Multi-trinns Forberedelse teknikk for å gjenopprette flere Metabolittkonsentrasjoner Sammensatte Klassene for inngående og informativ metabolomic Analysis

Summary

Påliteligheten av resultatene i metabolomics eksperimenter avhenger effektiviteten og reproduserbarhet av prøveopparbeidelse. Beskrevet er en streng og grundig metode som gjør det mulig for utvinning av metabolitter fra biologiske væsker med mulighet for senere å analysere opp til tusenvis av forbindelser, eller bare de sammensatte klasser av interesse.

Abstract

Metabolomics er et voksende felt som gjør at profilering av prøver fra levende organismer for å få innsikt i biologiske prosesser. Et viktig aspekt av metabolomics er prøveopparbeidelse hvor inkonsekvente teknikker generere upålitelige resultater. Denne teknikken omfatter proteinet ventet, væske-væske-ekstraksjon, og fast-fase ekstraksjon som et middel for fraksjone metabolittene inn i fire forskjellige klasser. Forbedret berikelse av lav overflod molekyler med en resulterende økning i følsomheten er oppnådd, og til slutt resulterer i mer trygg identifisering av molekyler. Denne teknikken har blitt brukt til plasma, bronchoalveolar lavage væske, og spinalvæskeprøver med volum så lavt som 50 mL. Prøver kan brukes til flere nedstrøms applikasjoner; For eksempel kan pellets som følge av protein ventet lagres for senere analyse. Supernatanten fra det trinn gjennomgår væske-væske ekstraksjon ved hjelpvann, og en sterk organisk oppløsningsmiddel for å separere de hydrofile og hydrofobe forbindelser. Etter fraksjonert, kan det hydrofile sjikt blir behandlet for senere analyse, eller forkastes hvis den ikke er nødvendig. Den hydrofobe fraksjonen blir ytterligere behandlet med en serie av oppløsningsmidler i løpet av tre faststoff-fase-ekstraksjon trinn for å skille den i fettsyrer og nøytrale lipider og fosfolipider. Dette gjør det mulig for teknikeren fleksibilitet til å velge hvilken klasse av forbindelser som er foretrukket for analyse. Det hjelper også i mer pålitelig metabolitten identifikasjon siden noen kunnskap om kjemisk klasse eksisterer.

Introduction

Biologiske reaksjoner generere metabolitter som sluttprodukter av cellulære prosesser. Metabolomics er en samling av alle de forbindelser som er tilstede i en organisme som et resultat av disse prosesser. Det gir et bilde av fysiologi av celler og reflekterer en organismes respons på ekstern eller intern stimuli ^{1, 2.} Slike stimuli kan være miljømessige, toksikologiske, farmakologiske, kosttilskudd, hormonelle, eller relatert til sykdom. Mange metabolomic programmer har og blir nå studert av forskere og inkluderer biomarkører ^3, ernæringsstudier ^4, matvitenskap ^5, og narkotikatesting ^seks. Uavhengig av anvendelse, variasjoner i dataene, forurensning, og tilstedeværelsen av falske positiver være nødvendig å redusere eller fortrinnsvis fjernet. I biomarkører eller i tilfellet med bestemmelse av forskjeller mellom en styring og en sykdom gruppe, eller å undersøke effektene av medikamenter på fag, en biologisk fluid er valgt basert på de spørsmålene som blir stilt, og hvilke typer metabolitter blir undersøkt ^syv. For eksempel, ville hvis studere de umiddelbare effektene av en inhalert stoffet på lungene av astmatikere, deretter utforske metabolitter i bronchoalveolar lavage væske (Balf) prøver før og etter administrering være fortrinnsrett. For å sikre at observerte forskjellene skyldes faktiske biologiske variasjonen i stedet for feilaktig prøveprepareringsteknikk, er standardisert og konsistent laboratorie protokoll vesentlig ^8.. Sample informasjon må være nøye dokumentert for å sikre at variabler som biologisk væske, belastning dyr, prøvetaking tid, med forbehold alder, kjønn, for å nevne noen, er alle vurdert og priset inn i studien ^ni. I tillegg, for å redusere muligheten for forurensning eller falske positiver, er det anbefalt at løsemiddel blanks og instrument blanks analyseres ^10..

For denne protokollen, begrepet "metabolites "vil bli brukt til å referere til den faktiske forbindelser identifisert. Ved hjelp av leverandøren programvare, blir en initiell topp funn algoritmen som brukes for å detektere masse spektrale topper. Disse toppene er justert basert på masse-til-charge (m / z) ratio og oppholdstid. En andre algoritme blir så brukt til å kombinere flere funksjoner i en enkelt forbindelse. Dette omfatter slike egenskaper som natrium-, kalium-, eller ammonium-addukter i den positiv ionisering modus, og klorid i den negative ion-modus. Andre alternativer i programvaren inkluderer funksjoner som dimer og andre addukter. Ved hjelp av glukose som et eksempel, med topper ved 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + _NH4), og 203,05261 m / z (M + Na), ville det være tre topper tilsvarende det samme forbindelsen ved anvendelse av den første algoritme. Men når den andre algoritme, som er basert på molekylformel, påføres disse tre addukter blitt gruppert sammen som resulterer i en forbindelse.

Metabolitter kan forårsake forstyrrelser innen SAMPles på grunn av kompleksiteten av forbindelser tilstede. Tilstedeværelsen av tusenvis av metabolitter i en prøve årsaker signaliserer undertrykkelse spesielt for de lavere overflod metabolitter. Prøve opprydding for å fjerne interfererende proteiner, og etterfølgende separering i flere fraksjoner reduserer kompleksiteten av prøven og dermed bedre peak separasjon, økende oppløsning, og redusere metabolitt coelution. Derfor er prøverensing og bedre separasjon av forbindelsene som kreves. Det har blitt vist at protein ventet alene, selv med bruk av ulike polaritet løsningsmidler, er ikke mulig å løse dette problemet ^{11, 12.} Imidlertid, ved å kombinere en sterk organisk oppløsningsmiddel så som MTBE med påfølgende fraksjonetrinnet blir metabolitten dekning økes. Yang et al. ¹² rapporterte en økning i metabolitter fra 1851 eller 2073 med metanol eller metanol-etanol nedbør alene henholdsvis til 3806 metabolitter ved hjelp av kombinert MTBE løsemiddelekstraksjonetterfulgt av fast fase-ekstraksjon (SPE) trinn. Redusert metabolitt overlapping, forbedret topp separasjon og økt metabolitt overflod ble observert med denne metoden.

Forurensninger fra ikke-metabolitter, for eksempel polymerer, kan resultere fra prøvetaking, oppløsningsmidler, eller instrumentstøy, og kan resultere i signal undertrykkelse av potensielt signifikante metabolitter. Det anbefales at tekniker (e) og de som samler prøvene før prøveopparbeidelse konsekvent bruke samme merke, type og størrelse på prøvetakingshetteglass, pipetter og eventuelle andre rør som brukes ved innsamling og utarbeidelse av prøvene. Dette gjør at dataanalytiker å ha full tillit til at de observerte endringene er reelle, og ikke på grunn av bakgrunns forskjeller fra andre kilder. Behandlingseffekt, kan variasjoner mellom sykdom og kontrollgrupper, eller andre metabolske analyser da bli undersøkt med økt selvtillit.

Den method diskutert her fokuserer på kombinerte prøveopparbeidelse metoder ^13-15 som kan brukes til plasma, Balf, eller cerebrospinalvæsken (CSF) prøver for ikke-målrettede metabolomic profilering for væskekromatografi-massespektrometri (LCMS) basert analyse. Både væskekromatografi (LC) og ultra-ytelse væskekromatografi (UPLC) separasjonsteknikker kan bli koblet til MS etter denne fremgangsmåten. Mange forskere utfører metabolomic studier bruke enten et protein ventet teknikk og / eller en væske-væske-ekstraksjon teknikk ^{16, 17.} I våre studier, dette resulterte i færre metabolitter blir oppdaget. Metoden som beskrives her ¹² muliggjør deteksjon og identifikasjon av et større antall av metabolitter, som dekker et bredere spekter av metabolome. Denne økning skyldes den høyere renhet av prøvene og reduserte matrise effekter som følge av forutgående separasjon av metabolitt-klasser.

En innledende protein utfellingstrinn utføres med kald metanol (MeOH) for å fjerne protein fra prøven. Væske-væske-ekstraksjon (LLE) under anvendelse av metyl-tert-butyleter (MTBE), og vann blir anvendt for å separere de hydrofile og hydrofobe forbindelser. Deretter fastfase ekstraksjon (SPE) er utført på det hydrofobe sjikt til å skille de hydrofobe forbindelsene i tre klasser - fettsyrer og nøytrale lipider og fosfolipider. De hydrofobe fraksjoner blir rekonstituert i 100% metanol, mens den hydrofile del er rekonstituert i 5% acetonitril i vann. De fast fase-ekstraksjon (SPE) trinn gir en ekstra grad av sikkerhet i resultatene ved å redusere antallet coeluting-forbindelser som ellers ville være til stede hadde et separasjonstrinn ikke utført.

Protocol

En. Innledende betraktninger, Utarbeidelse av instrumenter og standarder

1. Bruk alltid glass for lagring (glass kultur rør, glass autosampler hetteglass) eller overføring (glass pipetter) lipider og organiske løsemidler.
2. Minimer eksponering av alle lipid prøver og standarder til luft. Seal polytetrafluoretylen (PFTE) caps tett for å unngå luft eksponering og fordampning. Umiddelbart resuspender tørket lipider i neste løsemiddel eller holde dem i en jevn strøm av nitrogen.
3. Bruk 100 mL av prøven. I tilfeller hvor mer (eller mindre) prøven er tilgjengelig, justere volum tilsvarende. Men i løpet av lipid fraksjon på _NH2 SPE kolonne, fremgår volumer må forbli som angitt.
4. Slå på sentrifuge og satt til 0 ° C før start av prøveopparbeidelse.
5. Denne teknikken bruker mange flyktige løsemidler så holde alle løsemidler avkortet under tillagingen.
6. Forbered to typer standarder per anbefaling.
7. Tilbered en negativ kontroll bestående av piggete-i standardene på en konstant konsentrasjon. Dette blir tilsatt i alle prøvene, samt en samleprøve som anvendes som en batch QC (spiked samleprøve brukes til å overvåke prøvepreparering reproduserbarhet på forskjellige dager) og instrument QC (spiked samleprøver på forhånd fremstilt, sub-alikvotert, og brukes til å overvåke instrument vilkår / svingninger i løpet av analyse og på forskjellige dager).
   1. Forbered positive kontroller på 1x, 2x og 4x standard pigger. De positive kontrollene er lagt til alle prøvene, samt en samleplasmaprøve og brukes som kvalitetskontroll forbindelser for både prøveopparbeidelse trinn og instrumentell analyse trinn for å analysere og identifisere de fold endrings forskjeller under dataanalyse for å sikre at alle aspekter av forberedelse og instrumentell analyse ble utført på riktig måte.
8. Oppbevar standarder på -20 ° C og lagre prøver ved -80 ° C. Visse interne stativdarder som er utsatt for degradering etter lang tids lagring skal oppbevares ved -80 ° C.
9. Denne fremgangsmåten krever bruk av farlige, brennbare eller flyktige løsemidler som MTBE. Utføre alle trinnene i en avtrekkshette.

2. Interne standarder

1. Velg interne standarder (istD) basert på individuelle prosjekter og deres spesifikke eksperimentell design. For biofluids som plasma, Balf, eller urin, isotopically merket ISTDs som er beslektet med de som finnes biologisk i disse prøvene ville være ideelt. Disse vil inkludere, men er ikke begrenset til aminosyrer, hormoner eller lipider. For plante metabolomic prøver, kan merket standarder slik som flavonoider, eller karotenoider brukes. Det samme gjelder for andre metabolomic studier hvorved undersøkeren bør velge en intern standard, og som er representativt for prøvetypen som analyseres.
2. Sørg for at den valgte ISTD dekker et bredt spekter av kromatogrammet; for eksempel hvis tHan registreringstid er 20 min, standarder som eluere hvert 5 min kunne brukes.
3. Lag hydrofile stamløsninger ved 2 mg / ml ved å bruke et utvalg av isotopisk merkede standarder og / eller andre polare forbindelser som er eksogene for prøven som analyseres. Fra hver stamløsning, oppretter en løsning i 1:1 metanol: vann med alle krav til en endelig konsentrasjon på 25 pg / ml kreatinin-D _3, 100 pg / ml lysin, D _4, og 200 pg / ml valin-D ₈ .
4. Lag hydrofobe stamløsninger ved å bruke et utvalg av isotopisk merkede standarder og / eller andre ikke-polare forbindelser som er eksogen til prøven som blir analysert; lager konsentrasjoner av 17:00 fettsyre (4 mg / ml), 19:01 fettsyre (4 mg / ml), 17:00 ceramid (2 mg / ml), 17:00 PE (1.75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml), og _{testosteron-D-2} (1 mg / ml). Fra hver lager, oppretter en løsning i 1:1 kloroform: metanol med alle krav til en endelig konsentrasjon på 50ug / ml 17:00 ceramid, 100 ug / ml 15:00 PC, 100 pg / ml _{testosteron-D-2,} 200 pg / ml 17:00 fettsyre, 200 pg / ml 19:01 fettsyre, og 200 pg / ml 17:00 PE i standard mix.
5. Test graden av ionisering for hver standard på forhånd, ved hjelp av minst fem forskjellige konsentrasjoner for hver standard for å bestemme grensen for deteksjon og linearitet av instrumentet for disse forbindelsene. Konsentrasjonen av stamløsning for hver enkelt standard vil variere avhengig av eksperimentell design, og konsentrasjonen av hver standard i den kombinerte spiked standard kan være i området fra 20 pg / ml til 2 mg / ml, avhengig av hvor godt de ionisere.
6. Lag en pigg blanding av positive kontroller og legge dem til prøvene på 1x, 2x eller 4x konsentrasjonsnivåer for å overvåke kvantitativt styrken på prøveopparbeidelse og nøyaktigheten av de instrumentelle data. Endelig konsentrasjon av positive kontroller muligvære: 2 mg / ml D-glukose, 100 pg / ml _alanin-D-3, 200 pg / ml metylmalonsyre-D _3, 20 pg / ml _{triglyserid-D-5,} og / eller andre hydrofobe og hydrofile standarder. Juster standard konsentrasjoner basert på følsomheten av MS og HPLC-instrumentering brukes for analyse.

Tre. Protein Nedbør

1. Varm opp prøvene til RT og pigg 10 pl ISTD til hver prøve, som beskrevet nedenfor.
2. Spike 10 mL av både hydrofile og hydrofobe standardløsninger (opprettet fra lager i trinn 2,3 og 2,4) til hver prøve. Juster standard konsentrasjoner som det er nødvendig, basert på følsomheten til MS og HPLC-instrumentering brukes for analyse
   1. Spike 10 mL av enten 1x, 2x eller 4x positiv kontrolløsning (opprettet fra lager i trinn 2.6) til hver prøve. Juster standard konsentrasjoner som det er nødvendig, basert på følsomheten til MS og HPLC instrumentering brukes til analyse
   2. Vortex hver prøve i 10 sekunder før proteinet utfellingstrinnet
3. Tilsett 400 ul iskald metanol (lagret ved -20 ° C) til hver prøve.
4. Vortex i 10 sekunder per rør.
5. Sentrifuger ved 0 ° C i 15 min ved 18 000 x g.
6. Overfør all supernatanten til et nytt glass kulturrøret, og deretter tørke i henhold N _2.
7. Hvis analysere proteinet pellet brøkdel, fortsetter du med punktene 3.8 til 3.11. Hvis ikke analysere protein pellet, hopp til punkt fire.
   Merk: protein pellet kan inneholde forbindelser med høy hydrofobitet som ville være nyttig når du utfører legemiddelstudier ^18, mat analyser involverer hydrofobe flavonoider ¹⁹ eller metabolomic studier knyttet til sykdommer der svært hydrofobe forbindelser akkumuleres, for eksempel nerve ceroid-lipofuscinoses ²⁰ og lysosomal lipid lagring sykdommer ^21.
8. Tilsett 1 ml av MTBE til tHan hvitt (eller off-white) protein pellet, vortex i 30 sekunder per rør, og deretter sentrifuger ved 0 ° C i 15 min ved 18 000 x g. Dekanter MTBE lag til en ny glasskulturrøret.
   Dette er et kritisk punkt som feil her vil drastisk påvirke resultatene (se figur 5 i representative resultater).
   1. Jevnt Aspirer samme mengde MTBE for alle prøver, siden størrelsen av pelleten vil variere mellom prøvene. Derfor, hvis bare 900 pl kan bli dekantert for prøven med minst mulig supernatant, og deretter dekanteres 900 pl for alle prøvene.
9. Gjenta trinn 3.9, og kombinere det organiske lag til det samme glass kulturrøret fremstilt i trinn 3.7.
10. Tørre prøver med N ₂ flyt og resuspender i 200 pl av 01:01 kloroform: metanol. Vortex kort.
11. Overføring til et sentrifugerør. Sentrifuger ved 0 ° C i 15 min ved 18 000 xg, og supernatanten overføres til autosampler skrulokk ampuller ved bruk av glasspipetter.

4.. Væske-væske ekstraksjon

1. Ved hjelp av en glass-pipette, tilsett 3 ml MTBE til den tørkede gjenværende metanol (fra punkt 3, trinn 6), virvel 30 sekunder, tilsett 750 pl vann, og deretter vortex 10 sek per rør.
2. Spin ~ 200 xg i 10 minutter i en sentrifuge ved RT.
3. Aspirer 2,5 ml av MTBE lag (uten å få vann) og overfør til et rent glass kulturrøret.
   Merk: Dette er et kritisk punkt som forskjeller her vil påvirke resultatene. 2,5 ml MTBE bør omhyggelig dekantert fra det øverste laget, fordi det tillater en fast volum å bli dekantert uten å pipettere det vandige lag under. Dersom volumet av prøven ved begynnelsen av eksperimentet var mindre enn de angitte 100 pl for denne metoden, skalere volumet av MTBE til proporsjonalt reflektere dette startprøvevolum.
4. Tilsett 3 ml MTBE til den gjenværende del av vannet prøven, og vortex 10 sek per rør.
5. Spin ~ 200xg i 10 minutter i sentrifugen ved RT.
6. Sug 3 ml MTBE (uten å få vann) og kombinere med MTBE tube.
7. Konsentrer den gjenværende vandige lag ved tørking under N _2.
8. Re-suspen rest i 100 pl vann.
9. Legg 400 mL av iskald MeOH til glasset kultur tube, vortex kort, og deretter overføre til mikrosentrifuge tube.
10. Igjen ved -80 ° C i 20-30 min. Sentrifugering ved 0 ° C i 15 min ved 18 000 x g.
    Merk: Det er anbefalt å plassere hele prøvebeholder i en -80 ° C fryser, da dette vil tillate enhver gjenværende protein for å utfelle i metanol. Hvis en -80 ° C fryser ikke er tilgjengelig, er andre alternativer: lagring ved -20 ° C, plassere prøvene på tørris, eller holde dem i en isbøtte. Det er viktig å gående lagring av prøvene i et kaldt miljø, og ved den samme temperatur for å tillate utfelling.
11. Aspirer 450 mL av supernatanten og overføring tilen ren mikrosentrifuge tube. Tørk fullstendig i vakuum sentrifugal konsentrator på ikke mer enn 45 ° C. (Tar ca 1-2 timer).
12. Resuspender tørket supernatant i 200 ul av 5% acetonitril / vann. Vortex kort. Fryse ved -80 ° C.

5. Solid-phase Extraction

1. Tørk MTBE fraksjonen under nitrogen ved 35 ° C med en god strøm av nitrogen (tar omtrent 10 til 15 min).
2. Når fullstendig tørt, stoppe strømmen av nitrogen og raskt resuspender i 1 ml kloroform (CHCl ₃₎ ved hjelp av en glass-pipette. Vortex kort.
   Merk: Oppløsningsmidler slik som CHCl ₃ har lav viskositet. Under pipettering, lav overflatespenning fører løsemiddel tap fra pipetten. Det anbefales at pipettespissen bli prewet minst to ganger for å tillate vektutjevning mellom løsemiddel blir pipettert og plassen i pipetten. En gasstett sprøyte kan også brukes hvis det er tilgjengelig.
3. Sett opp en SPE vakuum manifold og NH ₂
4. Varm prøvene til RT og alltid holde suspendert under en jevn flyt av N _2. Oppvarming til RT vil tillate lipid resuspensjon og nitrogen vil hindre oksidasjon og polymerisasjon av lipider.
5. Vask og tilstanden SPE patron 2x med 400 mL heksan. Kast avfall og erstatte med nye glass samling rør.
6. Legg prøve til SPE kolonne, samle strømme gjennom i glassrør.
7. Med glass pipette legge en ml 02:01 CHCl _3: IPA, samle strømme gjennom i samme glass rør (dette er den nøytral Brøk).
8. Tørk den nøytrale fraksjon etter N ₂ for å minimalisere oksidasjon (tar omtrent 10 til 15 min).
9. Med glass-pipette 1 ml av 5% eddiksyre i dietyleter, samle strømme gjennom i nye glass-rør (dette er den Fatty Acid fraksjon).
10. Tørk fettsyrefraksjonen etter N ₂ for å minimalisere oksidasjon (tar omtrent 10 til 15 min).
11. Bruk plast tips å legge 800 &# 181, l metanol til SPE patronen, og samle gjennomstrømning på 15 ml plast koniske rør (dette er fosfolipidfraksjonen).
12. Overfør fosfolipidfraksjonen til 1,5 ml sentrifugerør. Tørk prøvene med en vakuum sentrifugal konsentrator ved 45 ° C (tar omtrent 1-1,5 time).
13. Resuspender hver av prøvene fra de tre fraksjoner på 200 pl av 100% metanol, Vortex og overføring til autosampler hetteglass med skrukork for lagring.

6. Prøveoppbevaring betingelser

1. Oppbevar alle prøver ved -80 ° C til den er klar for instrument analyse.
   Merk: Ekstraherte prøver, rekonstituert i organisk oppløsningsmiddel, kan lagres ved -20 ° C. Men dette anbefales ikke som potensielle metabolitter av interesse vil bli dårligere ved denne temperaturen. Flytende nitrogen oppbevaring er heller ikke anbefalt som etterforskere har rapportert forurensningsproblemer, spesielle oppbevarings ampuller er nødvendig, og det er mangel på homogenitet i kammeret causynge store temperatursvingninger.
2. Hvis prøvevolumet er små (<100 mL) ved hjelp av innstikk i ampullene for å forhindre fordamping midlet i det øvre område under lagring.
3. Unngå frysing og tining av prøvene. Tine prøvene bare én gang, rett før instrument analyse. Gjentatte fryse-tiner resultere i prøve degradering.

7. Væskekromatografi betingelser

1. Bruk en C-18 2,1 mm x 50 mm (1,8 mikrometer) analytisk kolonne med et C-18 2,1 mm x 12,5 mm (5 mm) vaktkolonne for å analysere den hydrofobe fraksjonen.
2. Sett autosampler temperaturen til 4   Kolonnetemperaturen til 60 ° C,   ° C, injeksjonsvolum på 2 pl, og strømningshastigheten til 0,25 ml / min.
3. Bruk 0,1% maursyre i vann i mobil fase A, og 0,1% maursyre i isopropanol: acetonitril: vann (60:36:4) for mobil fase B.
4. Kjør følgende gradient elueringsprofilen: Start ent 30% B, og økning til 70% B fra 0 til 1 min, deretter økning til 100% B 1 til 15 min og hold i 5 min, fulgt av 5 min 10% B for vasking og 5 min etter løp.
5. Bruk en HILIC 2.1 mm x 50 mm (2,6 mikrometer) analytisk kolonne med en vaktkolonne for å analysere den hydrofile fraksjon.
6. Sett autosampler temperaturen til 4   Kolonnetemperaturen til 20 ° C,   ° C, injeksjonsvolum på 2 pl, og strømningshastigheten til 0,5 ml / min.
7. Bruk 50% acetonitril i 10 mM ammoniumacetat, pH 5,8 for mobilfase A og 90% acetonitril i 10 mM ammoniumacetat pH 5,8 for mobil fase B.
8. Kjør følgende gradient elueringsprofilen: Start ved 100% B 0-2 min, og deretter reduseres til 50% B 2-15 min, fulgt av 5 min 0% B vask og 10 min etter løp.

Representative Results

Hele prøveprepareringsteknikk ble utført som beskrevet ovenfor, og de viktigste og / eller relevante aspekter er presentert nedenfor. Hydrofile og hydrofobe interne standardene ble tilsatt i sammenslåtte plasmaprøver for å utføre direkte sammenligninger av interne standarder og endogene metabolitten hopetall ved hjelp av ulike utvinningsmetoder. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) data ble analysert ved hjelp av kvalitativ og kvantitativ programvare og resulterte i utmerket gjenvinning og separering av begge de endogene forbindelser og interne standarder. Figur 1 viser effektiviteten av MTBE-SPE-metoden i å trekke ut både lipid-standarder (A) og endogene forbindelser (B).

Totalt sett bedre ekstraksjon og dekning av metabolittene ble erholdt sammenlignet med andre metoder, slik som metanol ekstraksjon, eller 'bare MTBE' ekstraksjon når antallet of funksjoner ble sammenlignet ved hjelp av kvalitative og kvantitative programvare følgende LC-MS analyse. For eksempel, kun ved hjelp av metanol utvinning, variasjonen for kreatinin-D ₃ var 15,2%. Men med MTBE LLE, dette ble redusert til 1,04% CV. Ved hjelp av MTBE, reproduserbarheten av lipider og vandige sammensetninger var <henholdsvis 8% og <5%, i forhold til en enklere metanolekstraksjon som resulterte i større variasjon på 29% og 15% henholdsvis for lipider og vandige sammensetninger. De interne standarder som brukes til å overvåke lipid inngang - testosteron-D _2, C17 ceramide, 15:00 PC, og 17:00 PE økt med 26%, 200%, 100%, 400% sammenlignet med å bruke metanol alene. Liknende økninger ble oppdaget for fettsyre interne standarder og phosphotidylcholine og phosphotidylethanolamine endogene metabolitter. Andre endogene metabolitter som sphingosines, ceramider, diacylglyceroler, triacylglyceroler, kolesterol, og sphingomyelin ble heller ikke oppdagetved hjelp av metanol eller ble oppdaget på et ubetydelig nivå. Men disse endogene lipider ble lett oppdages ved hjelp av MTBE utvinning.

I vår analyse sammenligner standard-protokoller, ble følgende resultater erholdt: Metanol ventet alene resulterte i 1,851 metabolitter, metanol-etanolutfelling ga 2,073 metabolitter, MTBE med væske-væske-ekstraksjon ga 3,125, og MTBE med væske-væske-og fast fase-ekstraksjon gjenvinnes 3806 metabolitter. Derfor dette resulterer i et større antall metabolitter pakkes ut, mest sannsynlig på grunn av redusert ion undertrykkelse og renere prøvene før LC-MS.

Figur 2 demonstrerer effektiviteten i å skille de hydrofobe metabolittene inn i sine respektive kjemiske klasser for mer sikker metabolitt identifikasjon. Det er minimal overlapping av de forbindelsene som er identifisert i de tre Lipidfraksjonene følgende SPE. I support, Figur 3 visergjenvinning av de interne standarder som viser at ISTD er ble eluert i fraksjonen er relatert til deres kjemiske klasse.

Kvalitetskontrollprøver blir brukt til å vurdere kvaliteten av prøvepreparering, for å bestemme eventuelle batch effekter når flere dager for analyse kreves for et stort prøvesett, og for å overvåke instrumenter reproduserbarhet. Kromatogrammer blir undersøkt for å sikre at piggete-in standarder er større enn 90% gjenopprettes med masse feil på mindre enn ± 3 ppm og retensjonstid vindu på mindre enn ± 5%. Hvis disse kriteriene ikke er oppfylt, blir resultatene kastet og prøvene analyseres på nytt. I et tilfelle av batch-virkninger, hvorved en endring i retensjonstid er observert for en batch, kan dataanalyseprogramvare korrigere for denne. En tidligere utarbeidet batch av samleplasmaprøver gikk prøveopparbeidelse. Fraksjonene ble deretter under alikvotert inn i autosampler ampuller og lagret ved -80 ° C for anvendelse i overvåking instrument condider rundt hver prøveanalysen. Tabell 1 viser resultatene fra disse pigg-i standarder. Fettsyren negativ ionisering modus fraksjon (data ikke vist i tabellen) ble ikke brukt for analyse, fordi% CV av pigg-in-standarder for QC sample den var større enn 10%. Datasettet for den fraksjon ble derfor kassert og apparatet inspiseres og vedlikeholdes. Tabell 2 viser resultatene fra endogene metabolitter i prøvene følgende tre forskjellige dager med prøvepreparering og tredoble instrument injeksjoner. De endogene metabolitter i prøvepreparering QC eksempler er alle reproduserbare, betegner styrken av prøvepreparering, så vel som apparatet injeksjon reproduserbarhet.

Når prøveprepareringsfremgangsmåten ikke er skikkelig fulgt, men er upålitelige og inkonsekvente resultater erholdt. Figur 4 viser resultatene når proteinet utfellingstrinnet av metodener ikke fulgt som skissert. Tre operatører, A, B og C utføres på samme prøveprepareringsprosedyre på sammenslåtte plasmaprøver. Operatøren A, i stedet for pipettering den nødvendige mengde supernatant per den eksperimentelle protokollen, i stedet pipettert> 1 ml for både vasker med noe av pelleten. Dette ikke bare resultert i et høyere antall falske positive for at fraksjonen, men økte variabilitet av dataene.

Den kromatografiske reproduserbarhet av dataene kan ses på figur 7. Sammenslått plasmaprøver ble fremstilt i triplikat på forskjellige dager ved hjelp av protein nedbør, væske-væske-ekstraksjon, og fast fase-ekstraksjon som er beskrevet i denne protokollen. Hver fraksjon ble analysert ved hjelp av den kromatografiske separasjon som er beskrevet i avsnitt 7 av protokollen. Prøver ble deretter injisert i triplikat på LC-MS for å evaluere instrument og prøvepreparering reproduserbarhet. Denne konsekvente overlapping demonstrerer både strength av reproduserbarheten av prøvepreparering, når det fremstilles på tre forskjellige dager, så vel som styrken til den kromatografiske fremgangsmåte i fremstilling av reproduserbare resultater. En økning i kjemisk støy er observert for den negative modus for ionisering fettsyrefraksjon. Dette kan oppstå på grunn av forurensninger i LC-MS løsemidler og kan føre til inkonsistente kvantitative metabolomic resultater. Derfor bare metabolitter som eluted før 9 min ble analysert.

Når du kjører lange arbeidslister, kan et tap av instrument følsomhet og endring i buffer konsentrasjoner oppstår over tid resulterer i redusert signalintensitet og oppbevaring time shift. Hvis oppholdstiden overlapping variasjonen er mindre enn 5%, og signalintensitetsvariasjon er mindre enn 10%, er dataene likevel innenfor standard laboratorie grenser. Analysis programvare kan brukes til å justere og normaliserer data for å korrigere for instrumentet og retensjonstid drift. Men hvis variasjonen er LARge, og årsaken er ikke bestemt. Når dette er rettet, kan prøvene gjen analyseres.

Figur 1. Utbredelsen av lipid ISTDs (A) og endogene metabolitter (B) etter ekstraksjon og reversert-fasekromatografi (RPC) ^12. Ekstraksjon ble utført med resulterende prøvene ble separert ved hjelp av RPC og analysert ved hjelp av LC-MS i positiv og negativ ionisering modus. Dette tallet har blitt forandret fra Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figur 2. En sammenligning av MTBE-SPE fraksjonene ^12. Metabolittene ble identifisert i hvert frhandling ble sammenlignet for å identifisere den mengde av overlapping i SPE-delen av prep. Tallene i den Venn diagram reflektere antall metabolitter påvist i hver fraksjon. Her mindre overlapping er observert blant de tre fraksjoner, som representerer vellykket sammensatt utvinning og metabolitt klasse separasjon under SPE trinn. Dette tallet har blitt forandret fra Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figur 3. Utvinningen av ISTDs i fraksjoner ved hjelp av MTBE-SPE-metoden ^12. Ekstraksjon ble utført med resulterende prøvene ble separert ved hjelp av RPC og analysert ved hjelp av LCMS i positiv og negativ modus som beskrevet i teksten. Dette tallet har blitt forandret fra Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013). </ P>

Figur 4. Resultater fra pelleten brøkdel utarbeidet av tre operatører. Tre prøvepreparering torer A, B og C utføres på samme protein preparatet trinn på sammenslåtte plasmaprøver. Tallene i Venn-diagrammet gjenspeiler antall metabolitter oppdaget av den enkelte operatør. Operatorer B og C pipetteres den ønskede volum pr prøvepreparering protokollen mens operatøren A pipettert hele supernatant og noen av kulene, noe som resulterer i mer enn 500 mer metabolitter, de fleste blir falske positive for den spesifikke fraksjonen.

Figur 5. Dannelse av protein pellet under protein utfellingstrinn <. / Strong> (A) 100 pl human plasma før prøve preparat, (B) plasma etter tilsetning av is-kald metanol, (C) protein pellet dannet på bunnen av røret etter sentrifugering ved 0 ° C i 15 min ved 18 000 x g.

Figur 6. Separering av de hydrofile og hydrofobe lag ved væske-væske ekstraksjon (LLE) trinn. Det organiske løsningsmiddel metyl-tert-butyleter (MTBE), og vann ble anvendt for å separere de hydrofile og hydrofobe metabolitter. Den MTBE lag er oppløst ikke-polare forbindelser og vannlaget er oppløst polare forbindelser (A) plasma supernatanten etter proteinfjerning,. (B) plasma etter tørking under nitrogen, (c) plasma etter tilsetning av MTBE; ong> (D) tilsetning av vann til plasma og MTBE, (E) MTBE-vannlaget dannes etter sentrifugering, (f) fjerning av topp MTBE slag, (G) i hovedsak hydrofile sjikt blir igjen etter fjerning av MTBE.

Figur 7. Kromatogrammer av fraksjoner fra en valgt datasett. Prøvepreparering ble utført på tre separate oppsamlet plasma QC prøver og hver prøve ble injisert i tre eksemplarer på LC-MS instrument. Representert er totalt ion chromatograms av plasmaprøvene anskaffet ved hjelp av LC-MS parametre angitt i § 7 av metoden protokollen. Den kromatografisk representasjon av andre biologiske væsker vil variere på grunn av forskjeller i metabolitt sammensetning.k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fraksjon	Ionisering Mode	Intern Standard	n	Gjennomsnittlig Peak-området	Peak-området% CV
Vandig	Positiv	Kreatinin-D 3	31	2217311	3,8%
Nøytral lipid	Positiv	Triglyserid-D 5	31	4837032	9,9%
	C17 Ceramide	31	12736707	7,9%
Fosfolipid	Positiv	15:00 PC	32	1248929	9,3%
		17:00 PE	32	517234	7,9%

Kvalitetskontrollen Tabell 1. Resultater fra piggete interne standarder. Samlede plasmaprøver fra en emfysem mus modell datasett ble analysert for å overvåke instrumentforhold på en daglig basis for denne multi-ukers studie. Kvantitativ analyseprogramvare ble benyttet for å bestemme topparealene til de indre standard, (n = antall instrument QC injeksjoner).

Fraksjon	Ionisering Mode	Endogene metabolitter	Gjennomsnittlig Peak-området	Peak-området% CV
Vandig	Positiv	Kreatinin	2554574	2,3%
		Valin	3712151	3,3%
		Glukose	2669190	6,9%
Nøytral lipid	Positiv	3-Dehydrosphinganine	226644	3,9%
		11301	8,2%
		DG (P-14: 0/18: 1)	364119	1,9%
Fosfolipid	Positiv	PC (24:0 / 00:00)	27599	0,9%
		PC16: 0/22: 6)	2873326	4,5%
		PI (16:00 / 18:01)	112998	4,4%
Fettsyre	Positiv	10-okso-5 ,8-decadienoic syre	1363284	2,3%
		16-okso-heptadecansyre	83700
		2-metyl-valeriansyre	285782	5,7%
Fettsyre	Negativ	10-hydroxy-8-oktadekensyre	10042	4,9%
		(R)-laballenic syre	173929	6,5%
		2-keto-valeriansyre	35488	6,0%

Kvalitetskontrollen Tabell 2. Resultater fra endogene metabolitter. Sammenslått plasmaprøver fra en human sykdom datasett ble analysert for å overvåke prøvepreparering reproduserbarhet på forskjellige dager. Prøvene ble utarbeidet i tre eksemplarer over tre dager, (n = 9 prep QC injeksjoner).

Discussion

Et av målene for kliniske metabolomic studier er å identifisere endringer i metabolome relatert til sykdom eller behandling. Derfor prøveopparbeidelse teknikker må være robust, konsekvent, og overføres fra tekniker til tekniker og fra laboratorium til laboratorium ^22. Den resulterende data må være representativt for prøven, og identifiserte endringer må reflektere prøven satt i stedet for prøvepreparering feil. Derfor er nøyaktig pipettering, riktig temperatur, effektiv dekantering av ikke-blandbare lag, tørking under nitrogen, og bruk av de samme merker og størrelser av glass og tips er nødvendig.

Under protein utfellingstrinnet, er det avgjørende at den samme mengde oppløsning dekanteres fra hver pellet. Dette minsker variasjoner i volum og som sådan reduserer variasjonen i prøvedataene. Dette proteinet utfellingstrinnet er nødvendig for metabolomic undersøkelser, og kan ikke bli hoppet over, siden det fjerner protein fromprøvene før lite molekyl profileringsanalyse på massespektrometer. Det eliminerer patogener og store makromolekyler, og frigjør bundet metabolitter fra proteiner ^7. HPLC-kolonnen levetid Mangel på protein akkumulering i prøvene ekspanderer og øker nøyaktigheten og kvaliteten av resultatene. Figur 5 er en avbildning av proteinet pellet dannet ved å utføre denne teknikk på plasmaprøver. Dette tillater deteksjonen av små molekyler, forbedrer ion overflod, og reduserer matrix effekter fra proteiner i prøven. I tillegg, siden det antas at alle proteiner som blir fjernet i dette trinnet, vil aminosyrene som detekteres i løpet av LC-MS-analyse opprinnelse fra metabolske forandringer i stedet for fra protein sammenbrudd.

Den væske-væske-ekstraksjon trinn er kritisk siden den skiller de hydrofile og hydrofobe metabolitter i to ikke-blandbare lag. Figur 6 viser LLE fremgangsmåte og et representation av LLE lag. Feilaktig separasjon av de to lagene resulterer i metabolitter enten går tapt eller blir eluerte i begge fraksjoner. Nøye anvendelsen av dette trinn reduserer antall av hydrofile forbindelser som forekommer i den hydrofobe fraksjonen. Resultatene for disse forbindelser blir upålitelige siden det ikke kan fastslås hvilken fraksjon inneholder de representative resultater. Når det gjøres riktig, er metabolitten overlapping reduseres.

For å forhindre oksydativ nedbrytning, spesielt i lipider, men også i små molekyler som kan inneholde tiolgrupper for eksempel, har eksponering for oksygen skal holdes på et minimum. Derfor er denne fremgangsmåte alltid utført under nitrogen for å redusere / forhindre oksydasjon av lipid-eller tiol-inneholdende forbindelser. Dessuten er overføringen av prøven og / eller oppløsningen hurtig (i løpet av det første minuttet) for å redusere oksygeneksponeringen, og prøvene blir raskt satt under en jevn strøm av nitrogen for å tørke ned. Når tørket, er de umiddeldelbart resuspendert i 100% metanol for de ovenfor diskuterte årsaker.

Laboratories kan dra nytte av denne fremgangsmåte omfattende i en rekke måter; Forskere som ønsker å isolere en klasse av forbindelser som kan velge den del av den metode som best passer deres behov. De som søker å bare utføre et protein ventet å oppnå en pool av metabolitter kan gjøre det. Dersom hydrofile metabolitter er ønsket, slik som mange farmasøytiske stoffer, aminosyrer og sukker, eller hvis bare hydrofobe metabolitter er ønsket, slik som triglyserider, epoksyder, fettløselige vitaminer, og fosfolipider for eksempel, så forskere kan utføre væske-væske ekstraksjon trinn etter protein nedbør og forkaste uønsket fraksjon. Etterforskerne som krever ytterligere sub-klassifisering av hydrofobe forbindelser (nøytrale lipider, fettsyrer og fosfolipider) kan gå videre til fraksjone trinn.

Lagring hensyn er viktig i maintaining levedyktigheten av prøver for senere analyse. Hvis prøvene er lagret på feil måte, kan nedbrytning eller spaltning inntreffer. Ideelt sett bør prøvene lagres i skrulokk rav ampuller fra lys for å forhindre nedbrytning av lys sensitive arter. Prøvene bør også holdes frosset ved -80 ° C for å hindre nedbrytning metabolitt ^23-25. Selv om det ikke diskutert i detalj her, er eksempler alltid holdt ved 4 ° C i autosampler skuffen under LC-MS-analyse. Dette sikrer at alle prøvene blir holdt ved en konstant temperatur, og at endringer i omgivelsestemperaturen ikke påvirker viskositet, løselighet eller stabilitet av prøvene. Det anbefales at de manuelle aspekter ved denne prosedyren, for eksempel LLE og SPE, skal praktiseres for å få tillit og komfort med trinnene involvert.

Noen begrensninger finnes for denne teknikken. Diskret separasjon av de hydrofobe og hydrofile metabolitter er ikke garantert som visse forbindelser vil inherently fordeles i begge fraksjoner på grunn av deres kjemiske sammensetning og ladetilstand. I tillegg, som vist i figur 4, feilaktig teknikk under protein pellet ekstraksjonstrinnet kan føre til dårlig reproduserbarhet metabolitt i begge prøvene og kvalitetskontroller. Dette påvirker statistikken, spesielt i små datasett fordi statistisk styrke er ikke tilgjengelig. Derfor er det viktig at dette trinnet kan utføres nøyaktig den samme hver gang for hver prøve. En annen begrensning er tid. Selv om det er stopp poeng gjennom denne protokollen, hvor prøvene kan fryses og prep fortsatte neste dag, bør en hel dag settes til side for å utføre denne prosedyren. For det tredje, ikke hver forbindelse i en biologisk prøve kan evalueres for ion-undertrykkelse. Siden det ikke er mulig å identifisere hvor matriksen påvirker hver enkelt metabolitt, er nåværende valg å evaluere de interne standarder som teoretisk etterligner noen klasser av endogenous metabolitter. Til slutt, kan absolutte identifikasjoner ikke utføres utelukkende med denne metoden. Tandem MS i samarbeid med søk i databaser og standarder er nødvendig for absolutt metabolitten identifikasjon.

En viktig del av metabolomikk er identifisering av forbindelser. Selv om det ikke er nærmere omtalt her, ble kvalitetskontroll prøvene analysert ved hjelp av LC-MS. Flere prøveopparbeidelse blanks og instrument blanks ble klargjort for bruk som bakgrunn subtraksjon å redusere frekvensen av falske positiver fra forurensninger, og dermed resulterer i mer pålitelige metabolitt treff. Etter dette trinnet, ble antall "molekylære funksjoner" gruppert sammen basert på m / z, oppholdstid, isotop-forhold, og addukter å produsere en liste over aktuelle forbindelser. Selv om en liste over forbindelser som er sterkt redusert, var resultatene mer pålitelig som de ikke var basert på flere addukter fra den samme forbindelse. Den fullstendige metoden er omfattende og gir isolasjon kon av hydrofobe metabolitter som nøytrale lipider, fosfolipider, fettsyrer, triglyserider og steroider, og samtidig isolere hydrofile klasser i den vandige fraksjon, hvorav eikosanoider, sukkere, flavonoider og aminosyrer er blitt identifisert ^{12, 26..}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
Methanol	Fisher Scientific	L-6815
Chloroform	Fisher Scientific	C606-1
Hexane	Sigma Aldrich	34859
Acetic acid	Sigma Aldrich	49199-50ML-F
Methyl tert-butyl ether	J.T. Baker	9042-03
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	34965-2.5L
Water	Honeywell Burdick Jackson	365-4
OA-SYS heating system	Organomation Associates, Inc		Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35 °C
12-position vacuum manifold	Phenomenex
Strata NH2 (55 µM, 70Å) 100 mg/ml SPE cartridges	Phenomenex	8B-S009-EAK
Glass pipette tips	Fisher Scientific	13-678-20C	Used to transfer sample to SPE column
Plastic pipette tips	USA Scientific	1182-1830	Used when glass tips are not necessary
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
Graduated glass pipets	Fisher Scientific	13-678-27B	Used to transfer organic solvents during sample prep
Pyrex glass culture tubes	Corning Incorporated	99499-16X	Used to store aqueous and lipid fractions until the next step
Autosampler vials	Agilent Technologies	5182-0545
Snap cap vials for autosampler vials	Agilent Technologies	5182-0541
Glass inserts	Agilent Technologies	5183-2085	Used for small sample volumes
Mass Hunter Qualitative Analysis software	Agilent Technologies	Version B.06.00	Used to monitor retention times and pressure curves
Mass Hunter Quantitative Analysis software	Agilent Technologies	Version B.05.02	Used to analyze quality control and sample data
Mass Profiler Professional software	Agilent Technologies	Version B.12.50	Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification