Summary
肝転移の前臨床マウスモデルは、半脾臓注入技術を介して行う。
Abstract
多数のマウスモデルは、ヒト癌を研究し、癌治療及び開発の理解を進めるために開発されてきた。ここで、同系マウスの膵臓腫瘍細胞の半脾臓注射を介して、肝転移の前臨床マウス膵臓腫瘍モデルについて説明する。このモデルは、肝臓への転移性疾患を有する患者における臨床症状の多くを模倣。マウスは、一貫して転移過程、実験的治療試験、および腫瘍免疫学研究の調査を可能に肝臓への転移を開発しています。
Introduction
膵管腺癌（PDA）は、米国1における癌関連死の第四の主要な原因である。転移性PDAと患者のための5年生存率2-12％1です。膵臓癌のアジュバントおよびネオアジュバント化学療法はこれまで以上に、今日より効果的であるが、まだ新しい治療法のための絶望的な必要性が残っている。
新規治療薬の開発は、信頼性の前臨床動物モデルを必要とする。皮下腫瘍モデルを使用して簡単ですが、その欠点は、ヒトの癌で見られる腫瘍の進行および微小環境を転移し、模倣するこれらの腫瘍のできないことがあります。そのようなKrasのとp53ノックイン発癌性変異（KPCモデル）2とYFP系統トレーサー（PKCYモデル）とKPCモデルを含む遺伝子操作されたマウスなどの遺伝子操作されたモデルは、3 immunocompeteにおける自然発生腫瘍の研究を可能にntのマウス。加えて、腫瘍微小環境は変更され、より厳密にヒト腫瘍進行に見られるものに似ている。残念ながら、腫瘍発生のタイミングが困難実験的治療を研究することができ、これらのモデル内の変数である。さらに、これらのマウスの戻し交配は、常に実行可能ではない時間と財務コミットメントのかなりの量を必要とする。最後に、注入された異種移植のPDAマウスモデルは変更した免疫不全マウス、または存在しない腫瘍微小環境を必要とする。その結果、これらの前臨床モデルにおいて実証実験的治療の有効性は、多くの場合、ヒト臨床試験4において再現性がない。
このhemisplenectomyマウスモデルは、C57BL / 6マウス5、6から誘導される高度に腫瘍形成、メチルコラントレン誘発性膵臓腫瘍細胞株であるPanc02腫瘍細胞を利用する。さらに、他のネズミPDA細胞株は、KPCマイクから誘導eは、このモデルで使用することができる。 Schulick らは以前にhemisplenectomy技術を開発し、大腸癌転移7の同系マウスモデルを作成しました。このhemisplenectomyモデル（ 図1）は、新規の治療薬7-10の研究に自分自身を貸す免疫応答性マウスにおいて、一貫して同じ腫瘍接種を提供しています。
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Protocol
全ての動物実験は、ジョンズ·ホプキンス大学の動物実験委員会のガイドラインに適合し、動物を研究室のケアの評価と認定協会（AAALAC）のガイドラインに従って維持した。外科的処置は、毎時15空気交換の最小値を受け、手術室で、無菌条件下で行われる。すべての商品は、手順の間に、各マウスの間に70％エタノールで前の手順で、もう一度オートクレーブで滅菌されています。外科手術を生き残るために期待されていない全てのマウスは、麻酔下で、依然としてながら頸椎脱臼に続いて3分間、CO 2の下で安楽死させる。
1。細胞調製
- 2×10 7細胞/ mlで、リン酸緩衝生理食塩水で培養されたPanc02細胞を再懸濁し、そして氷上に保つ。
2マウスの準備
- ケタミンの管理腹腔内分割用量で8〜12週齢のC57BL / 6雌マウスへの電子（100mg / kgの）キシラジン（10mg / kg）を混合した。
- つま先ピンチ引っ込め反射がマウスが完全に麻酔をかけていることを確実にするために廃止されていることを確認してください。
- 完全にマウスを麻酔するために、必要に応じて（100mg / kgの）キシラジン（10mg / kgの）と混合ケタミンの追加の用量を投与する。
- マウスは麻酔下にある間、乾燥を防ぐために、マウスの眼にPuralube獣医軟膏を適用します。
- 創傷の汚染を回避するために、マウスの手術領域を剃る。
- 準備は、ヨウ素を70％エタノールで切開の肋骨下の領域を離れ、。
- 無菌性を維持するために腹部に外科用ドレープを配置します。
3開腹
- 経皮、メスを用いて腹膜を介して左耳に沿って、左肋骨下の切開を加えます。
- 同時デジタルPを適用することにより、切開部を通して脾臓エクスプレス切開の頭蓋および尾側の側面に沿って案内圧力スイッチ。
- 脾臓の下端で脾臓の血管の位置を確認します。
- 脾臓の極での脾臓の血管を損傷しないように注意しながら、脾臓の中心部に2ホライゾン中型結紮クリップを配置することによって、脾臓を割ります。
- 汚染を避けるために戻って腹膜に脾臓の上極を配置します。
4。腫瘍注射
- 26 Gのx 5/8 "注射器の中にリン酸緩衝生理食塩水を150μlを描画します。
- 注入時に常に直立位置に注射器を維持し、同じ注射器にPanc02100μlの（2×10 6）細胞を描画します。
- 70％エタノール溶液中に針を浸し。針は、無菌性を確保するために70％エタノールに浸漬する。
- 注射器が常に直立させていることを確認されて露出した半脾臓にゆっくりと細胞を注入する。 syrinのベベルGEは脾臓で細胞を注入することを避けるために、脾臓カプセルを通じて常に観察されるべきである。脾臓や血管のホワイトニングは、注入時に観察されるべきである。
- 脾臓を昇格し、脾臓の血管を閉塞するために、脾臓で1メディアホライゾンクリップを適用します。
- 膵臓と脾臓血管の最も遠位の側面に小さなホライゾンクリップを適用します。
- ホライゾン·クリップの上にカットして半脾臓から膵臓と脾臓血管を連結する。
- その '側にマウスを置き、蒸留水で切開を灌漑。
麻酔から5。腹部閉鎖およびリカバリ
- 4-0ランニングステッチで腹膜を閉じます。
- 皮膚切開を閉じるために二から三の皮膚クリップを適用します。
- 手術後の痛みを緩和するためには0.1mg / kgのブプレノルフィンまたは5〜10ミリグラム/ kgのカルプロフェンを皮下投与する。
- RECのための加熱パッド上でマウスを置きますオーヴェリーモバイルまで、とマウスは、通常の呼吸パターンを示しています。動物は、唯一の完全外科的手順から回復した後、他の動物の会社に戻ります。
6。剖検審査及び肝臓の収穫
- 手術後30〜60日の間、マウスは転移の臨床症状を示すように開始され、安楽死が必要になります。人道的な安楽死を必要とする転移性疾患の徴候は拡大された腹部および腹水の開発が含まれています。 CO 2の吸入によりマウスを安楽死させる。
- 吸入後、頸椎脱臼を行います。
- 動物は非反応性であることが決定された後、ハサミを使用して腹部を露出させるために腹膜を通って切開する。
- 鉗子やハサミを使用して、静かに腹部から肝臓を切った。
- OCT化合物中の肝臓および液体窒素を用いたフラッシュ凍結を配置します。 -80℃で肝臓に保管してください。代わりに、ライブrは、埋め込まれた24時間およびパラフィンをRTで16％中性緩衝ホルマリンで固定することができる。
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Representative Results
半脾臓に注入Panc02腫瘍細胞技術が正しく行われた場合、肺および腹膜転移が観察されない一方（ 図1）マウスの100％においてフォームの肝臓転移、。この技術は、複数の独立した実験においてPanc02細胞を使用して100以上のマウスに対して行われており、再現性、すべての未処置のマウスはhemisplenectomy手順（ 図2）以下の30と60日の間の肝転移で死亡する。未処理および処理群の間の統計的有意性を得るためには、グループ当たり10匹のマウスが必要とされている。しかし、この数は、使用される細胞株および治療方式に関して変化するであろう。 Panc02細胞は、このモデルで使用される場合、複数の肝転移は剖検（ 図3）上に観察することができる。
組織特異的Krasのおよびp53有するトランスジェニックマウス由来の同系膵臓腫瘍細胞株であるKPC腫瘍細胞、ノックイン変異は図11に示すように、このモデルで使用することができる。類似した肝転移におけるこれらの細胞の結果を使用して（ 図4）。異なる細胞株を用いて、肝転移の形成を評価する際に、すべての未処置のマウスは肝臓転移を発症するまでは、注入された細胞の数は、滴定されるべきである。 Panc02細胞は、外科手術が正しく行われたことを確認するための陽性対照として使用することができる。重要なことに、肝転移および生存の形成の程度は、一つの実験内で、使用される細胞株に依存して変化し得るすべての未処置マウスは、同様の負担で肝転移を発症し、短時間で再現性よく、これらの転移によって死亡している。この技術を用いしたがって、超音波による腫瘍負荷の正規化は必要ではない。
手順が正しく行われなかったことを示している可能性があり、剖検時に正常に見える肝臓に肝転移の結果を誘導しないと。しかし、失敗したまたはd転移のelayed形成は、生存期間の延長で、その結果、抑制または転移性の成長を阻害する治療法（ 図5）で処理した後することがあります。したがって、このモデルは、腫瘍増殖および転移の形成に対する各種の治療剤の効果を評価するために使用することができる。
それが超音波によって肝臓を評価することが技術的に可能であるため、小動物の超音波（ 図6） 図12は、肝臓における転移のインビボ形成を評価するために使用することができる。さらに、転移の形成は、さらに剖検（ 図7）以下の組織病 理学によって調べることができる。
使用されているhemisplenectomyモデルの図1図、Panc02腫瘍細胞と膵臓肝転移を作成します。
図0日目にPanc02のhemisplenectomyを受けた後のC57BL / 6マウスの2の代表的な生存は、カプラン·マイヤー曲線に示す（n = 10）にし 、 このモデルにおいてPanc02腫瘍細胞を注射したマウスはすべて、以下の30〜60日の間に死ぬ手続き抗腫瘍性治療薬が投与されていない場合。
半脾臓にPanc02細胞の注射後の肝臓の図3。肉眼検査では肝転移を明らかにし（インディカ矢印でTED）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
半脾臓にKPC腫瘍細胞の半脾臓注射後の肝臓の図4。肉眼検査では正常肝実質（白い矢印）を交換し、肝転移（黒矢印）を明らかにしている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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効果的な治療介入後の肝臓の図5。肉眼検査。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6 hemisplenectomy手続き後の肝臓（黒矢印）の大きい転移病巣を持つマウスのVEVO 660小動物超音波を用いて肝超音波検査。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図7 hemisplenectomyモデルにおけるPanc02細胞によって形成されたパラフィン包埋肝転移のH＆E染色。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
半脾臓注入技術を経由して肝臓への膵臓癌転移のこの前臨床マウスモデルでは、肝臓への転移性疾患を有する患者の臨床的および免疫学的条件の多くを反映して説明した最初のモデルである。このモデルは、他のマウスモデルに比べていくつかの利点を提供しています。まず、膵臓癌のトランスジェニックモデルとは異なり、マウスのわずか30％が肝臓に転移を発症したおよび転移形成のタイミングは非常に可変であり、このモデルはαで100％のマウスにおいて一貫して肝臓に転移し得るという利点を提供均一な時間は、この設定に転移性疾患を研究するために研究者を可能にする。さらに、このモデルでは、再現可能なモデルでは、末梢血免疫分析を可能にする素朴な半脾臓を保持します。さらに、抗新生物療法の非存在下で、マウスは、最初の腫瘍負荷に応じて一貫性のある時点で腫瘍の進行により死亡し、生存率が一貫している一つの実験から次へ。最後に、このモデルは、肝転移13、腫瘍免疫学10、及び実験的治療試験9の研究などのさまざまなアプリケーションを有している。
この技術の重要なステップは、細胞懸濁液の調製、腫瘍細胞注射、ホライゾンクリップの配置、および皮膚クリップの配置である。手術の成功を確実にし、結果の潜在的なスキューを回避するために、重要なステップの以下の修正が必要となることがある。まず、細胞懸濁液の調製の間に、それが細胞の単一懸濁液が得られ、半脾臓に注入することが必須である。腫瘍細胞のマイナー凝集は、脾臓血管を閉塞し、手術中に早死になります。これはdeclumping剤中に細胞を再懸濁することにより、すぐに注射前に注射のための各シリンジを調製することによって回避することができる。さらに、調製時シリンジは、その細胞は、リン酸緩衝生理食塩水洗浄と混合しないことが肝要である。これは、最初のリン酸緩衝生理食塩水を汲み上げ、その後非常にゆっくり常に直立位置に注射器を維持し、混合を避けるために、細胞を策定することによって達成することができる。第二に、腫瘍細胞注射工程中に、注射器のベベルは脾臓で細胞を注入避けるために脾臓カプセルを通して常に観察されるべきである。脾臓および血管のホワイトニングは、腫瘍細胞が正常脾臓内に注入されたことを示す、注入の際に観察されるべきである。小さな脾臓を持つ若いマウスでは、脾臓から漏洩する危険性よりもフラッシュセルの小さな体積を注入する必要があるかもしれない。いずれの漏れが疑われる場合、彼らの側にマウスを置くと、射出工程中に漏洩した可能性のある細胞を除去するのを助けるためにマウスを縫合する前に蒸留水で脾臓を洗う。これらの細胞を除去しないとなります前に十分な転移を達成する死を引き起こす可能性が注射部位での腫瘍増殖。第三に、半脾臓の下ホライゾンクリップの配置は、半脾臓を除去した後の出血がないことを保証するために重要である。追加のホライゾンクリップは、必要に応じて血管を閉塞するために使用することができる。この技術の最後の重要なステップは、皮膚のクリップの配置である。マウスは生存のために次のされている場合、それはむしろ皮膚クリップを用いても、マウスの皮膚を縫合する必要があるかもしれない。時折、皮膚クリップが感染しやすいマウスをレンダリングすることができ皮膚創傷の完全な治癒、の前に脱落します。腹膜とは別の皮膚の縫合は、この問題を防ぐことができます。
この技術は、転移過程と転移性疾患を研究するための非常に貴重ですが、このモデルは、いくつかの制限があります。まず、このモデルの再現可能な性質は、それがトランスジェニックおよびorthotopi好ませる転移過程と転移部位での腫瘍微小環境を研究するためのRCモデル。しかし、モデルの性質上、転移過程、血管外遊出およびコロニー形成の唯一の最後のステップは、研究することができる。これは完全な転移過程を研究するため、このモデルの有用性を制限し、腫瘍細胞の血管内を刺激信号に調査を許可していません。第二に、それは半脾臓の半分を保持することによってこれらのマウスにおいて完全な免疫機能を保持することが重要であるが、肝臓でのリンパ球の分析は、正常な肝臓由来のリンパ球と同様にバイアスされた表現をもたらす可能性があり、腫瘍微小環境からのリンパ球の両方を含む腫瘍微小環境内の真の免疫状態の。肝臓へのより広範な転移をもたらす、より攻撃的な腫瘍細胞株の使用は、モデルのこの制限を克服できた。転移は剖検時に可視化する場合に加えて、それはpossiblであってもよい正常な肝臓からの転移を分析し、さらに、この問題を回避する転移で見られる唯一のリンパ球を分析するための電子メール。このモデルはいくつかの欠点を有している要約すると、それはまた、他のモデルに比べて多くの利点を提供していますので、肝臓に転移性疾患を研究する際にこれらのモデルを補完する使用する必要があります。
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Disclosures
著者らは、開示することは利害の関係する競合はありません。
Acknowledgments
KFとKOはKSと一緒に共同最初の著者である
この作品は、ジョンズホプキンス医学部臨床科学者賞（LZ）、Viragh財団とジョンズ·ホプキンス大学をスキップViragh膵臓がんセンターは（EMJ、NIH K23 CA148964-01（LZ）、AHPBAフェローシップ（KS）によって部分的にサポートされていましたし、 LZ）、国立膵臓財団（LZ）、Lefkofskyファミリー財団（LZ）、胃腸癌のP50のCA062924（EMJ、LZ）、ラストガーテン財団（LZ）、およびソルゴールドマン膵臓がんセンター助成金のNCI SPORE（KS 、BHE、LZ）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco by Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| Curved Operating Scissor | Roboz Surgical Store | RS-6835 | |
| Micro Dissecting Graefe Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5130 | |
| Needle holder (regular) | World Precision Instruments, Inc | ||
| 3-0 or 4-0 suture | courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins | ||
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled | Teleflex | 237115 | |
| Weck Horizon medium ligating clips | Teleflex | 002200 | |
| Weck Horizon small ligating clips | Teleflex | 001200 | |
| Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip | Becton Dickinson | 309625 | |
| Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm Autoclip Applier | Mikron | 427630 | |
| 9 mm Autoclip | Becton Dickinson | 427631 | |
| Heating pad | Sunbeam | CAT93 | |
| 70% Ethanol | sold by numerous vendors | ||
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | 22395DD | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
- Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
- Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
- Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
- Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
- Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
- Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
- Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390 (2011).
