Summary
一种方法来评估分离的小鼠肺泡巨噬细胞，激光共聚焦显微镜，以控制吞噬曲霉菌孢子的生长的能力。
Abstract
肺是其中的宿主细胞经常接触到的微生物和微生物产品的接口。肺泡巨噬细胞是遇到吸入真菌和其它微生物的一线吞噬细胞。巨噬细胞和其他免疫细胞识别曲霉图案由病原体识别受体，并启动下游的炎症反应。吞噬细胞NADPH氧化酶产生活性氧中间体（投资回报），是宿主防御的关键。虽然NADPH氧化酶是至关重要的中性粒细胞介导的宿主防御1 - 3，NADPH氧化酶的巨噬细胞中的重要性是不明确的。本研究的目标是界定在介导针对A.宿主防御NADPH氧化酶的巨噬细胞中的具体作用曲霉 。我们发现，在肺泡巨噬细胞NADPH氧化酶控制吞噬A的增长烟曲霉菌孢子4。在这里，我们描述了一种用于评估老鼠的能力lveolar巨噬细胞（AMS）来控制细胞吞噬黑曲霉的孢子（分生孢子）的生长。肺泡巨噬细胞进行染色体内并通过支气管肺泡灌洗（BAL）从小鼠十天后分离。巨噬细胞被镀到玻璃盖玻片上，然后种入绿色荧光蛋白（GFP）表达A.烟曲霉菌孢子。在指定的时间，将细胞固定和完好的巨噬细胞与吞噬孢子的数量通过共聚焦显微镜进行评估。
Introduction
肺泡巨噬细胞是遇到吸入微生物一线吞噬细胞。巨噬细胞识别黑图案由病原体识别受体，摄取并限制吸入孢子（分生孢子）的生长，并启动炎症反应。吞噬细胞NADPH氧化酶转化分子氧超氧阴离子和下游活性氧中间体（投资回报）。慢性肉芽肿病（CGD）是NADPH氧化酶的特征是严重的细菌和真菌感染和由过度的炎症反应的一种遗传性疾病。
虽然NADPH氧化酶是至关重要的中性粒细胞介导的宿主防御1 - 3，NADPH氧化酶的巨噬细胞中的重要性是不明确的。此前的研究表明，肺泡巨噬细胞摄取并杀死曲霉菌孢子，而中性粒细胞主要针对菌丝阶段5。但是，也出现了相互矛盾的雷苏尔TS作为NADPH氧化酶在巨噬细胞中控制A的生长的作用曲霉孢子6,7。
该方法的目标是界定在介导针对A.宿主防御NADPH氧化酶的巨噬细胞中的具体作用烟曲霉菌孢子。我们发现，在肺泡巨噬细胞NADPH氧化酶控制吞噬A的增长烟曲霉菌孢子4。为了最准确地模拟主机对吸入真菌，我们使用了支气管肺泡灌洗收集肺泡巨噬细胞的未刺激小鼠紧随牺牲。使用隔离的肺泡巨噬细胞使我们能够专注于自己的抗真菌活性在没有其他免疫细胞（ 如中性粒细胞招募）， 在体内防御曲霉 。在该方法中，肺泡巨噬细胞进行染色在事先体内收获，以尽量减少收获后的操作量。</ P>
另一个优点这个协议是使用GFP表达A的曲霉菌株。这种真菌表达从分生孢子阶段GFP通过菌丝阶段，并没有必要进一步染色。以获得具有更详细的图像，我们选择了共焦显微镜使从所获得的图像的三维结构的重建。三维重建给出菌丝生长周围，而不是在或通过巨噬细胞之间进行区分的能力。分生孢子也可以精确地辨别作为细胞内与细胞外。
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Protocol
动物在这项研究中执行的所有程序批准了动物护理和使用委员会在罗斯威尔公园癌症研究所和遵守所有州，联邦和卫生法规国家机构。
1， 在体内巨噬细胞标记
注意：PHK26是将要采取由吞噬细胞在血液循环和在组织中静脉内给药（IV）时，亲脂性染料。 PKH26用于体内标记，以减少收获后处理的巨噬细胞的数量。 PKH-26具有稳定地积聚在肺泡巨噬细胞的延长期的优势。给药后10天等待允许从循环只留下肺泡巨噬细胞稳定标记PKH26 8,9所有标记细胞的间隙。 PKH26是一个红色的荧光，具有激发（551 nm）和发射（567 nm）的特性兼容罗丹明或藻红蛋白的检测系统。任何标记过程可以介绍的神器，其中包括生存能力的丧失。然而，由于我们使用的巨噬细胞的标记以同一方法，不同的鼠标基因型（ 例如 ，WT与NADPH氧化酶缺陷），这些文物的影响将是统一的。
- PKH26稀释的原液（乙醇1×10 -3 m）在由制造商提供的稀释液1:5。
- 负载100μl的稀释PKH26成1/2 20ng/ml胰岛素注射器（29克X 1/2“）对每只小鼠。
- 通过静脉注射（或尾静脉或眶）至少10天，收获前管理到小鼠。
2，收获肺泡巨噬细胞支气管肺泡灌洗（BAL）
小鼠用于实验的数目可以变化。一个典型的产量从未受刺激的小鼠是在3-5×10 5肺泡巨噬细胞的范围内，但这个数字也相差很大BAS版上的因素，如进行灌洗者的鼠标，经验大小和灌洗液和从肺中排出的体积的滴注的数量。在这个协议中肺灌洗是一个封闭胸腔它伴随着反复1毫升灌洗有助于提高细胞产量进行。
- 通过使用无菌条件下，保持溶液的无菌管理致死剂量阿佛丁麻醉剂（12.5毫克），腹腔（IP）安乐死鼠标。
- 用70％乙醇彻底喷鼠标。
- 从动物的颅年底去除皮肤暴露胸部（ 图1A）。
- 做一个小切口在皮肤只是隔膜下方。
- 将手指插入切口，拉皮肤远离动物（ 图1A）的颅结束。
- 向上推略微的头，延长颈部腹侧（ 图1A）。
- 通过切左肋一个小孔进入右侧胸廓放气肺和也允许在以下步骤中的肺的可视化。
- 找到气管，并认真剖析了周围的组织。
- 取出唾液腺，胸骨舌骨肌和喉等用弯钳。
- 小心地抬起了弯钳和切去，用剪刀薄组织覆盖气管（外膜）揭示的基本环状软骨结构。
- 将导管插入气管。
- 用弯钳，放置缝合后面（背侧）的气管，并通过开口拉一个10cm的长度。
- 启动环状（软骨环增厚）上面仔细地引导22政导管下来气管停在那里气管消失胸骨后面。
- 紧紧绑周围缝合气管导管到舒适的位置。从导管取出针头。
- 装配4路阀。
- 填1个6毫升注射器用DPBS，1％FBS和附加到4路阀， 如图1B所示。
- 附上一个空6毫升在注射器上的4路阀（ 图1B）所指示的位置。
- 重视开放端口上的活塞，以导管4路（ 图1B）。注意不要从气管导管打跑。
- 从收集肺灌洗液。
注：调查人员可以选择使用肺泡灌洗液中下三卷，以尽量减少组织损伤的可能性。那同样的方法在所有小鼠组被贯彻应用是很重要的。- 所以转空注射器被关闭的水龙头把手， 慢慢地注入约1mL DPBS，1％FBS膨胀的肺。通过切孔在步骤2.4观察肺胀。
- 要小心，不要过度膨胀的肺。
- 打开水龙头手柄，使之充分注射器被关闭，并仔细撤回流感 ID从肺部。
- 观察肺放气通孔切割步骤1.4。导管可能需要移动稍微向后或向前来获得一个很好的借鉴。采取特殊的预防措施，以保持导管气管内。
- 重复步骤2.8.1-2.8.4 5-6倍，直到所有的DPBS，1％FBS的已注入和从肺部排出。注意：肺液的回收将不注射液的100％。
- 空注射器灌洗液到50ml锥形管中。保持细胞在室温下。
- 通过在300 XG离心5分钟，在室温下沉淀细胞，并倒出上清液。这样如果需要，可以保存用于细胞因子分析。
- 重悬的细胞在1-5毫升的RPMI 1640含10％FBS和血细胞计数器计数。在未刺激的小鼠，> 95％的细胞由BAL收获的预计是巨噬细胞，这可以通过细胞学进行确认。
3，培养和收获真菌
“>在这个协议中使用的烟曲霉表达绿色荧光蛋白在其整个生命周期的各个阶段：孢子，germlings和菌丝这种真菌菌株是由马戈·摩尔博士，西门菲沙大学，伯纳比，不列颠哥伦比亚省，加拿大提供。- 在沙氏脑心脏浸液（BHI）琼脂斜面用氯霉素（0.05克/升）和庆大霉素（0.5克/升）表达GFP的烟曲霉菌株的分生孢子盘。
- 在孵育在室温下松瓶盖为7〜10天的黑暗。
- 收获分生孢子通过倾斜洗涤用10毫升0.01％吐温20的DPBS。轻轻刮除木耳与stripette松动。冲洗斜几次，以增加产量。
- 通过100微米的细胞过滤网通过分生孢子悬浮液置于50ml锥形。
- 粒料分生孢子在400×g离心离心10分钟。
- 分生孢子重悬在50毫升的DPBS和计数使用血球。
- 用DPBS洗两次并稀释至所需浓度滤过。
4，真菌挑战和共聚焦显微镜
为了研究巨噬细胞NADPH氧化酶在宿主防御中的作用，从三种基因型控制吞噬曲霉菌孢子的生长小鼠分离的肺泡巨噬细胞的能力进行了评估。在本研究中使用的基因型包括; 1）野生型小鼠，2）NCF1 * / *锰小鼠的天然存在的突变NCF1（NCF1编码为P47 PHOX，吞噬细胞的NADPH氧化酶的必需组分）离开他们的NADPH氧化酶缺陷型，和3）NCF1 * / *锰+转基因小鼠（MN表示该转基因携带野生型NCF1人类CD68启动子的控制下），其中NADPH氧化酶活性已被重新溶解在单核细胞/巨噬细胞群10，11。
共聚焦显微镜最适合于该试验中，由于存在和在幻灯片非吞噬的分生孢子的生长。共焦显微镜将允许在Z轴中的各个平面的可视化，并且使真菌生长围绕，而不是内巨噬细胞之间的差异。所有的共聚焦图像是使用63X油浸镜头获得的。 Z-栈收购与2.5电子的变焦倍数。一个Z-堆栈的厚度是用DAPI和亮场图像的定位字段的顶部和底部的确定。 Z-堆栈介乎14至24微米，个别切片〜1微米厚。巨噬细胞的定量，1X电子变焦的单扫描每基因型的10个字段分别进行。被确定完整的巨噬细胞的基础上分别PKH26和膜和细胞核的DAPI染色。分生孢子的基础上确定的FITC表达和亮场图像。
- 准备无菌盖玻片和板
- 下一个生物安全柜，浸泡22×22毫米的玻璃盖玻片在70％桥亚乙基升5-10分钟。
- 在无菌PBS冲洗盖玻片。
- 用无菌镊子，轻轻地放在一个单独的盖玻片在无菌单独包装的6孔板的每个孔的底部。
- 种子〜1×10 6个收获的PKH26标记的肺泡巨噬细胞悬浮于300微升的RPMI 1640，10％FBS到每个盖玻片。取决于收获产量的确切数量可以改变。
- 让巨噬细胞在37℃温育，用5％的CO 2过夜以粘附。
- 第二天早晨，加〜1×10 7表达GFP的A。曲霉分生孢子悬浮于100μl预热的（37℃）的RPMI 1640，10％FBS。
- 返回板到37℃培养箱中，用5％的CO 2。
- 细胞应该被固定为至少2小时，室温过夜或在4℃下在3,7和14小时修复细胞，加入2％的甲醛等体积到各孔中（最终浓度1％的甲醛）。地方板的在4℃下早期时间点过夜。在最后的时间点（14小时），固定的细胞在室温下搅拌2小时。
- 固定后，使用镊子轻轻取出盖玻片和冲洗的DPBS。
- 放置盖玻片的边缘折叠的Kimwipe去除多余的液体。
- 适用于6微升荧光封固剂用DAPI到玻璃显微镜载片。
- 莱盖玻片的一个边缘上的幻灯片，并与细胞侧轻轻下拉到安装介质。安装介质将蔓延并形成均匀的一层盖玻片下方。有没有必要压在盖玻片。
- 密封盖玻片的边缘与透明指甲油，并在空气中晾干。
- 店准备的幻灯片在幻灯片框（避光），在室温下，直到准备通过共聚焦显微镜来分析。
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Representative Results
从未经刺激的小鼠收集肺泡巨噬细胞通过BAL将导致基于细胞学一个纯度> 95％的人口。在3和7小时（ 图2）的时间点之前的真菌生长的菌丝阶段，并允许对分生孢子的基因型之间的吞噬效率的比较。其中基因型可以是关于抑制吞噬的分生孢子于组织侵入菌丝阶段的过渡（ 图3）的能力进行比较，在14小时的时间点是。完好的巨噬细胞可以通过共聚焦显微镜的基础上PKH26和DAPI染色的膜和细胞核（分别如图2和图3）来识别。分生孢子和菌丝的基础上确定的GFP表达（ 图2和3）。
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图1。解剖定向引用和4路活塞A）对小鼠的解剖定向引用所示。颅是在头部的方向，而尾部在尾部的方向。四脚的腹侧朝向腹部或动物的下表面，而背侧朝向背面或动物B）的上表面上的4路阀具有三个路厄式接头和手柄旋转360°引导流体通过上述活栓的流。空注射器，充分注射器和导管的放置表示。 点击这里查看大图。
图2。吞噬A的曲霉孢子是相似的基因型在7小时之间。评价孤立肺泡巨噬细胞与NADPH氧化酶活性的限制吞噬分生孢子的生长的能力，（A）野生型，（B）NCF1 * / *的Mn +，和（C ）NCF1 * / *锰-小鼠静脉给药PKH26。肺泡巨噬细胞被BAL收获10天后，接种与GFP表达A的分生孢子曲霉 。细胞被固定在3，7，和另外分生孢子后14小时。在3（数据未显示）和7小时的总的巨噬细胞的数量和巨噬细胞具有≥1吞噬分生孢子（箭头）是三个基因型间相似，反映类似的吞噬作用的效率。完好的巨噬细胞是基于PKH26（红色）和DAPI的一个膜（蓝色）染色鉴定分别为ND核。从单一的Z平面荧光图像叠加与明场图像。明场图像由通过整个样品的透射光，所以在荧光Z-纯覆时允许整个Z堆叠内的细胞和孢子的可视化。比例尺，19微米。 点击这里查看大图。
图3。巨噬细胞的NADPH氧化酶是必需的，以控制A的生长，中（A，D） 霉菌孢子共聚焦显微镜野生型，（B，E）NCF1 * / *的Mn +和（C，F）NCF1 * / *锰- < / SUP>肺泡巨噬细胞在14小时用GFP + A后播种曲霉分生孢子。完好的巨噬细胞的基础上确定PKH26（红色）和DAPI膜和细胞核（蓝色）染色，分别。实线箭头表示完整的巨噬细胞与至少一种吞噬的分生孢子和空心箭头指向菌丝。众多的AM与至少1吞噬分生孢子观察用野生型和NCF1 * / *的Mn +细胞，但不能与NADPH氧化酶缺陷的细胞。在菌丝GFP信号是基于示出AC）荧光图像从一个单一的Z-平面与明场图像的整个Z堆叠内使细胞可视化和菌丝的Z堆叠图像的平面中的变量。DF）的荧光图像从一个单一的Z平面无明场背景使得能够识别细胞，但不是细胞和真菌在不同的Z-平面的空间关系。比例尺，19微米。.jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
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Discussion
使用这种方法进行体外分析巨噬细胞的抗真菌活性连同体内真菌的挑战，我们先前表明，在巨噬细胞NADPH氧化酶起着抵御A的重要作用烟4。使用隔离的肺泡巨噬细胞使我们能够专注于他们的抗真菌活性在没有其他免疫细胞（ 如中性粒细胞招募）， 在体内防御曲霉 。
各种可视化策略已经被用于评价巨噬细胞的抗真菌活性在体内和离体 。路德等人，用共聚焦显微镜人类（从肺移植收获）和小鼠肺泡12研究曲霉分生孢子的吞噬作用。 Geunes-Boyer等。其特征在于以下吞噬克柔念珠菌和小鼠巨噬细胞之间的相互作用。他们用巨噬细胞系，RAW264.7，并从腹膜13初级巨噬细胞。加西亚 - 罗达斯等。表明，表面活性蛋白-D结合，并促进新型隐球菌 14的吞噬功能和生存。 SP-D的结合也进行了研究体内使用SP-D - / -鼻内接种的Alexa Fluor 488 -标记的小鼠C。新型隐球菌 。下面肺灌洗，肺泡被免疫荧光标记和激光共聚焦显微镜用于分析的吞噬作用。
从不同的解剖部位（ 如肺，脾，腹膜），具有不同的刺激（ 如巯基乙酸盐诱导或体外分化）产生的巨噬细胞，或细胞系（ 例如 ，RAW264.7）可以有显着不同的抗微生物和炎症反应15 - 18。因此，为了最准确地模拟主机响应于吸入乐趣GI，我们使用了未受刺激的小鼠紧随牺牲收获了支气管肺泡灌洗肺泡巨噬细胞。
首先，我们使用活细胞成像来评估巨噬细胞的抗真菌活性4。肺泡巨噬细胞接种于墓室载玻片然后种上绿色荧光蛋白表达曲霉。3小时后，非吞噬分生孢子由轻柔洗涤除去，使吞噬分生孢子通畅可视化。分生孢子萌发然后通过时间推移成像在使用强光图像可视化巨噬细胞和GFP荧光可视化真菌30分钟间隔监测。此方法具有获取同一原代细胞培养的连续图像的优点。然而，对于巨噬细胞的倾向横跨视场采集允许一个定性的而非conidiocidal活性的定量评估的过程中迁移。的活细胞成像的另一个缺点是叔他缺乏清晰度和细节的细胞移动焦点平面的进出。
用更详细的获取图像，我们选择共焦显微镜使从所获得的图像的三维结构的重建。三维重建给出菌丝生长周围，而不是在或通过巨噬细胞之间进行区分的能力。具有这种能力可以看到细胞和真菌在三个维度，除去非吞噬的分生孢子在3小时不再是一个必要步骤。分生孢子也可以精确地辨别作为细胞内与细胞外。
为增强的可视化，肺泡巨噬细胞被标记在体内与PKH26。此荧光染料具有长的脂肪族尾部稳定地结合到细胞膜的脂质区域。当静脉注射，这种亲脂性染料是采取了由吞噬细胞在血液和组织中。经过10天，拉贝导致吞噬细胞是从小鼠循环中清除，只留在组织中9，允许已标记肺泡巨噬细胞通过BAL的集合。通过使用体内标记，收获后处理肺泡巨噬细胞的最小化。
另一个优点这个协议是使用GFP表达A的曲霉菌株。这种真菌表达从分生孢子阶段GFP通过菌丝阶段，并没有必要进一步染色。与巨噬细胞和曲霉的双重染色，我们能够识别吞噬分生孢子。
在这个协议的一个限制因素是来自BAL巨噬细胞的产量。一个典型的产率从一个未刺激小鼠是在3-5×10 5个肺泡巨噬细胞的范围内，然而这个数可以大大基于因素，如进行灌洗者的鼠标，经验大小和滴注的数量变化灌洗感id和从肺中提取的量。在这个协议中，肺灌洗是带有闭合胸腔它随着反复1毫升滴注有助于相比，开放式胸腔和更少的滴注，以增加细胞产量进行。鼠标号码也可以增加，以增加作物产量。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由国家过敏与感染疾病格兰特R01AI079253（以BHS）的支持，以及由美国国家癌症研究所癌症中心支援津贴CA016056到罗斯威尔公园癌症研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4Cl | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 G x 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| Insulin syringes | |||
| 6 ml Syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| Suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 μm Cell strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell culture incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22 x 22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6-well Cell culture plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
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