Summary
Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.
Abstract
Akciğer konak hücreler rutin mikropların ve mikrobiyal ürünlere maruz bir arayüz. Alveoler makrofajlar inhale mantar ve diğer mikropları karşılaşmaya ilk basamak fagositik hücrelerdir. Makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, patojen tanıyan reseptörler ile Aspergillus motifleri tanımak ve alt-enflamatuar cevap başlar. Phagocyte NADPH oksidaz reaktif oksijen ara ürünleri (ROI) üretir ve konak savunma için önemlidir. NADPH oksidaz kritik olmasına rağmen nötrofil aracılı konakçı savunması için 1-3, makrofajlarda NADPH oksidaz önemi iyi tanımlanmış değildir. Bu çalışmanın amacı A'ya karşı konak savunmasını arabuluculuk makrofajlarda NADPH oksidaz belirli bir rol tasvir oldu fumigatus. Biz, alveoler makrofajlar içinde NADPH oksidaz fagosite A. büyümesini kontrol bulundu fumigatus 4 sporlar. Burada, fare yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem tariffagosite Aspergillus sporlar (conidia) büyümesini kontrol etmek için lveolar makrofajlar (AMS). Alveol makrofajlarının, in vivo olarak, lekeli ve on gün sonra, bronkoalveoler lavaj (BAL) ile farelerden izole edilmiştir. Makrofajlar, cam kapak slipleri üzerine plakalanmıştır, daha sonra yeşil floresan protein (GFP)-ifade eden A ile tohumlandı fumigatus sporlar. Belirtilen zamanlarda, hücreler sabitlenir ve fagosite sporlarla sağlam makrofaj sayısının konfokal mikroskobu ile tespit edilir.
Introduction
Alveoler makrofajlar inhale mikropları karşılaşmaya ilk basamak fagositik hücrelerdir. Makrofajlar, patojen tanıma reseptörleri tarafından Aspergillus motiflerini tanımak yemek ve teneffüs sporlar (konidia) büyümesini sınırlamak ve enflamatuar cevabı başlatabilir. Fagosit NADPH oksidaz, süperoksit anyon ve aşağı doğru, reaktif oksijen ara (ROI) moleküler oksijen dönüştürür. Kronik granülomatöz hastalık (ÇGD) ciddi bakteriyel ve fungal enfeksiyonlar ve aşırı inflamatuar yanıtlar ile karakterize NADPH oksidaz kalıtsal bir hastalıktır.
NADPH oksidaz kritik olmasına rağmen nötrofil aracılı konakçı savunması için 1-3, makrofajlarda NADPH oksidaz önemi iyi tanımlanmış değildir. Önceki çalışmalar nötrofiller esas hifal sahne 5 hedef ise alveolar makrofajlar, yemek ve Aspergillus sporlar öldürmek olduğunu göstermiştir. Ancak, çelişkili resul olmuşturA. büyümesinin kontrolünde makrofajda NADPH oksidaz rolüne olarak ts fumigatus 6, 7 sporlar.
Bu yöntemin amacı, bir ev sahibi savunma A'ya karşı aracılık makrofajlarda NADPH oksidazın belirli bir rolü olduğunu tanımlamak için fumigatus sporlar. Biz, alveoler makrofajlar içinde NADPH oksidaz fagosite A. büyümesini kontrol bulundu fumigatus 4 sporlar. En yakından inhale mantarlara konak yanıtı modellemek için, uyarılmamış farelerin hemen kurban aşağıdaki bronkoalveoler lavaj ile hasat alveol makrofajlar kullanılır. İzole Alveoler makrofaj kullanımı in vivo Aspergillus'a karşı savunmak, diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, işe nötrofiller) yokluğunda kendi antifungaldir odaklanmak sağladı. Bu yöntemde, alveolar makrofajlar hasat sonrası işleme miktarını en aza indirmek için hasattan önce in vivo olarak boyandı. '/ P>
Bu protokol için diğer bir avantajı, bir GFP-ifade A. kullanılmasıdır fumigatus suşu. Bu mantar hifal aşamasında konidial aşamasından GFP ifade ve daha fazla boyanma ihtiyacı yok. Daha ayrıntılı görüntüler elde etmek için, elde edilen görüntülerin üç boyutlu yapıların yeniden sağlayan konfokal mikroskopi seçti. Üç boyutlu rekonstrüksiyon hif bir makrofaj veya yoluyla çevresinde büyüyen ziyade ayırt yeteneği verir. Konidya ayrıca ekstraselüler karşı hücre içi gibi hassas ayırt edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada, hayvanlar üzerinde yapılan tüm işlemler Roswell Park Kanser Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve federal tüm devlet, uyulması ve Sağlık düzenlemeler National Institutes edildi.
1.. In vivo Makrofaj Etiketleme
Not: PHK26 (iv) intravenöz olarak uygulandığında dolaşımdan ve dokularda hem fagositik hücreler tarafından alınacak bir lipofilik boyadır. PKH26 makrofaj hasat sonrası işleme miktarını en aza indirmek için in vivo etiketlenmesi için kullanılmıştır. PKH-26 sabit bir şekilde uzun süreler boyunca alveolar makrofajlar biriken avantajına sahiptir. 10 gün uygulanmasından sonra bekleme PKH26 8, 9 sadece alveolar makrofaj kararlı biçimde ayrılan işaretli dolaşımdan her etiketli hücrelerin temizlenmesi için olanak sağlar. PKH26 uyarma (551 nm) ve emisyon (567 nm) özellikleri uyumlu olan kırmızı florokromla olduğunurodamin veya fikoeritrin algılama sistemleri ile. Herhangi bir etiketleme prosedürü canlılığı kaybı da dahil olmak üzere, paraziti tanıtabilirsiniz. Biz farklı fare genotipleri makrofajların etiketleme için aynı yaklaşım kullanmak Ancak, (örneğin, WT vs NADPH oksidaz eksikliği), bu eserlerin etkileri düzgün olur.
- PKH26 stok solüsyonu (etanol içinde 1 x 10 -3 M) üretici tarafından sağlanan seyreltici C 01:05 sulandırmak.
- Her bir fare için bir 1/2 ml insülin şırınga (29 G x 1/2 ") ile seyreltilmiş PKH26 yükleyin 100 ul.
- Hasat için en az 10 gün önce iv enjeksiyonu (kuyruk ven veya retro orbital ya) tarafından farelere yönetmek.
Bronchoalveolar Lavage 2. Hasat Alveoler Makrofajlar (BAL)
Bir deney için kullanılacak farelerin sayısı değişebilir. Bir uyarılmamış fareden tipik bir verim 3-5 x 10 5 alveolar makrofajlar aralığında, ancak bu sayı bas büyük ölçüde değişebilirbu lavaj yapan kişinin fare, deneyim boyutu ve lavaj sıvısı ve akciğer geri çekilen hacim instilasyon sayısı gibi faktörlere ed. Bu protokolde, akciğer yıkama tekrar 1 mi tabi tutulmuş yıkama sıvıları ile birlikte hücre verimini artırmak için yardımcı olan bir kapalı göğüs boşluğu ile gerçekleştirilir.
- Steril çözelti tutmak için aseptik koşullar kullanılarak avertin anestezik öldürücü bir doz (12.5 mg) intraperitoneal (ip) verilmesi ile fare Euthanize.
- % 70 etanol ile iyice fare sprey.
- Göğüs (Şekil 1A) açığa hayvanın kafatası ucundan cilt kaldırmak.
- Diyaframın hemen altında deri küçük bir kesim olun.
- Kesim içine parmağınızı yerleştirin ve uzak hayvan (Şekil 1A) kranial ucundan cilt çekin.
- Boynun ventral tarafı (Şekil 1A) uzanan kafasına hafifçe yukarıya doğru itilir.
- Göğüs kafesi ile küçük bir delik kestitoraks sağ tarafına akciğerlere söndürülmesi ve ayrıca aşağıdaki adımları sırasında akciğerlerin görüntülenmesine olanak vermek üzere.
- Trakea bulun ve dikkatle çevresi dokuları uzak teşrih.
- Kavisli bir forseps ile tükürük bezleri, sternohyoid kasları ve gırtlak vb çıkarın.
- Dikkatle kavisli bir forseps ile kaldırın ve makas ile yatan halkalı kıkırdak yapısını ortaya trakea (adventita) kapsayan ince dokuyu kesip.
- Trakea içine kateter yerleştirin.
- Kavisli bir forseps kullanarak, trakea (dorsal) arkasında bir sütür koyun ve açıklıktan 10 cm uzunluğa çekin.
- Krikoid (kıkırdak kalınlaşmış halka) Yukarıdaki başlayarak dikkatlice trakea göğüs kemiğinin arkasında kaybolur nerede durdurma trakea aşağı bir 22 G kateter kılavuz.
- Sıkıca oturması için trakea ve kateter çevresinde dikiş kravat. Kateter iğne çıkarılır.
- 4-yollu valf birleştirin.
- DoldurmakBir 6 ml DPBS,% 1 FBS ile şırınga ve Şekil 1B 'de gösterildiği gibi 4-yollu musluk ekleyin.
- 4-yollu vana (Şekil 1 B) üzerinde gösterilen konumda bir boş 6 ml şırınga takın.
- Kateter 4-yollu musluk (Şekil 1B) açık portu takın. Trakea kateteri çıkarmak için dikkatli olun.
- Akciğerlerden lavaj sıvısı toplayın.
Not: Müfettişler dokuya hasar olasılığını en aza indirmek için lavaj sıvısının düşük miktarlar kullanmayı tercih edebilir. Aynı yaklaşım, sürekli olarak, tüm fare gruplarının uygulanabilir önemlidir.- Böylece boş şırınga kapalı musluğu kolunu çevirin ve yavaş yavaş akciğerleri şişirmek için ~ 1 ml DPBS,% 1 FBS enjekte. Adım 2.4 delik kesme yoluyla akciğer enflasyonu gözlemleyin.
- Akciğerleri overinflate için değil dikkatli olun.
- Tam şırınga kapalı böylece musluğu kolunu açın ve dikkatlice grip çekilme akciğerlerden gelen kimliği.
- Akciğerler Adım 1.4 delik kesim aracılığıyla Söndür gözlemleyin. Kateter iyi bir beraberlik almak için biraz ileri veya geri hareket edilmesi gerekebilir. Trakea içinde kateteri tutmak için özel önlem alın.
- Tekrar FBS% 1 enjekte ve akciğerlerden çekilmiş olan tüm DPBS'de kadar 2.8.1-2.8.4 5-6x adımları. Not: akciğer sıvısının kurtarma enjekte edilen sıvının% 100 olmayacaktır.
- 50 ml konik tüp içine lavaj sıvısı ile boş şırınga. Oda sıcaklığında hücrelere tutun.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler ve süpernatant Pelet dökün. İstenirse bu sitokin analizi için kaydedilebilir.
- % 10 FBS ile 1-5 ml RPMI 1640 hücreleri tekrar süspansiyon ve menositometrede saymak. Uyarılmamış fare olarak, BAL ile hasat hücrelerin>% 95 sitolojisi ile teyit edilebilir makrofajlar, olması beklenmektedir.
3.. Kültüre ve Hasat Mantar
"> Bu protokolde kullanılan Aspergillusfumigatus kendi yaşam döngüsünün tüm aşamalarında GFP ifade:. Sporlar, germlings ve hif Bu mantar gerginlik Dr Margo Moore, Simon Fraser Üniversitesi, Vancouver, BC, Kanada tarafından sağlandı.- Kloramfenikol (0.05 g / L) ve gentamisin (0.5 g / L) ile yatık Sabouraud agar beyin kalp infüzyon (BHI) üzerine, GFP ifade eden bir Aspergillus fumigatus soyu Levha conidia.
- Gevşek olarak oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca kapatılmış karanlıkta inkübe edin.
- DPBS içinde% 0.01 Tween 20 içinde 10 ml yıkama eğik Hasat conidia. Hafifçe gevşetmek için stripette ile mantar kazıyın. Verimi artırmak için Eğimli birkaç kez durulayın.
- 50 ml konik içine 100 mikron hücre süzgecinden konidial süspansiyon geçmektedir.
- 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile pelet conidia.
- Süspanse 50 ml DPBS'de konidya ve Hemasitometre kullanarak saymak.
- DPBS ile iki kez yıkanır ve arzu edilen konsantrasyon, seyreltinyon.
4. Mantar Mücadelesi ve Konfokal Mikroskopi
Konak savunmasında makrofaj NADPH oksidaz rolünü araştırmak için, fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol etmek için üç genotip farelerden izole alveoler makrofaj kabiliyeti değerlendirildi. Bu çalışmada kullanılan genotipleri arasında; Doğal olarak meydana gelen mutasyona Ncf1 (Ncf1 olanağına NADPH oksidaz den yoksun bırakarak p47 pHOx, fagosit NADPH oksidaz gerekli bir bileşeni) için kodlayan ve 3) Ncf1 * / 1), vahşi tip fareler, 2) Ncf1 / * Mn-farenin * Mn + transjenik farenin NADPH oksidaz aktivitesi monosit / makrofaj nüfus 10, 11 içinde yeniden edilmiştir (MN insan CD68 promotörünün kontrolü altında yabani tip Ncf1 barındıran transgeni ifade eder.)
Konfokal mikroskopi en nedeniyle varlığı Bu deneme için uygundurve slaytlarda olmayan fagosite Konidyumların büyüme. Konfokal mikroskop Z-ekseni içinde bireysel uçaklarının görselleştirme için izin ve makrofaj içeride ziyade çevresinde büyüyen mantar arasındaki farklılaşmayı sağlayacak. Tüm konfokal görüntüler 63X immersiyon yağı lens kullanılarak elde edilir. Z-yığınlar 2.5 elektronik zum faktörü ile elde edilir. Z-yığın kalınlığı alanın üst ve alt kısmını için DAPI ve parlak saha görüntüleri kullanılarak belirlenir. Z-yığınlar ~ 1 mikron kalınlığında 14 bireysel dilimleri ile 24 mikron arasında değişmektedir. Makrofaj ölçümü için, 1X elektronik zum tek taramalar genotipi için 10 alanları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bozulmamış makrofajlar, sırasıyla PKH26 ve membran ve çekirdeğin DAPI lekelemesi göre tespit edilmiştir. Konidya FITC ifadesi ve parlak bir alan görüntüye göre belirlenmiştir.
- Steril lamelleri ve tabak hazırlayın
- Bir Biyolojik Güvenlik Kabinesi altında,% 70 etano 22 x 22 mm cam lamelleri emmek5-10 dakika için l.
- Steril PBS lamelleri durulayın.
- Steril forseps kullanılarak, yumuşak, tek başına steril paketlenmiş 6 oyuklu plakanın her bir alt tek bir lamel yerleştirin.
- Tohum ~ 1 x 10 6 PKH26 her bir lamel üzerine alveolar RPMI 1640 300 ul içerisinde süspansiyon haline makrofajlar,% 10 FBS etiketli hasat edildi. Tam sayı hasat verimi bağlı olarak değişebilir.
- Makrofaj gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilerek uygun izin verin.
- Sonraki sabah, yaklaşık 1 x 10 7 GFP-ifade A. eklemek fumigatus conidia 100 ul önceden ısıtılmış (37 ° C) RPMI 1640,% 10 FBS içinde süspanse.
- % 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör plaka dönün.
- Hücreler, 4 ° C'de ya da gece boyunca oda sıcaklığında 2 saat arasında, en az sabit olmalıdır Eşit her bir% 2 formaldehit hacmi de (nihai konsantrasyon% 1 formaldehit) ilave edilerek 3, 7 ve 14 saat düzeltme hücre. Için yer plakalarıgece boyunca 4 ° C 'de, erken zaman noktalarında. Son zaman noktasında (14 saat) için, 2 saat boyunca oda sıcaklığında hücreleri saptamak.
- Fiksasyon sonra, yavaşça forseps kullanarak lamelleri kaldırmak ve DPBS'de durulayın.
- Katlanmış Kimwipe lamel kenarına koyarak fazla sıvıyı çıkarın.
- Bir cam mikroskop lamı DAPI ile 6 ul floresan montaj orta uygulayın.
- Slayt üzerinde lamel bir kenarını yatırın ve yavaşça montaj ortama hücre aşağı tarafı bırakın. Orta montaj yayılmış ve lamel altında düz bir tabaka oluşturacak. Lamel basın gerek yoktur.
- Şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarları mühür ve kurumaya bırakın.
- Mağaza konfokal mikroskopi ile analiz etmek için hazır olana kadar oda sıcaklığında (ışıktan korunarak) slayt kutu içinde hazırlanan slaytlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stimüle edilmemiş farelerden BAL ile alveolar makrofajlar Toplama sitoloji göre bir>% 95 saf bir nüfus neden olur. 3 ve 7 saat (Şekil 2) saat puan fungal büyümenin hipal aşamasını önüne ve genotipler arasında konidia fagositik etkinliğinin karşılaştırılmasına olanak sağlar. Genotipleri doku invazif hipal aşamasına fagosite konidianın geçişi (Şekil 3) inhibe etme yeteneği ile ilgili karşılaştırılabilir burada 14 saat bir zaman noktasıdır. Bozulmamış makrofaj sırasıyla membran ve çekirdeğin PKH26 ve DAPI lekelemesi, (Şekil 2 ve 3) göre konfokal mikroskobu ile tespit edilebilir. Konidya ve hifler GFP (Şekil 2 ve 3) göre tespit edilir.
iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
Şekil 1.. Anatomik Yön Kaynaklar ve 4-Yollu Musluk. A), bir fare için anatomik yönlü referanslar gösterilir. Kaudal kuyruk yönünde iken kranyal, başın yöndedir. Sırt tarafında veya arka hayvan. B) 'nin üst yüzeyi 4-yollu musluk üç luer bağlantısı vardır ve bir sapa doğru iken bir dörtayaklı ventral tarafı, göbek ya hayvanın alt yüzeyine doğru olduğunu, dönerken 360 ° musluğu sayesinde sıvıların akışını yönlendirmek için. Boş şırınga, tam şırınga ve kateter yerleştirme belirtilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
A. Şekil 2. Fagositoz fumigatus sporlar 7 saat sonra genotip arasında benzerdir. (A), vahşi tip (B) Ncf1 / * Mn +, ve (C, fagosite konidia büyümesini sınırlamaya NADPH oksidaz etkinliği olan izole edilmiş alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek ) Ncf1 * / * Mn - farenin iv PKH26 uygulanmıştır. Alveol makrofajlarının, 10 gün sonra BAL ile hasat edilmiş ve GFP-ifade eden A conidia ekilmiştir fumigatus. Hücreler, 3, 7 de sabit ve 14 saat konidia ilave edildikten sonra edilmiştir. 3 At (veriler gösterilmemiştir) ve 7 saat, toplam makrofaj sayısı ve makrofaj ≥ 1, her ikisi de benzer fagositoz verimini yansıtarak Üç grup arasında benzerdi konidyalarını (oklar) fagosite. Bozulmamış makrofajlar PKH26 (kırmızı) ve DAPI membran a (mavi) boyama göre tanımlanırsırasıyla nd çekirdekler. Tek bir Z-düzleminden Fluoresans görüntüleri parlak alan görüntü ile üst üste. Aydınlık alan görüntüsü tüm numune boyunca iletilen ışık oluşur ve floresan Z-ova üzerine örtülür nedenle zaman tüm Z-yığını içindeki hücrelerin ve Konidyumların görselleştirme sağlar. Ölçeği bar, 19 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Makrofaj NADPH oksidaz A'nın büyümesini kontrol etmek için gerekli olan . (A, D) fumigatus'a sporlar mikroskopisi vahşi tip, (B, E) Ncf1 * / * Mn +, ve (C, F) Ncf1 * / * Mn - < GFP + A. tohumlamadan sonra 14 saatte / sup> alveol makrofaj fumigatus konidya. Bozulmamış makrofajlar, sırasıyla PKH26 (kırmızı) ve DAPI membranlar ve çekirdeklerin (mavi) boyama, göre belirlenmiştir. Katı oklar en az bir fagosite konidi ve içi boş oklar hiflere işaret bozulmamış makrofajlar göstermektedir. En az 1 ile çok sayıda AMs conidia vahşi tip ve Ncf1 / * Mn + hücreleri ile gözlendi fagosite değil, NADPH oksidaz eksikliği olan hücrelerle. Hif GFP sinyal değişken tüm Z-yığını içindeki hücrelerin görselleştirme ve hifaları etkinleştirmek parlak bir alan görüntü ile bir tek Z-düzlemden. AC) Floresan görüntüleri gösterilen z-yığılmış görüntü düzleminde dayanmaktadır. DF) Floresan görüntüleri Tek bir Z-düzleminden parlak saha arka plan olmadan hücrelerin tespit edilmesine olanak değil, farklı Z-düzlemlerde mantar hücreleri ve uzamsal ilişkileri. Ölçeği bar, 19 mikron..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birlikte in vivo fungal okuma ile makrofaj antifungal aktivitenin ex vivo analiz için, bu yaklaşımı kullanarak, daha önce makrofajlarda NADPH oksidaz A'ya karşı savunmasında önemli bir rol oynadığını göstermiştir fumigatus 4. Izole alveolar makrofaj kullanılması, in vivo olarak Aspergillus karşı savunmak için diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, nötrofiller işe) yokluğunda, mantarlarla mücadele etkinlikleri odaklanma sağlamaktadır.
Çeşitli görselleştirme stratejiler in vivo ve ex vivo olarak makrofaj antifungal faaliyeti değerlendirmek için kullanılmıştır. Luther ve diğ., Insan (akciğer transplant alıcılarında hasat) ve fare AM'ler 12 ile Aspergillus konidyalarının fagositozunu incelemek için konfokal mikroskobu kullandılar. Geunes-Boyer ve ark. fagositoz aşağıdaki Candida krusei ve murin makrofaj arasındaki etkileşimi ile karakterize edilir. OnlarBir makrofaj hücre hattı, RAW264.7 ve periton 13 birincil makrofaj kullanılır. Garcia-Rodas et al. yüzey aktif protein-D bağlanan ve Cryptococcus neoformans 14'ün fagositoz ve hayatta kalma kolaylaştırır gösterdi. SP-D bağlayıcı da SP-D kullanılarak in vivo araştırılmıştır - / - burun Alexa Fluor 488-etiketli C ile aşılanmış farenin neoformans. Akciğer lavajı takiben AMs immunofluorescently etiketlenmiş ve konfokal mikroskopi fagositoz analiz etmek için kullanıldı.
Farklı uyaranlara (örneğin tioglikolatın ldıktan veya in vitro farklılaşma) üretilen farklı anatomik siteleri (örneğin alveoler, dalak, periton), makrofajlar, veya hücre hatları (örneğin, RAW264.7) önemli ölçüde farklı antimikrobiyal ve enflamatuar cevapları 15 olabilir - 18. Bu nedenle, en yakın inhale eğlenceli konak yanıtı Modelegi, hemen kurban aşağıdaki uyarılmamış farelerden alınan bronkoalveoler lavaj ile hasat alveol makrofajlar kullanılır.
Başlangıçta biz makrofaj antifungal etkinliği 4 değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme kullanılır. Alveolar makrofaj bölmeli cam slaytlar olarak kaplama daha sonra da 3 saat sonra, non-fagosite conidia fagosite konidianın engelsiz görselleştirme izin vermek için yumuşak bir yıkama yoluyla uzaklaştırılmıştır. Aspergillus ifade GFP ile tohumlandı. Konidyal çimlenme sonra mantarları görselleştirmek için makrofaj ve GFP floresan görselleştirmek için parlak ışık görüntüleri kullanarak 30 dakika aralıklarla time-lapse görüntüleme ile izlenmiştir. Bu yöntem, aynı birincil hücre kültürünün ardışık görüntü elde etme avantajına sahiptir. Bununla birlikte, makrofaj için eğilimi oldukça conidiocidal aktivitesinin kantitatif değerlendirmesi daha nitel için izin verilen satın alma sırasında bakış alanı üzerinde geçirilecek. Canlı hücre görüntüleme bir diğer dezavantajı tnetlik ve detay o eksikliği hücreleri odak düzlemi içinde ve dışında hareket olarak.
Daha ayrıntılı görüntüler elde etmek, elde edilen görüntülerin üç boyutlu yapıların yeniden sağlayan konfokal mikroskopi seçti. Üç boyutlu rekonstrüksiyon hif bir makrofaj veya yoluyla çevresinde büyüyen ziyade ayırt yeteneği verir. Üç-boyutlu hücreleri ve mantar görüntülemek için bu yeteneği ile, 3 saat non-fagosite Konidyumların çıkarılması artık gerekli bir adımdır. Konidya ayrıca ekstraselüler karşı hücre içi gibi hassas ayırt edilebilir.
Gelişmiş görüntüleme için, alveolar makrofaj PKH26 ile in vivo olarak etiketlenmiştir. Bu floresan boya stabil olarak hücre zarlarının lipid bölgelere içeren bir uzun alifatik bir kuyruğu vardır. Intravenöz olarak enjekte edildiğinde, bu boya lipofilik kan ve dokularda hem fagositik hücreler tarafından alınır. 10 gün, labe sonraled fagositlerdir kemirgen dolaşımdan temizlenir ve BAL ile zaten etiketli alveol makrofaj toplanması için izin dokularda 9 sadece kalır. In vivo etiketleme, alveoler makrofajlar hasat sonrası manipülasyon kullanımı minimize edilmiştir ile.
Bu protokol için diğer bir avantajı, bir GFP-ifade A. kullanılmasıdır fumigatus suşu. Bu mantar hifal aşamasında konidial aşamasından GFP ifade ve daha fazla boyanma ihtiyacı yok. Makrofaj ve Aspergillus ikili boyama ile, biz fagosite konidyalarını tespit edebiliyoruz.
Bu protokolde bir sınırlayıcı faktör BAL gelen makrofaj verim. Bir uyarılmamış fareden tipik bir verim 3-5 x 10 5 alveolar makrofajlar aralığında, ancak bu sayı örneğin lavaj yapan kişinin fare, deneyim boyutu ve instilasyon sayısı gibi faktörlere bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir lavaj gripid ve akciğerlere çekilen hacmi. Bu protokol, akciğer lavaj tekrar 1 mi instilasyon ile birlikte bir açık göğüs boşluğu ve daha az instilasyon ile karşılaştırıldığında hücre verimini artırmak için yardımcı olan bir kapalı göğüs boşluğu ile gerçekleştirilir. Fare numaraları hasat verimi arttırmak için arttırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü Hibe R01AI079253 (BHS için) tarafından desteklenen edildi ve Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek Hibe CA016056 tarafından Roswell Park Kanser Enstitüsü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4Cl | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 G x 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| Insulin syringes | |||
| 6 ml Syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| Suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 μm Cell strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell culture incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22 x 22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6-well Cell culture plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
