Summary
En preklinisk, murine modell av levermetastaser utføres via en hemispleen injeksjonsteknikk.
Abstract
Mange murine modeller har blitt utviklet for å studere menneskelige kreftformer og fremme forståelsen av kreftbehandling og utvikling. Her blir en preklinisk, murine bukspyttkjerteltumormodell av levermetastaser via en hemispleen injeksjon av syngene murine bukspyttkjerteltumorceller er beskrevet. Denne modellen etterligner mange av de kliniske tilstander hos pasienter med metastatisk sykdom til leveren. Mus konsekvent utvikle metastaser i leveren slik at for undersøkelse av den metastatiske prosess, eksperimentell terapi testing, og tumor immunologi forskning.
Introduction
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA) er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i USA en. De fem års overlevelse for pasienter med metastatisk PDA er 2-12% 1. Selv om adjuvant og neoadjuvant kjemoterapi for kreft i bukspyttkjertelen er mer effektiv i dag enn noensinne, det er fremdeles et desperat behov for nye behandlingsformer.
Utviklingen av romanen therapeutics nødvendig pålitelige prekliniske dyremodeller. Selv subkutane tumormodeller er lette å bruke, ulemper omfatte manglende evne av disse svulstene å metastasere og etterligne tumorprogresjon og microenvironments sett i humane kreftformer. Genmanipulerte modeller, som for eksempel genmodifisert mus som inneholder Kras og p53 knock-in onkogene mutasjoner (den KPC-modellen) 2 og KPC modell med en YFP avstamning tracer (den PKCY modell) 3 tillate for studiet av naturlig forekommende svulster i immunocompetent mus. I tillegg, er mikromiljøet tumor uforandret og mer ligner det som sees i human tumorprogresjon. Dessverre er tidspunktet for svulst utvikling variabel i disse modellene, som gjør det vanskelig å studere eksperimentelle behandlingsformer. I tillegg tilbakekryssing av disse musene krever en betydelig mengde tid og finansiell forpliktelse, som ikke alltid er mulig. Til slutt, nødvendig implantert xenograft PDA musemodeller immunsupprimerte mus, som har endret eller fraværende tumor microenvironments. Som et resultat av effekten av eksperimentelle behandlinger demonstrert i disse prekliniske modeller er ofte ikke reproduserbare i humane kliniske forsøk med 4.
Dette hemisplenectomy musemodell benytter Panc02 tumorceller, som er en svært tumorigent, methylcholanthrene indusert bukspyttkjertelen svulst cellelinje avledet fra C57BL / 6 mus fem, seks. Dessuten kan andre murine PDA-cellelinjer avledet fra KPC mice kan brukes i denne modellen. Schulick et al. Tidligere har utviklet en hemisplenectomy teknikk og skapt en syngene musemodell for tykktarmskreft metastaser 7. Dette hemisplenectomy modell (figur 1) har konsekvent og lik svulst vaksinasjon hos immunkompetente mus utlån seg til etterforskningen av nye terapeutiske midler 7-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk dannet retningslinjene for Animal Care og bruk komité ved Johns Hopkins University, og dyrene ble vedlikeholdt i samsvar med retningslinjene fra Foreningen for Assessment and Accreditation of Laboratory Care (AAALAC). Den kirurgiske prosedyre blir utført under sterile betingelser i en operasjonsstue som undergår et minimum av femten luftvekslinger pr time. Alle instrumenter som er sterilisert ved autoklavering før prosedyren, og igjen med 70% etanol i mellom hver mus i løpet av prosedyren. Alle musene ikke forventes å overleve den kirurgiske prosedyren avlives under CO-2 i 3 min, etterfulgt av cervical dislokasjon, mens fremdeles er under anestesi.
1. Cell Forberedelse
- Resuspender Panc02 dyrkede celler i fosfat-bufret saltoppløsning ved 2 x 10 7 celler / ml, og holde på is.
2. Mouse Forberedelse
- Administrere Ketamine (100 mg / kg) blandes med xylazin (10 mg / kg) intraperitonealt til 8-12 uker gamle C57BL / 6 hunnmus i oppdelte doser.
- Sjekk for å se at tå klype tilbaketrekking refleks er avskaffet for å sikre at musen er fullt bedøvet.
- Administrer doser av ketamin (100 mg / kg) blandes med xylazin (10 mg / kg) som er nødvendig for å full bedøve musene.
- Påfør Puralube Vet salve til øynene av mus for å hindre uttørking mens musene er under anestesi.
- Barber det kirurgiske område av musene for å unngå forurensning av såret.
- Prep venstre subcostal området av snittet med 70% etanol, og deretter jod.
- Plasser en kirurgisk drapere rundt magen for å opprettholde sterilitet.
3. Laparotomi
- Ta av til venstre subcostal snitt i tråd med det venstre øret gjennom huden og gjennom bukhinnen ved hjelp av en skalpell.
- Uttrykke milten gjennom snittet ved å påføre samtidig digital prykk langs kranie og caudal aspekter av snittet.
- Lokaliser miltblodårer ved nedre ende av milten.
- Dele milten ved å plassere to Horizon mellomstore ligere klipp i sentrum av milten være forsiktig for å unngå å skade spleniske blodkar på spleniske polene.
- Plasser den øvre pol av milten tilbake inn i peritoneum til å unngå forurensning.
4. Tumor Injection
- Tegn opp 150 ul fosfatbufret saltløsning til en 26 G x 5/8 "sprøyte.
- Tegn opp 100 ul Panc02 (2 x10 6-celler) i den samme sprøyten opprett sprøyten i oppreist stilling til enhver tid under injeksjonen.
- Dypp kanylen i en 70% etanolløsning. Nålen er dyppet i 70% etanol for å sikre sterilitet.
- Injiser cellene sakte inn i den eksponerte hemispleen å være sikker på at sprøyten er oppreist holdes til enhver tid. Vinkel av Syringe bør følges til enhver tid gjennom milt kapselen for å unngå å injisere cellene i henhold til milten. En bleking av milten og blodårer bør observeres ved injeksjon.
- Heve milten og bruke ett medium Horizon klippet under milt å occlude spleniske blodkar.
- Påfør en liten Horizon klippet til den mest distale del av bukspyttkjertelen og milten fartøy.
- Ligate bukspyttkjertelen og milten fartøyer fra hemispleen ved å kutte over horisonten klipp.
- Plasser musen på sin 'side, og vanne snittet med destillert vann.
5. Abdominal Closure og gjenoppretting fra Anesthesia
- Lukk peritoneum med en 4-0 kjører sting.
- Påfør 02:58 hud klipp for å lukke huden innsnitt.
- Administrer 0,1 mg / kg buprenorfin eller 5-10 mg / kg Karprofen subkutant å lindre post operativ smerte.
- Plasser musen på en varmepute for recovery til mobil og musen demonstrerer vanlige pustemønster. Dyr blir bare tilbake til selskapet av andre dyr etter fullstendig å utvinne fra den kirurgiske prosedyren.
6. Obduksjon Undersøkelse og høsting av leveren
- Mellom 30 til 60 dager etter kirurgi, blir musene begynner å vise de kliniske symptomer på metastase og vil kreve eutanasi. Tegn på metastatisk sykdom som krever human avlivning inkluderer forstørrede abdomens og utvikling av ascites. Avlive mus ved innånding av CO 2.
- Etter innånding, utføre halshugging.
- Etter at dyret har blitt bestemt til å være ikke-responsive, gjør et snitt gjennom bukhinnen å eksponere buken ved hjelp av en saks.
- Bruk pinsett og saks, forsiktig kutte leveren ut av buken.
- Plasser lever i oktober sammensatte, og flash fryse ved hjelp av flytende nitrogen. Oppbevar leveren ved -80 ° C. Alternativt liver kan bli løst i 16% nøytral bufret formalin ved RT i 24 timer og parafin innebygd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Panc02 tumorceller injisert i hemispleen (figur 1) form levermetastaser i 100% av musene, mens lungemetastaser og peritoneale ikke observeres dersom teknikken er utført fullstendig. Denne teknikken er blitt utført på over hundre mus ved hjelp Panc02 celler i flere uavhengige eksperimenter, og reproduserbart, alle ubehandlede mus dør med levermetastaser mellom 30 og 60 dager etter den hemisplenectomy prosedyre (figur 2). For å oppnå statistisk signifikans mellom de ubehandlede og behandlede grupper, er ti mus per gruppe er nødvendig. Imidlertid vil dette antall variere med hensyn til cellelinjen og behandling ordningen brukes. Når Panc02 celler brukes i denne modellen, kan multiple levermetastaser observeres ved nekropsi (figur 3).
KPC tumorceller, som er en syngene bukspyttkjertelen svulst cellelinje avledet fra transgene mus som har vev-spesifikke Kras og p53 knock-inmutasjoner 11, kan også brukes i denne modellen. Ved hjelp av disse celler resulterer i tilsvarende levermetastaser (figur 4). Imidlertid, ved vurdering av levermetastasedannelse ved hjelp av en annen cellelinje, antall celler injisert titreres inntil alle ubehandlede mus utvikler levermetastaser. Panc02 celler kan anvendes som en positiv kontroll for å sikre at operasjonen ble utført fullstendig. Viktigere, mens graden av dannelse av levermetastaser og overlevelse kan variere avhengig av den cellelinje som brukes, i løpet av ett eksperiment, alle ubehandlede mus utvikler levermetastaser hos en tilsvarende belastning og dø av disse metastaser på reproduserbar måte innen en kort tidsperiode. Derfor er normalisering av tumorbelastning ved ultralyd ikke nødvendig når du bruker denne teknikken.
Unnlatelse av å fremkalle levermetastasering resulterer i en normal vises leveren ved obduksjon, noe som kan tyde på at prosedyren ikke ble riktig utført. Imidlertid klarte eller delayed dannelsen av metastaser kan resultere etter behandling med terapier som undertrykker eller inhiberer metastatisk vekst (figur 5), noe som resulterer i en forlenget overlevelse. Derfor kan denne modellen kan brukes til å vurdere virkningene av forskjellige terapeutiske midler for tumorvekst og dannelse av metastaser.
Fordi det er teknisk mulig å evaluere leveren ved ultralyd, et lite dyr ultralyd (figur 6) 12 kan benyttes for å vurdere in vivo-dannelsen av metastaser i leveren. I tillegg kan dannelsen av metastaser undersøkes ytterligere ved histopatologi etter obduksjon (figur 7).
Figur 1. Skjematisk av hemisplenectomy modellen, som er bruktå skape bukspyttkjertelen levermetastaser med Panc02 tumorceller.
Figur 2. Representant overlevelse av C57BL / 6 mus etter under Panc02 hemisplenectomy på dag 0 vises i Kaplan-Meier kurve (n = 10). Mus injisert med Panc02 tumorceller i denne modellen vil alle dø mellom 30 og 60 dager etter prosedyren hvis Antineoplastiske terapi er ikke administreres.
Figur 3. Brutto undersøkelse av leveren etter injeksjon av Panc02 celler inn i hemispleen avslører levermetastaser (indicated med piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Brutto undersøkelse av leveren etter hemispleen injeksjon av KPC tumorceller inn i hemispleen avslører levermetastaser (svarte piler) som erstatter normal leverparenkym (hvit pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
>
Figur 5. Brutto undersøkelse av leveren etter effektiv terapeutisk intervensjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Lever ultralyd bruker en Vevo 660 små dyr ultralyd på en mus med en stor metastatisk lesjon i leveren (svart pil) etter hemisplenectomy prosedyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ig7highres.jpg "src =" / filer / Ftp_upload / 51677 / 51677fig7.jpg "/>
Figur 7. H & E farging av parafin innebygd levermetastaser dannet av Panc02 celler i hemisplenectomy modell. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne preklinisk murin modell av kreft i bukspyttkjertelen metastase til leveren via en hemispleen injeksjonsteknikk er den første modellen beskrevet som speiler mange av de kliniske og immunologiske tilstander av pasienter med metastatisk sykdom til leveren. Denne modellen har flere fordeler fremfor andre murine modeller. Først, i motsetning til transgene modeller av kreft i bukspyttkjertelen, hvor bare 30% av musene utvikler metastaser til leveren og timingen av metastaser formasjonen er ganske variabel, tilbyr denne modellen fordelen av konsekvent å skaffe metastaser til leveren i 100% av mus i en uniform tid, slik at forskerne studere metastatisk sykdom i denne innstillingen. I tillegg beholder denne modellen en naiv hemispleen å tillate perifert blod immunanalyse i en reproduserbar modell. Videre, i fravær av anti-neoplastiske terapier, mus dør av tumorprogresjon i en jevn tidspunkt avhengig av den opprinnelige tumorbelastning, og overlevelse er konsistentfra ett forsøk til det neste. Endelig har denne modellen en rekke applikasjoner, inkludert studiet av levermetastaser 13, tumorimmunologi 10, og eksperimentell terapi testing ni.
De kritiske trinn av denne teknikken er cellesuspensjonen preparatet, tumorcelle-injeksjon, plassering av horisonten klemmene, og plassering av huden klemmene. For å sikre en vellykket operasjon, og at eventuelle forskyvning av resultatene, kan de følgende modifikasjoner av de kritiske trinn være nødvendig. Først, i løpet av cellesuspensjonen til bearbeiding, er det viktig at en enkelt suspensjon av celler fremskaffes og injiseres i hemispleen. Minor klumping av tumorceller vil occlude miltkarene og føre til tidlig død under operasjonen. Dette kan unngås ved å oppslemme cellene i en declumping middel, og ved fremstilling av hver sprøyte for injeksjon umiddelbart før injeksjonen. I tillegg, i løpet av fremstillingen av densprøyten, er det viktig at cellene ikke blande seg med fosfatbufret saltvann i flukt. Dette kan oppnås ved først å tegne opp fosfatbufret saltvann og deretter meget langsomt å trekke opp celler for å unngå å blande, under opprettholdelse av sprøyten i oppreist stilling til enhver tid. For det andre, i løpet av tumorcelle-injeksjon trinn, skråkant av sprøyten skal følges til enhver tid gjennom milt kapselen for å unngå å injisere cellene i henhold til milten. En hvithet av milten og blodkar bør observeres ved injeksjon, noe som indikerer at tumorcellene har blitt injisert inn i milten. I yngre mus med mindre Miltene, kan det være nødvendig å injisere et mindre volum av spyle enn risikoen cellene som lekker fra milten. Ved mistanke om noe lekker, lå musene på deres side, og vaske milten med destillert vann før sy musene å bidra til å fjerne eventuelle celler som kan ha lekket under injeksjonen trinn. Unnlatelse av å fjerne disse celler vil resulterei tumorvekst på injeksjonsstedet, som kan forårsake død før oppnå tilstrekkelig metastaser. For det tredje, er plasseringen av horisonten klemmene under hemispleen viktig for å sikre at det er ingen blødning etter fjerning av hemispleen. Ytterligere Horizon klips kan benyttes til å okkludere fartøy som nødvendig. Den endelige kritiske trinn av denne teknikken er plasseringen av huden klemmene. Hvis musene blir følgende for overlevelse, kan det være nødvendig å sy huden på mus i stedet for ved hjelp av hud-klemmene. Noen ganger vil huden klemmene faller av før fullstendig helbredelse av sår i huden, som kan gjengi musene utsatt for infeksjon. Suturering av huden, som er atskilt fra peritoneum, vil forhindre dette problem.
Selv om denne teknikken er uvurderlig for å studere metastatisk prosess og metastatisk sykdom, har denne modellen et par begrensninger. Først gjør reproduserbar natur denne modellen det foretrukket over genmodifiserte og orthotopic modeller for å studere metastatisk prosess og svulsten mikromiljøet ved metastaser. Imidlertid, på grunn av arten av produktet, bare de siste trinnene av metastatisk prosess, ekstravasasjon og kolonisering, kan studeres. Dette begrenser nytten av denne modellen for å studere hele metastatisk prosess og ikke tillater for gransking av signaler som stimulerer intravasation tumorceller. Sekund, mens det er viktig å opprettholde full immunfunksjonen hos disse musene ved å beholde halvparten av hemispleen, analyse av lymfocytter i leveren inkluderer både lymfocytter fra normal lever samt lymfocytter fra svulsten mikromiljøet, noe som kan resultere i en forspent representasjon av den sanne immunstatus innen svulsten mikromiljøet. Bruken av mer aggressive tumorcellelinjer som fører til mer omfattende metastaser i leveren kan bidra til å overvinne denne begrensning av modellen. I tillegg, hvis den metastaser er visualisert ved obduksjon, kan det være possible å dissekere de metastaser fra normal leveren og analysere bare lymfocyttene funnet i metastaser ytterligere omgår dette problemet. I sammendraget, mens denne modellen har flere ulemper, det tilbyr også mange fordeler fremfor andre modeller, og bør derfor brukes utfylle disse modellene når studere metastatisk sykdom til leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
KF og KO er co første forfattere sammen med KS
Dette arbeidet ble støttet delvis av AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Clinical Scientist Award (LZ), Viragh Foundation og Skip Viragh bukspyttkjertelen Cancer Center ved Johns Hopkins (EMJ og LZ), National Pancreas Foundation (LZ), den Lefkofsky Family Foundation (LZ), NCI SPORE i Gastrointestinal Kreft P50 CA062924 (EMJ, LZ), den Lustgarten Foundation (LZ), og Sol Goldman bukspyttkjertelkreftsenter tilskudd (KS , BHE, LZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco by Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| Curved Operating Scissor | Roboz Surgical Store | RS-6835 | |
| Micro Dissecting Graefe Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5130 | |
| Needle holder (regular) | World Precision Instruments, Inc | ||
| 3-0 or 4-0 suture | courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins | ||
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled | Teleflex | 237115 | |
| Weck Horizon medium ligating clips | Teleflex | 002200 | |
| Weck Horizon small ligating clips | Teleflex | 001200 | |
| Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip | Becton Dickinson | 309625 | |
| Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm Autoclip Applier | Mikron | 427630 | |
| 9 mm Autoclip | Becton Dickinson | 427631 | |
| Heating pad | Sunbeam | CAT93 | |
| 70% Ethanol | sold by numerous vendors | ||
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | 22395DD | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
- Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
- Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
- Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
- Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
- Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
- Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
- Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390 (2011).
