Summary
Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.
Abstract
Die Lunge ist eine Schnittstelle, wo Wirtszellen werden routinemäßig an Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt. Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmeten Pilzen und anderen Mikroben zu begegnen. Makrophagen und anderen Immunzellen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren und nachgeschalteten Entzündungsreaktionen auslösen. Die Phagozyten NADPH-Oxidase erzeugt reaktive Sauerstoff-Intermediate (ROIs) und ist entscheidend für die Immunabwehr. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 - 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Das Ziel dieser Studie war es, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Immunabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Bewertung der Fähigkeit von Maus-alveolar Makrophagen (AMS), das Wachstum der Phagozytose Aspergillus-Sporen (Konidien) zu steuern. Alveoläre Makrophagen in vivo gefärbt und zehn Tage später aus Mäusen isoliert durch Lavage (BAL). Makrophagen werden auf Deckgläschen überzogen, dann mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierenden A. ausgesät fumigatus Sporen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und die Anzahl der intakten Makrophagen phagozytierten Sporen durch konfokale Mikroskopie untersucht.
Introduction
Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmete Keime begegnen. Makrophagen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren, aufnehmen und das Wachstum von inhalierten Sporen (Konidien) zu begrenzen, und Entzündungsreaktionen auslösen. Phagozyten NADPH-Oxidase wandelt molekularen Sauerstoff in Superoxid-Anion und stromabwärts reaktiven Sauerstoffzwischenprodukte (ROI). Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung der NADPH-Oxidase, die durch schwere bakterielle und Pilzinfektionen und durch übermäßige Entzündungsreaktionen.
Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 - 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass Alveolarmakrophagen aufnehmen und töten Aspergillus-Sporen, während Neutrophilen hauptsächlich gezielt die Hyphen Stufe 5. Jedoch gibt es widersprüchliche Results in Bezug auf die Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Kontrolle des Wachstums von A. fumigatus Sporen 6, 7.
Das Ziel dieser Methode war, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Wirtsabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus Sporen. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Um am nächsten modellieren die Wirtsreaktion auf inhalierte Pilze, verwendeten wir Alveolarmakrophagen von BAL geerntet von nicht-stimulierten Mäusen unmittelbar nach der Tötung. Die Verwendung von isolierten alveolaren Makrophagen konnten wir auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen in vivo zu konzentrieren. In diesem Verfahren wurden Alveolarmakrophagen in vivo vor gefärbt, um so zu ernten, um die Menge der nach der Ernte Manipulation zu minimieren. </ P>
Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung eines GFP-exprimierenden A. fumigatus-Stamm. Dieser Pilz drückt GFP aus der Konidienstadium durch die Hyphen-Bühne und hat keine Notwendigkeit für eine weitere Färbung. Um Bilder mit mehr Details zu erhalten, entschieden wir uns für die konfokale Mikroskopie, die die Rekonstruktion der dreidimensionalen Strukturen der erhaltenen Bilder ermöglicht. Dreidimensionale Rekonstruktion die Möglichkeit gibt, zwischen Hyphen herum wachsen und nicht in oder durch einen Makrophagen zu differenzieren. Konidien können auch genau unterschieden als intrazelluläre gegenüber extrazellulären sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren an Tieren in dieser Studie durchgeführt wurden, von der Animal Care und Verwenden Ausschuss am Roswell Park Cancer Institute genehmigt und mit allen Landes-, Bundes eingehalten werden, und National Institutes of Health Vorschriften.
1. In-vivo-Makrophagen-Labeling
Hinweis: PHK26 ein lipophiler Farbstoff, der von phagozytierenden Zellen sowohl in Umlauf und in den Geweben, wenn sie intravenös (iv) verabreicht genommen wird. PKH26 wurde für in vivo-Markierung verwendet, um die Menge der nach der Ernte Manipulation der Makrophagen zu minimieren. PKH-26 hat den Vorteil, stabil zu der sich in alveolären Makrophagen während längerer Zeit. Warten Sie 10 Tage nach der Verabreichung ermöglicht Clearance von allen markierten Zellen aus dem Verkehr so dass nur Alveolarmakrophagen stabil beschriftet mit PKH26 8, 9. PKH26 ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff, der Anregung (551 nm) und Emission (567 nm) hat Eigenschaften kompatibelmit Rhodamin oder Phycoerythrin Detektionssysteme. Jede Markierungsverfahren kann Artefakt vorstellen, einschließlich Verlust der Lebensfähigkeit. Da wir den gleichen Ansatz für die Kennzeichnung von Makrophagen in verschiedenen Maus-Genotypen (zB WT vs NADPH-Oxidase-Mangel), die Auswirkungen dieser Artefakte wäre Uniform.
- Verdünnen Stammlösung von PKH26 (1 x 10 -3 M in Ethanol) 1:5 in Verdünnungsmittel C durch den Hersteller zur Verfügung gestellt.
- Last 100 ul verdünnt PKH26 in einem 1/2 ml Insulin-Spritze (29 G x 1/2 ") für jede Maus.
- Verabreichen Mäusen durch iv-Injektion (entweder Schwanzvene oder retro-Orbital) mindestens 10 Tage vor der Ernte.
2. Ernten Alveolarmakrophagen durch bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Die Anzahl der Mäuse, für ein Experiment können variieren. Eine typische Ausbeute aus einer nicht-stimulierten Maus ist im Bereich von 3-5 x 10 5 Alveolarmakrophagen, aber diese Zahl kann stark variieren based von Faktoren wie Größe des Maus Erfahrung der Person, die die Spülung und die Anzahl der Instillation von Spülflüssigkeit und das Volumen von Lungen entnommen. In diesem Protokoll Lungenspülung mit einem geschlossenen Brusthöhle, die zusammen mit 1 ml Spülungen wiederholt hilft, die Zellausbeute zu erhöhen geführt.
- Euthanize Maus durch Verabreichung einer tödlichen Dosis des Narkose Avertin (12,5 mg) intraperitoneal (ip) unter aseptischen Bedingungen, um die Lösung steril zu halten.
- Spray Maus gründlich mit 70% igem Ethanol.
- Entfernen der Haut aus dem kranialen Ende tierischen Aussetzen des Thorax (Fig. 1A).
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut direkt unterhalb des Zwerchfells.
- Legen Sie den Finger in den Ausschnitt und ziehen die Haut von der Schädel Ende des Tieres (Abb. 1A).
- Drücken Sie leicht auf den Kopf, Erweiterung der Bauchseite des Halses (Abb. 1A).
- Schneiden Sie ein kleines Loch in den Brustkorbin die rechte Seite des Brustkorbs, die Lungen entleeren und erlauben auch die Visualisierung der Lungen während der folgenden Schritte.
- Suchen Sie die Luftröhre, und sorgfältig sezieren entfernt umgebende Gewebe.
- Entfernen Sie die Speicheldrüsen, Muskeln und M. sternohyoideus Kehlkopf, etc. mit einer gebogenen Pinzette.
- Vorsichtig mit einem gebogenen Pinzette heben und schneiden mit einer Schere die für den Luftröhre (Adventitia) enthüllt die zugrunde liegenden beringt Knorpelstruktur dünne Gewebe.
- Legen Katheter in die Luftröhre.
- Mit einer gebogenen Pinzette, legen Sie einen Faden hinter (dorsal) der Luftröhre und ziehen einen 10 cm Länge durch die Öffnung.
- Ab über dem Ring (die Verdickung der Knorpelring) vorsichtig führen einen 22-G-Katheter der Luftröhre nach unten zu stoppen, wo die Luftröhre verschwindet hinter dem Brustbein.
- Fest binden Naht um Luftröhre und Katheter für eine eng anliegende Passform. Entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter.
- Montieren 4-Wege-Hahn.
- Fülleneine 6-ml-Spritze mit DPBS, 1% FBS und heften sich an 4-Wege-Hahn, wie in 1B angegeben.
- Bringen Sie eine leere 6-ml-Spritze an der angegebenen Position auf der 4-Wege-Hahn (Abbildung 1B).
- Bringen offenen Port auf dem 4-Wege-Hahn zum Katheter (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, Katheter aus der Luftröhre nicht zu lösen.
- Sammeln Spülflüssigkeit aus der Lunge.
Hinweis: Die Ermittler können sich für geringere Volumina an Waschflüssigkeit verwenden, um die Möglichkeit einer Schädigung des Gewebes zu minimieren. Es ist wichtig, dass der gleiche Ansatz konsistent in allen Mausgruppen angewendet werden.- Drehen Sie den Griff auf dem Hahn, so dass die leere Spritze geschlossen und langsam injizieren ~ 1 ml DPBS, 1% FBS Lungen aufzublasen. Beachten Lungen Inflation durch das Loch geschnitten in Schritt 2.4.
- Achten Sie darauf, um die Lungen overinflate.
- Drehen Sie den Griff auf dem Hahn, so dass die volle Spritze geschlossen ist, und ziehen Sie vorsichtig die Grippe id aus der Lunge.
- Beachten Sie die Lunge durch das Loch geschnitten in Schritt 1.4 entlüften. Der Katheter kann brauchen, um etwas vor oder zurück bewegt werden, um einen guten Zug zu bekommen. Besondere Vorsichtsmaßnahme, um den Katheter in die Luftröhre zu halten.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.8.1-2.8.4 5-6x bis alle DPBS, 1% FBS wurde injiziert und aus den Lungen entnommen. Hinweis: Erholung der Lungenflüssigkeit nicht 100% der injizierten Flüssigkeit.
- Leere Spritze mit Spülflüssigkeit in einem 50 ml konischen Röhrchen. Halten Zellen bei Raumtemperatur.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur und Überstand abgießen. Dies kann beispiels Zytokinanalyse falls gespeichert werden.
- Die Zellen in 5.1 ml RPMI 1640 mit 10% FBS und zählen auf eine Zählkammer. In der nicht stimulierten Maus> 95% der Zellen durch BAL geerntet werden erwartet, Makrophagen, die zytologisch bestätigt werden kann.
3. Kultivierung und Ernte Pilz
"> Die in diesem Protokoll verwendet Aspergillus fumigatus drückt GFP in allen Phasen des Lebenszyklus:. Sporen, Keimlinge und Hyphen Diese Pilzstamm wurde von Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada bereitgestellt.- Platte Konidien von Aspergillus fumigatus, die GFP-Stamm auf Sabouraud-Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Schrägkulturen mit Chloramphenicol (0,05 g / l) und Gentamycin (0,5 g / L).
- Im Dunkeln lose für 7 bis 10 Tage bei Raumtemperatur verschlossen.
- Ernte Konidien durch Waschen Schräg mit 10 ml 0,01% Tween 20 in DPBS. Leicht kratzen den Pilz mit der Stripette zu lockern. Spülen Sie mehrmals die Schräge, um die Ausbeute zu erhöhen.
- Geben Konidiensuspension durch ein 100 &mgr; m-Zellsieb in ein 50-ml-Erlen.
- Pellet Konidien durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 min.
- Resuspendieren Konidien in 50 ml DPBS und zählen mit einer Zählkammer.
- Zweimal waschen mit DPBS verdünnt und auf die gewünschte Konzentrationtration.
4. Pilz Herausforderung und konfokale Mikroskopie
Um die Rolle von Makrophagen-NADPH-Oxidase der Wirtsabwehr zu untersuchen, wurde die Fähigkeit der isolierten alveolaren Makrophagen von Mäusen, die drei Genotypen, um das Wachstum von Aspergillus-Sporen phagozytiert Steuerung ausgewertet. Die in dieser Studie verwendeten Genotypen umfassen; 1) Wildtyp-Mäusen, 2) NCF1 * / * Mn-Mäuse mit einem natürlich vorkommenden NCF1 Mutation (NCF1 kodiert für p47 phox, eine erforderliche Komponente des Phagozyten NADPH-Oxidase) verlassen sie NADPH-Oxidase-Mangel, und 3) NCF1 * / * Mn + transgenen Mäusen (MN bezeichnet das Transgen beherbergen NCF1 Wildtyp unter der Kontrolle des humanen CD68-Promotor) wo NADPH-Oxidase-Aktivität wurde in der Monozyten / Makrophagen-Population 10, 11 wieder hergestellt ist.
Konfokalen Mikroskopie ist für diesen Test geeignet sind aufgrund des Vorhandensund das Wachstum von nicht-phagozytierten Konidien auf den Folien. Das konfokale Mikroskop wird zur Visualisierung der einzelnen Ebenen in der Z-Achse zu ermöglichen, und ermöglichen die Differenzierung zwischen Pilz wächst um als innerhalb Makrophagen. Alle konfokale Bilder werden mit einem 63X Ölimmersion erworben. Z-Stapel sind mit einem elektronischen Zoom-Faktor von 2,5 erworben. Die Dicke einer Z-Stapel wird mit DAPI und Hellfeld-Bilder, um die Ober-und Unterseite des Feldes zu finden bestimmt. Z-Stapel reichte von 14 bis 24 um mit einzelnen Scheiben ~ 1 um dick. Zur Quantifizierung der Makrophagen, wurden einzelne Scans von 1X elektronische Zoom auf 10 Felder pro Genotyp durchgeführt. Intakten Makrophagen wurden basierend auf PKH26 und DAPI-Färbung der Membran und Kern bzw. identifiziert. Konidien wurden auf der Grundlage FITC-Expression und Hellfeldbild identifiziert.
- Bereiten Sie sterile Deckgläser und Teller
- Unter einem biologischen Sicherheitsschrank, genießen 22 x 22 mm Deckgläschen in 70% Ethanol für 5-10 min.
- Spülen Deckgläser in sterilem PBS.
- Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig legen Sie eine einzelne Deckglas im Boden jeder Vertiefung einer sterilen einzeln verpackt 6-Well-Platte.
- Samen ~ 1 x 10 6 geerntet PKH26 markiert alveolären Makrophagen in 300 ul RPMI 1640 10% FBS auf jedes Deckglas. Die genaue Zahl kann je nach Erntemenge variieren.
- Makrophagen zu ermöglichen, durch Inkubation bei 37 ° C mit 5% CO 2 über Nacht anhaften.
- Am folgenden Morgen, fügen ~ 1 x 10 7 GFP-exprimierenden A. fumigatus Konidien in 100 &mgr; l vorgewärmtes (37 º C) RPMI 1640, 10% FBS suspendiert.
- Das Rückplatte auf 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2.
- Zellen sollten für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C fixiert werden Bei 3, 7 und 14 Stunden fix Zellen durch Zugabe eines gleichen Volumens von 2% Formaldehyd in jede Vertiefung (Endkonzentration 1% Formaldehyd). Platz Platten für diefrühen Zeitpunkten bei 4 ° C über Nacht. Für die endgültige Zeitpunkt (14 h), fix Zellen bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
- Nach der Fixierung vorsichtig mit einer Pinzette entfernen, Deckgläser und spülen in DPBS.
- Überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem der Rand des Deckglases auf einem gefalteten Kimwipe.
- Bewerben 6 ul Fluoreszenz Eindeckmedium mit DAPI auf einen Glasobjektträger.
- Legen Sie eine Kante des Deckglases auf dem Objektträger und sanft fallen mit der Zellseite nach unten in die Montage Medium. Montagemedium verteilt und bilden eine gleichmäßige Schicht unter der Deckglas. Es gibt keine Notwendigkeit, sich auf dem Deckglas gedrückt wird.
- Siegel Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack und an der Luft trocknen.
- Shop vorbereitet Träger in einen Objektkasten (lichtgeschützt) bei Raumtemperatur, bis Sie sie durch konfokale Mikroskopie analysieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammeln Alveolarmakrophagen von BAL aus nicht-stimulierten Mäusen wird in einem> 95% reine Population basierend auf Zytologie führen. Die 3 und 7 h (Abbildung 2) Zeitpunkten gehen der Hyphen-Phase des Pilzwachstum und damit für einen Vergleich der Effizienz der phagocytic Konidien unter Genotypen. Die 14 Stunden Zeitpunkt, wo Genotypen hinsichtlich der Fähigkeit, den Übergang von phagozytierten Konidien zum Gewebe-invasive Hyphen Stufe (Fig. 3) zu inhibieren, verglichen werden. Intakten Makrophagen kann durch konfokale Mikroskopie basierend auf PKH26 und DAPI-Färbung der Membran und Kern, die jeweils (Fig. 2 und 3) identifiziert werden. Hyphen und Konidien werden basierend auf GFP-Expression (Abbildung 2 und 3) identifiziert.
iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Anatomische Richtungsangaben und die 4-Wege-Hahn. A) Die anatomischen Richtungsangaben für eine Maus gezeigt. Schädel in Richtung des Kopfes, während der Schwanz in Richtung des Schwanzes. Die ventrale Seite des Vierbeiner ist in Richtung des Bauches oder der unteren Oberfläche des Tieres, während die Rückenseite zur Rückseite oder der Oberseite des Tieres. B) Das 4-Wege-Hahn weist drei Luer-Anschlüsse, und einen Griff, der sich dreht 360 °, um die Strömung von Flüssigkeiten durch den Hahn zu leiten. Die Platzierung der leeren Spritze, die volle Spritze und Katheter sind angegeben. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Phagozytose von A. fumigatus Sporen ist ähnlich zwischen Genotypen bei 7 Stunden. Um die Fähigkeit der isolierten Alveolarmakrophagen mit NADPH-Oxidase-Aktivität, das Wachstum von phagozytierten Konidien begrenzen auszuwerten, (A) Wildtyp, (B) NCF1 * / * Mn +, und (C ) NCF1 * / * Mn - Mäuse wurden iv PKH26 verabreicht. Alveolarmakrophagen wurden von BAL nach 10 Tagen geerntet und mit Konidien von GFP-exprimierenden A. ausgesät fumigatus. Zellen wurden 3, 7 14 h nach der Zugabe von Konidien befestigt und. In 3 (Daten nicht gezeigt) und 7 h sowohl die Gesamtzahl der Makrophagen und Makrophagen phagozytiert mit ≥ 1 Konidien (Pfeile) waren ähnlich zwischen den drei Genotypen aufgrund ähnlich Phagozytose Effizienz. Intakten Makrophagen werden basierend auf PKH26 (rot) und DAPI (blau) eine Färbung der Membran identifiziertnd Kerne auf. Die Fluoreszenzbilder aus einer Z-Ebene mit dem Hellfeldbild überlagert. Die helle Bildfeld besteht aus Licht durch die gesamte Probe übertragen und so, wenn auf dem Leucht Z-Ebene überlagert ermöglicht die Visualisierung von Zellen und Sporen innerhalb des gesamten Z-Stapel. Maßstabsbalken, 19 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Makrophagen NADPH-Oxidase erforderlich ist, um das Wachstum von A. Kontrolle . fumigatus Sporen konfokale Mikroskopie von (A, D) Wildtyp, (B, E) NCF1 * / * Mn +, und (C, F) NCF1 * / * Mn - < / Sup> Alveolarmakrophagen bei 14 Stunden nach der Aussaat mit GFP + A. fumigatus Konidien. Intakten Makrophagen werden basierend auf PKH26 (rot) und DAPI (blau)-Färbung von Membranen und Kerne, die jeweils identifiziert. Durchgezogene Pfeile zeigen intakt Makrophagen, die mit mindestens einem phagozytierten Konidien und Hohl Pfeile zeigen auf Hyphen. Zahlreiche Änderungsanträge mit mindestens 1 phagozytierten Konidien wurden mit Wildtyp-und NCF1 * / * Mn +-Zellen beobachtet, nicht aber mit NADPH-Oxidase-defizienten Zellen. GFP-Signal in Hyphen wurde Variablen auf der Ebene der z-gestapelt Bild gezeigt. AC) Fluoreszenzbilder von einer einzelnen Z-Ebene mit der hellen Bildfeld zu ermöglichen Visualisierung von Zellen und Hyphen innerhalb des gesamten Z-Stack basiert. DF) Fluoreszenzbilder aus einer Z-Ebene, ohne die Hellfeldhintergrund zu ermöglichen Identifizierung von Zellen, jedoch nicht die räumliche Beziehung der Zellen und Pilzen in verschiedenen Z-Ebenen. Maßstabsbalken, 19 um..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Unter Verwendung dieses Ansatzes für die ex vivo Analyse der Antipilz-Aktivität der Makrophagen in vivo zusammen mit Pilz Herausforderung, die wir früher gezeigt, dass NADPH-Oxidase in Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr gegen A. 4 fumigatus. Die Verwendung von isolierten Alveolarmakrophagen ermöglicht es uns, auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen in vivo zu konzentrieren.
Verschiedene Visualisierungs Strategien sind verwendet worden, um Makrophagen-Antipilzaktivität in vivo und ex vivo zu evaluieren. Luther et al., Konfokale Mikroskopie verwendet, um die Phagozytose von Aspergillus Sporen durch menschliche (von Lungentransplantierten geerntet) und Maus-BM 12 studieren. Geunes-Boyer et al. dadurch die Interaktion zwischen Candida krusei und murine Makrophagen nach Phagozytose. Sieverwendet eine Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 und primären Makrophagen aus dem Peritoneum 13. Garcia-Rodas et al. zeigten, daß Surfactant-Protein-D bindet und erleichtert die Phagozytose und das Überleben von Cryptococcus neoformans 14. SP-D-Bindung wurde auch in vivo unter Verwendung von SP-D untersucht - / - Mäusen intranasal mit Alexa Fluor 488-markierten C beimpft neoformans. Nach Lungenspülung wurden AMs immunofluorescently beschriftet und konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um die Phagozytose zu analysieren.
Makrophagen aus verschiedenen anatomischen Stellen (z. B. alveoläre, Milz, peritoneale), mit unterschiedlichen Stimuli (zB Thioglycollat Erhebung oder in vitro-Differenzierung) erzeugt wird, oder aus Zelllinien (beispielsweise RAW 264.7) dramatisch unterschiedliche antimikrobielle und Entzündungsreaktionen haben 15 - 18. Deshalb, um am nächsten modellieren die Wirtsreaktion auf inhalierte Spaßgi, nutzten wir Alveolarmakrophagen von BAL aus nicht-stimulierten Mäusen geerntet unmittelbar nach der Tötung.
Zunächst haben wir Live-Cell-Imaging Makrophagen antimykotische Aktivität 4 bewerten. Alveolarmakrophagen wurden in Kammerobjektträger aus Glas überzogen dann ausgesät mit GFP-exprimierenden Aspergillus. Nach 3 Stunden wurden nicht-phagozytierten Konidien durch schonendes Waschen entfernt, um freie Visualisierung von phagozytierten Konidien ermöglichen. Konidienkeimung wurde dann von Zeitraffer-Bildgebung bei 30-Minuten-Intervallen mit hellen Lichtbilder auf Makrophagen und GFP-Fluoreszenz sichtbar zu machen, um Pilze zu visualisieren überwacht. Dieses Verfahren hat den Vorteil der Erfassung aufeinanderfolgenden Bildern desselben primären Zellkultur. Jedoch die Tendenz, dass die Makrophagen, um über das Sichtfeld im Laufe der Erfassung für eine eher qualitative als eine quantitative Beurteilung der conidiocidal Aktivität erlaubt migrieren. Ein weiterer Nachteil der Live-Cell-Imaging ist ter Mangel an Klarheit und Detail als Zellen in und aus der Fokusebene zu bewegen.
Um Bilder mit mehr Details zu erhalten, haben wir uns für die konfokale Mikroskopie, die die Rekonstruktion der dreidimensionalen Strukturen von den erhaltenen Bilder ermöglicht. Dreidimensionale Rekonstruktion die Möglichkeit gibt, zwischen Hyphen herum wachsen und nicht in oder durch einen Makrophagen zu differenzieren. Mit dieser Fähigkeit, die Zellen und Pilzen in drei Dimensionen zu sehen, ist die Entfernung von nicht-phagozytierten Konidien bei 3 h nicht länger ein notwendiger Schritt. Konidien können auch genau unterschieden als intrazelluläre gegenüber extrazellulären sein.
Für eine verbesserte Visualisierung wurden alveolare Makrophagen in vivo mit PKH26 markiert. Diese fluoreszierende Farbstoff eine lange aliphatische Schwanz, die stabil integriert in den Lipidregionen der Zellmembranen. Wenn es intravenös injiziert wird, diese lipophile Farbstoff von phagozytierenden Zellen sowohl in den Blutkreislauf und im Gewebe gemacht. Nach 10 Tagen labegeführt Phagozyten aus murinen Kreislauf entfernt und bleiben nur in den Geweben 9, so dass für die Sammlung von bereits markierten Alveolarmakrophagen von BAL. Mit der Verwendung von in-vivo-Markierung, nach der Ernte Manipulation von Alveolarmakrophagen wird minimiert.
Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung eines GFP-exprimierenden A. fumigatus-Stamm. Dieser Pilz drückt GFP aus der Konidienstadium durch die Hyphen-Bühne und hat keine Notwendigkeit für eine weitere Färbung. Mit Dual-Färbung von Makrophagen und Aspergillus, können wir phagozytierten Konidien identifizieren.
Ein begrenzender Faktor in diesem Protokoll ist die Makrophagen-Ausbeute aus der BAL. Eine typische Ausbeute aus einer nicht-stimulierten Maus ist im Bereich von 3-5 x 10 5 Alveolarmakrophagen, aber diese Zahl kann stark variieren, basierend auf Faktoren wie Größe der Maus, Erfahrung der Person, die die Spülung und die Anzahl der Instillationen der Lavage GrippeID und das Volumen von Lungen entnommen. In diesem Protokoll wird Lungenspülung mit geschlossenem Brusthöhle, die zusammen mit 1 ml wiederholt Instillationen hilft, die Zellausbeute zu erhöhen im Vergleich zu einem offenen Brusthöhle und weniger Instillationen geführt. Maus-Nummern können ebenfalls erhöht, um Ernteerträge zu erhöhen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Institute of Allergy and Infectious Disease Zuschuss R01AI079253 (BHS) unterstützt und von der National Cancer Institute Cancer Center Support Grants CA016056 nach Roswell Park Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4Cl | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 G x 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| Insulin syringes | |||
| 6 ml Syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| Suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 μm Cell strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell culture incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22 x 22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6-well Cell culture plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
