Summary
En preklinisk, musmodell av levermetastaser utförs via ett hemispleen injektionsteknik.
Abstract
Många musmodeller har utvecklats för att studera mänskliga cancerformer och främja förståelsen för cancerbehandling och utveckling. Här är en preklinisk, mus pankreastumör modell av levermetastaser via en hemispleen injektion av syngena murina pankreastumörceller beskrivs. Denna modell härmar många av de kliniska tillstånd hos patienter med metastaserad sjukdom till levern. Möss konsekvent utveckla metastaser i levern möjliggör undersökning av metastaserande process, experimentell terapi testning och tumörimmunologi forskning.
Introduction
Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (PDA) är den fjärde vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i USA 1. Den femåriga överlevnaden för patienter med metastaser handdator är 2-12% 1. Även adjuvant och neoadjuvant kemoterapi för cancer i bukspottskörteln är effektivare i dag än någonsin, fortfarande finns ett desperat behov av nya terapier.
Utvecklingen av nya läkemedel kräver pålitliga prekliniska djurmodeller. Även subkutana tumörmodeller är enkla att använda, nackdelar inkluderar oförmåga dessa tumörer att metastasera och härma tumörprogression och mikromiljöer ses i humana cancerformer. Genmanipulerade modeller, till exempel genetiskt modifierade musen innehåller Kras och p53 knock-in onkogena mutationer (KPC-modellen) 2 och KPC modell med YFP härstamning spårämne (den PKCY modellen) 3 möjliggöra studier av naturligt förekommande tumörer i immunocompetent möss. Dessutom är tumörmikroomgivningen obearbetat och mer nära liknar den som ses i humana tumörprogression. Tyvärr, är tidpunkten för tumörutveckling variabla inom dessa modeller, vilket gör det svårt att studera experimentella behandlingar. Dessutom återkorsning av dessa möss kräver en betydande mängd tid och finansiellt åtagande, vilket inte alltid är möjligt. Slutligen nödvändiggör implanterade modeller xenograft PDA mus nedsatt immunförsvar möss, som har ändrats eller frånvarande tumörmikromiljöer. Som ett resultat av effekten av experimentella terapier demonstreras i dessa prekliniska modeller ofta inte reproducerbara i humana kliniska försök 4.
Denna hemisplenectomy musmodell utnyttjar Panc02 tumörceller, som är en starkt tumörframkallande, metylkolantren inducerad pankreatisk tumörcellinje härledd från C57BL / 6 möss 5, 6. Dessutom kan andra murina cellinjer PDA härledd från KPC mice kan användas i denna modell. Schulick et al. Har tidigare utvecklat en hemisplenectomy teknik och skapade en syngen musmodell av koloncancermetastaser 7. Denna hemisplenectomy modell (figur 1) ger konsekventa och lika tumörinokulation hos immunkompetenta möss utlåning sig till utredningen av nya terapeutiska medel 7-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök överensstämde med riktlinjerna i Animal Care och användning kommittén av Johns Hopkins University, och djuren hölls i enlighet med riktlinjerna i föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Care (AAALAC). Den kirurgiska proceduren utfördes under sterila förhållanden i ett operationsrum som undergår minst femton luftbyten per timme. Alla instrument steriliseras genom autoklavering före proceduren och igen med 70% etanol i mellan varje mus under förfarandet. Alla möss som inte förväntas överleva det kirurgiska förfarandet avlivas under CO 2 för 3 min följt av cervikal dislokation medan fortfarande under anestesi.
1. Cell Framställning
- Resuspendera odlade Panc02 celler i fosfatbuffrad saltlösning vid 2 x10 7 celler / ml, och hålla på is.
2. Mus Framställning
- Administrera Ketamine (100 mg / kg) blandades med xylazin (10 mg / kg) intraperitonealt till 8-12 veckor gamla C57BL / 6 honmöss i uppdelade doser.
- Kontrollera att tån nypa tillbakadragande reflex avskaffas så att musen är helt bedövad.
- Administrera ytterligare doser av ketamin (100 mg / kg) blandas med xylazin (10 mg / kg) som behövs för att fullt söva mössen.
- Applicera Puralube Vet Salva för ögonen på mössen för att förhindra uttorkning när mössen är under narkos.
- Raka det kirurgiska området av mössen för att undvika kontaminering av såret.
- Prep vänster subcostal område av snittet med 70% etanol och sedan jod.
- Placera en operationshandduk runt buken för att upprätthålla sterilitet.
3. Laparotomi
- Gör en vänster subcostal snitt i linje med det vänstra örat genom huden och genom bukhinnan med hjälp av en skalpell.
- Uttryck mjälten genom snittet genom att tillämpa samtidiga digitala pryck längs de kraniala och kaudala aspekter av snittet.
- Leta reda på mjälten blodkärl vid sämre änden av mjälte.
- Dela mjälten genom att placera två Horizon medelstora ligerande klipp i mitten av mjälten var noga med att undvika skador på mjälten blodkärl vid mjält polerna.
- Placera den övre polen av mjälten tillbaka in i peritoneum för att undvika kontaminering.
4 Tumör Injektion
- Upprätta 150 | il fosfatbuffrad saltlösning i en 26 G x 5/8 "spruta.
- Upprätta 100 pl Panc02 (2 x10 6) celler i samma spruta behålla sprutan i upprätt läge under hela injektionen.
- Doppa nål i en 70% etanollösning. Nålen doppas i 70% etanol för att säkerställa sterilitet.
- Injicera cellerna långsamt i den exponerade hemispleen vara säker sprutan hålls upprätt vid alla tidpunkter. Fasningen på syrinGE bör iakttas vid alla tillfällen genom mjälten kapseln för att undvika att injicera cellerna i mjälten. Ska observeras En blekning av mjälten och blodkärl vid injektion.
- Höj mjälten och applicera ett medium Horizon klipp i mjälten för att täppa mjälten blodkärl.
- Applicera en liten Horizon klipp till den mest distala aspekten av bukspottkörteln och mjälten fartyg.
- Ligate bukspottkörteln och mjälten fartyg från hemispleen genom att skära över horisonten klipp.
- Placera musen på dess "sida, och vattna snittet med destillerat vatten.
5. Abdominal Stängning och återhämtning från Anesthesia
- Stäng bukhinnan med en 4-0 kör stygn.
- Applicera 2-3 huden klipp för att stänga snittet huden.
- Administrera 0,1 mg / kg buprenorfin eller 5-10 mg / kg Karprofen subkutant för att lindra postoperativ smärta.
- Placera musen på en värmedyna för recOvery fram mobilen och musen visar regelbundet andningsmönster. Djuren endast returneras till sällskap med andra djur efter helt återgå från det kirurgiska ingreppet.
6 Obduktion Undersökning och Skörd av levern
- Mellan 30 till 60 dagar efter operationen, kommer möss börja visa kliniska symptom av metastaser och kommer att kräva dödshjälp. Tecken på metastatisk sjukdom som kräver human dödshjälp inkluderar förstorade bakkroppen och utveckling av ascites. Euthanize mössen genom inhalation av CO2.
- Efter inhalation, utföra halsdislokation.
- När djuret har bestämt sig för att vara icke lyhörd, gör ett snitt genom bukhinnan att exponera buken med hjälp av en sax.
- Använda pincett och sax, skär försiktigt levern ur buken.
- Placera levern i oktober förening, och blixt frysa hjälp av flytande kväve. Förvara levern vid -80 ° C. Alternativt kan det levander kan fixeras i 16% neutral buffrad formalin vid RT under 24 h och paraffininbäddade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Panc02 tumörceller injiceras i hemispleen (Figur 1) form levermetastaser i 100% av mössen, medan lung och peritoneal metastaser inte iakttas om tekniken utförs korrekt. Denna teknik har utförts på över hundra möss med Panc02 celler i multipla, oberoende experiment, och reproducerbart, alla obehandlade möss dör med levermetastaser mellan 30 och 60 dagar efter hemisplenectomy förfarandet (Figur 2). För att få statistisk signifikans mellan de obehandlade och behandlade grupper, krävs tio möss per grupp. Dock kommer detta antal att variera med avseende på den cellinje och behandlingsschema som används. När Panc02 celler används i denna modell, kan observeras multipla levermetastaser vid obduktion (Figur 3).
KPC-tumörceller, vilka är en syngen pankreatisk tumörcellinje härledda från transgena möss som har vävnadsspecifik Kras och p53 knock-inmutationer 11, kan också användas i denna modell. Med användning av dessa celler resulterar i liknande levermetastaser (figur 4). Men när man utvärderar levermetastas bildning med användning av en annan cellinje, antalet injicerade celler bör titreras tills alla obehandlade möss utvecklar levermetastaser. Panc02 celler kan användas som en positiv kontroll för att säkerställa att operationen utförts korrekt. Viktigt medan omfattningen av bildandet av levermetastaser och överlevnad kan variera beroende på cellinje som används inom ett experiment, alla obehandlade möss utvecklar levermetastaser på en liknande börda och dör av dessa metastaser reproduceras inom en kort tidsperiod. Därför är normalisering av tumörbördan med ultraljud inte nödvändigt när du använder denna teknik.
Underlåtenhet att inducera levermetastas resulterar i en normal förekommer lever vid obduktion, vilket kan tyda på att förfarandet inte utfördes på korrekt sätt. Dock misslyckades eller delayed bildandet av metastaser kan resultera efter behandling med terapier som hämmar eller hämmar metastaser tillväxt (Figur 5), vilket resulterar i förlängd överlevnad. Därför kan denna modell användas för att bedöma effekterna av olika terapeutiska medel på tumörtillväxt och bildandet av metastaser.
Eftersom det är tekniskt möjligt att utvärdera levern med ultraljud, ett litet djur ultraljud (Figur 6) 12 kan användas för att bedöma bildandet in vivo av metastaser i levern. Dessutom kan bildandet av metastaser undersökas ytterligare genom histopatologi efter obduktion (Figur 7).
Figur 1 Schematisk bild av den hemisplenectomy modell, som användsatt skapa pankreas levermetastaser med Panc02 tumörceller.
Figur 2 Representant överlevnad C57BL / 6 möss efter att ha genomgått Panc02 hemisplenectomy dag 0 visas i Kaplan-Meier-kurva (n = 10). Möss injicerades med Panc02 tumörceller i denna modell kommer alla att dö mellan 30 och 60 dagar efter det procedur om anti neoplastiska terapier inte administreras.
Figur 3 Brutto undersökning av levern efter injektion av Panc02 celler till hemispleen avslöjar levermetastaser (indicated med pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Brutto undersökning av levern efter hemispleen injektion av KPC tumörceller i hemispleen avslöjar levermetastaser (svarta pilar) som ersätter den normala leverparenkym (vit pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
>
Figur 5 Brutto undersökning av levern efter en effektiv terapeutisk intervention. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Lever ultraljud använder en Vevo 660 litet djur ultraljud på en mus med en stor metastatisk skada i levern (svart pil) efter hemisplenectomy förfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ig7highres.jpg "src =" / filer / ftp_upload / 51677 / 51677fig7.jpg "/>
Figur 7 H & E-färgning av paraffininbäddade levermetastaser bildade av Panc02 celler i hemisplenectomy modellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna preklinisk musmodell för cancer i bukspottskörteln metastaser till levern via en hemispleen injektionsteknik är den första modellen som beskrivs som speglar många av de kliniska och immunologiska förhållanden patienter med metastaserad sjukdom till levern. Denna modell erbjuder flera fördelar jämfört med andra murina modeller. Först, till skillnad från transgena modeller av cancer i bukspottskörteln, där endast 30% av mössen utvecklar metastaser i levern och tidpunkten för metastaser bildning är ganska varierande, erbjuder denna modell fördelen av konsekvent få metastaser till levern i 100% av möss vid en enhetlig tid, för att göra det möjligt för forskare att studera metastatisk sjukdom i denna inställning. Dessutom behåller denna modell en naiv hemispleen att möjliggöra perifert blod immunanalys på ett reproducerbart modell. Dessutom, i frånvaro av anti-neoplastiska terapier, möss dör av tumörprogression hos en enhetlig tidspunkt beroende på den initiala tumörbelastning, och överlevnad är förenligfrån ett experiment till nästa. Slutligen har den här modellen en mängd olika tillämpningar, inklusive studier av levermetastaser 13, tumörimmunologi 10, och experimentell terapi tester 9.
De kritiska stegen i denna teknik är förberedelser cellsuspensionen, tumörcellsinjektion, placeringen av Horizon klipp, och placeringen av klippen huden. För att säkerställa en lyckad operation och undvika eventuella skev av resultaten kan följande ändringar av de kritiska stegen vara nödvändiga. Först under beredningen cellsuspension, är det absolut nödvändigt att en enda suspension av celler erhållas och injiceras i hemispleen. Mindre hopklumpning av tumörceller kommer att täppa de mjälten fartyg och orsaka för tidig död under operation. Detta kan undvikas genom att återsuspendera cellerna i en declumping medel och genom att framställa varje spruta för injektion omedelbart före injektionen. Dessutom under beredningen avsprutan, är det absolut nödvändigt att cellerna inte blanda med fosfatbuffrad saltlösning flush. Detta kan uppnås genom att först rita upp fosfatbuffrad saltlösning och sedan mycket långsamt utarbeta cellerna för att undvika blandning, bibehålla sprutan i upprätt läge hela tiden. För det andra, under tumörcellinjektion steg bör observeras fasningen på sprutan hela tiden genom mjälten kapseln för att undvika att injicera cellerna i mjälten. Ska observeras En blekning av mjälte och blodkärl vid injektion, vilket tyder på att tumörcellerna har framgångsrikt injiceras i mjälten. I yngre möss med mindre mjälte, kan det vara nödvändigt att injicera en mindre volym av flush än risken cellerna läcker från mjälten. Om man misstänker något läcker, lägga mössen på deras sida och tvätta mjälten med destillerat vatten innan suturering mössen för att ta bort alla celler som kan ha läckt under injektionen steget. Underlåtenhet att ta bort dessa celler kommer att ledai tumörtillväxt vid injektionsstället, vilket kan leda till döden innan uppnå tillräckliga metastaser. För det tredje är det viktigt att se till att det inte finns någon blödning efter avlägsnande av hemispleen placeringen av Horizon klipp under hemispleen. Ytterligare Horizon klipp kan användas för att ockludera fartyg vid behov. Det sista kritiska steget i denna teknik är placeringen av klippen huden. Om mössen varvid följande för överlevnad, kan det vara nödvändigt att sy huden på möss i stället för att använda på hud clips. Ibland kommer clipsen hud faller av innan fullständig läkning av hudsår, vilket skulle kunna medföra att möss mottagliga för infektion. Suturering av hud, separera från bukhinnan, kommer att förhindra detta problem.
Även om denna teknik är ovärderlig för att studera metastatisk process och metastatisk sjukdom, har denna modell några begränsningar. Först gör reproducerbar karaktären av denna modell att föredra över transgena och orthotopic modeller för att studera metastatisk process och tumörmikromiljö vid metastaser. Men på grund av arten av modellen, bara de sista stegen i metastaserande process, extravasering och kolonisation, kan studeras. Detta begränsar användbarheten av denna modell för att studera hela metastatisk process och inte tillåter undersökning av de signaler som stimulerar intravasering av tumörceller. För det andra, samtidigt som det är viktigt att behålla full immunförsvar hos dessa möss genom att behålla hälften av hemispleen, analys av lymfocyter i levern innefattar både lymfocyter från den normala levern samt lymfocyter från tumören mikromiljö, vilket kan resultera i en partisk representation den sanna immunstatus i tumören mikromiljö. Användningen av mer aggressiva tumörcellinjer som leder till mer omfattande metastaser till levern kan hjälpa övervinna denna begränsning av modellen. Dessutom, om metastaserna visualiseras vid obduktion kan det vara possible för att dissekera de metastaser från normal lever och endast analysera lymfocyterna som finns i metastaser ytterligare kringgår detta problem. Sammanfattningsvis medan denna modell har flera nackdelar, erbjuder det också många fördelar jämfört med andra modeller och bör därför användas komplettera dessa modeller när man studerar metastaser till levern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga relevanta intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
KF och KO är co första författare tillsammans med KS
Detta arbete stöddes delvis av AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Clinical Scientist Award (LZ), Viragh Foundation och Skip Viragh bukspottskörteln Cancer Center vid Johns Hopkins (EMJ och LZ), National Pancreas Foundation (LZ), den Lefkofsky Family Foundation (LZ), NCI SPORE i Gastrointestinal cancer P50 CA062924 (EMJ, LZ), den Lustgarten Foundation (LZ), och Sol Goldman bukspottkörtelcancer Center bidrag (KS , BHE, LZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco by Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| Curved Operating Scissor | Roboz Surgical Store | RS-6835 | |
| Micro Dissecting Graefe Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5130 | |
| Needle holder (regular) | World Precision Instruments, Inc | ||
| 3-0 or 4-0 suture | courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins | ||
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled | Teleflex | 237115 | |
| Weck Horizon medium ligating clips | Teleflex | 002200 | |
| Weck Horizon small ligating clips | Teleflex | 001200 | |
| Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip | Becton Dickinson | 309625 | |
| Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm Autoclip Applier | Mikron | 427630 | |
| 9 mm Autoclip | Becton Dickinson | 427631 | |
| Heating pad | Sunbeam | CAT93 | |
| 70% Ethanol | sold by numerous vendors | ||
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | 22395DD | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
- Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
- Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
- Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
- Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
- Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
- Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
- Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390 (2011).
