रासायनिक संरचना और प्रभारी राज्य के लिए दोनों भागों में विभाजन. चित्रा 4, प्रोटीन गोली निष्कर्षण कदम के दौरान अनुचित तकनीक के नमूने और गुणवत्ता नियंत्रण दोनों में गरीब metabolite reproducibility में परिणाम कर सकते हैं के रूप में दिखाया अलावा. सांख्यिकीय बिजली उपलब्ध नहीं है क्योंकि यह विशेष रूप से छोटे डेटासेट में आँकड़ों को प्रभावित करता है. इसलिए यह इस कदम वास्तव में प्रत्येक नमूने के लिए हर बार एक ही प्रदर्शन किया जा है कि महत्वपूर्ण है. एक और सीमा समय है. स्टॉप अंक नमूने जमा किया जा सकता है और प्रस्तुत करने का अगले दिन जारी रहा जहां इस प्रोटोकॉल भर में कर रहे हैं, एक पूरा दिन इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए अलग सेट किया जाना चाहिए. तीसरा, एक जैविक नमूने के भीतर हर मिश्रित आयन दमन के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है नहीं. यह मैट्रिक्स प्रत्येक व्यक्ति metabolite प्रभावित हो रहा है कैसे पहचान करने के लिए संभव नहीं है, इसलिए मौजूदा विकल्प सैद्धांतिक रूप से endogenou के कुछ वर्गों की नकल जो आंतरिक मानकों का मूल्यांकन करने के लिए हैएस मेटाबोलाइट्स. अन्त में, पूर्ण पहचान इस विधि के साथ पूरी तरह से नहीं किया जा सकता. डेटाबेस खोजों और मानकों के साथ सहयोग में अग्रानुक्रम एमएस पूर्ण metabolite पहचान के लिए आवश्यक हैं.

Metabolomics का एक महत्वपूर्ण हिस्सा यौगिकों की पहचान है. यहां विस्तार से चर्चा नहीं है, गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने नियंत्रण रेखा एमएस का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. कई नमूना तैयारी कारतूस और साधन कारतूस जिससे और अधिक विश्वसनीय metabolite हिट है, जिसके परिणामस्वरूप contaminants से झूठी सकारात्मक की दर को कम करने के लिए पृष्ठभूमि घटाव के रूप में इस्तेमाल के लिए तैयार थे. इस कदम के बाद, "आणविक सुविधाओं" की संख्या मी / z, प्रतिधारण समय, आइसोटोप अनुपात, और वास्तविक यौगिकों की एक सूची का निर्माण करने के adducts के आधार पर एक साथ वर्गीकृत किया गया. यौगिकों की सूची बहुत कम हो गया था हालांकि वे एक ही परिसर से कई adducts पर आधारित नहीं थे, परिणाम और अधिक विश्वसनीय थे. पूर्ण विधि व्यापक है और isolatio अनुमति देता हैऐसे तटस्थ लिपिड, phospholipids, फैटी एसिड, ट्राइग्लिसराइड्स, और स्टेरॉयड, भी जलीय अंश में हाइड्रोफिलिक वर्गों को अलग करते हुए, जिनमें से eicosanoids, शक्कर, flavonoids, और एमिनो एसिड 12 की पहचान की गई है, 26 के रूप में हाइड्रोफोबिक मेटाबोलाइट्स के एन.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

प्रस्तुत ट्यूटोरियल राष्ट्रीय यहूदी स्वास्थ्य पर मास स्पेक्ट्रोमेट्री कोर सुविधा के भीतर प्रदर्शन और विकसित किया गया था. NJH MS सुविधा CCSTI UL1 TR000154 द्वारा भाग में समर्थित है. एनआईएच अनुदान से अनुदान P20 एच. एल-113445 और R01 HL-095432 भी इस काम का समर्थन किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Fisher Scientific A955-4
Methanol Fisher Scientific L-6815
Chloroform Fisher Scientific C606-1
Hexane Sigma Aldrich 34859
Acetic acid Sigma Aldrich 49199-50ML-F
Methyl tert-butyl ether J.T. Baker 9042-03
Isopropyl alcohol Sigma Aldrich 34965-2.5L
Water Honeywell Burdick Jackson 365-4
OA-SYS heating system Organomation Associates, Inc Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35 °C
12-position vacuum manifold Phenomenex
Strata NH2 (55 µM, 70Å) 100 mg/ml SPE cartridges Phenomenex 8B-S009-EAK
Glass pipette tips Fisher Scientific 13-678-20C Used to transfer sample to SPE column
Plastic pipette tips USA Scientific 1182-1830 Used when glass tips are not necessary
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
Graduated glass pipets Fisher Scientific 13-678-27B Used to transfer organic solvents during sample prep
Pyrex glass culture tubes Corning Incorporated 99499-16X Used to store aqueous and lipid fractions until the next step
Autosampler vials Agilent Technologies 5182-0545
Snap cap vials for autosampler vials Agilent Technologies 5182-0541
Glass inserts Agilent Technologies 5183-2085 Used for small sample volumes
Mass Hunter Qualitative Analysis software Agilent Technologies Version B.06.00 Used to monitor retention times and pressure curves
Mass Hunter Quantitative Analysis software Agilent Technologies Version B.05.02 Used to analyze quality control and sample data
Mass Profiler Professional software Agilent Technologies Version B.12.50 Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification

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References

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Cruickshank-Quinn, C., Quinn, K. D., Powell, R., Yang, Y., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51670, doi:10.3791/51670 (2014).

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