Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Situ Påvisning af autoreaktive CD4 T-celler i hjernen og hjertet Brug hovedhistokompatibilitetskompleks klasse II Dextramers

doi: 10.3791/51679 Published: August 1, 2014

Summary

Protokollen til påvisning selvnedbrydende CD4 T-celler i hjernen og hjertet ved direkte farvning med større histokompatibilitetskompleks klasse II dextramers er blevet beskrevet i denne rapport. For omfattende analyse, en pålidelig metode til at opregne de frekvenser af antigen-specifikke CD4 + T-celler i situ også udtænkt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Anvendelse af større histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse II tetramerer til påvisning af antigen-specifikke CD4-T-celler har været en udfordring 1-7. For at forbedre afsløring følsomhed MHC klasse II tetramers har forskerholdet skabt næste generations tetramere udpeget "dextramers" 8. Dextramers indeholder dextran rygrade hvor flere streptavidin-fluoroforen dele er konjugeret, således at adskillige peptid-bundne, biotinylerede MHC-monomerer kan være knyttet til en dextranmolekyle 9. Således kan store aggregater af MHC dextramers som indeholder flere MHC-peptid-komplekser interagerer med flere T-cellereceptorer (TCR'er).

Denne gruppe nyligt genererede dextramers for forskellige selvantigener og viste, at påvisning følsomhed dextramers var cirka fem gange mere end tetramere 8. De eksperimentelle systemer omfatter eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) induceret med proteolipidprotein (PLP) 139-151 i SJL-mus; EAE induceret med myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG) 35-55 i C57BL / 6 mus; og eksperimentel autoimmun myocarditis (EAM) induceret med kardial myosin tung kæde-α (MyHC) 334-352 i A / J-mus. Denne undersøgelse viser anvendelsen af PLP 139-151 - og MyHC 334-352 dextramers at detektere antigenspecifikke CD4 T-celler in situ med specificitet ved at udvikle en direkte farvningsprotokol, hvorved behovet for at forstærke signalerne fra at bruge fluoroforen antistoffer, en nærmer almindeligvis anvendes med brug af tetramerer. Derudover har en omfattende metode til at evaluere væv også blevet udtænkt til pålideligt opregne de frekvenser af antigen-specifikke CD4 T-celler i situ 10. Påvisning af antigen-specifikke T-celler in situ muliggør afgrænsning af begivenheder forårsaget af specifikke antigene stimuli fra dem, der forårsages af bystander-aktivering. Ligeledes in situ teknik også provides muligheder for at spore kinetikken af ​​antigen-specifikke T-celle infiltrationer i målorganer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etiske retningslinjer:

Alle animalske procedurer blev gennemført i overensstemmelse med de retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og godkendt af University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

1. Induktion af EAE

  1. For at inducere EAE forberede peptid / komplet Freunds adjuvans (CFA) emulsion som beskrevet i 11 med de følgende modifikationer: Trin 1.1:. Forberede PLP 139-151 ved en koncentration på 1 mg / ml i 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) Trin 1.4:. bruge 200 pi CFA emulsion indeholdende 100 ug PLP 139-151 per dyr Trin 1.4.1: at immunisere ti dyr, fremstilles 2 ml emulsion ved at blande 1 ml PLP 139-151 (1 mg / ml i 1x . PBS), og et lige volumen af CFA Trin 1.5: injiceres 200 pi emulsion i opdelte doser subkutant i de to ingvinale områder (~ 75 ul hver) og brystbenet (~ 50 ul) af fem til seks uger gamle FEMAle SJL / J-mus. Trin 1.7 og 1.8 gælder ikke for induktion af EAE.

2.. Klinisk Scoring af EAE Mus og høst af Cerebrums

  1. Overvåg dyr til forekomst af kliniske tegn, og score den sygdoms-sværhedsgraden dagligt fra dag 9 postimmunisering som følger: 0 - sund; 1 - slatne hale eller bagbenssvaghed men ikke begge; 2 - slatne hale og bagben svaghed; 3 - delvis lammelse af bagbenene; 4 - fuldstændig lammelse af bagbenene; 5 - er døende eller døde 12.
  2. Aflive mus, når de når en neurologisk score på 3 eller 4 ved hjælp af CO 2. At aflive mus, pre-fylde dødshjælp kammer først med CO 2 ved at dreje på regulator af CO 2 tank højst 6 psi, og tillade, at dyr at holde sig inden i kammeret i ca 5 min for at opnå fuldstændig asfyksi. Soak aflivet dyr i 70% alkohol. Umiddelbart placere dyrene på en absorberende pude og ved hjælp af et par af sterilt iceps og sakse afsløre hjerter ved at skære gennem brysthulen. Punktere de rigtige bladflige og perfuse ved at injicere 10 ml kold 1x PBS i venstre ventrikler hjerter.
  3. Udgrave kraniet ved snipping kraniet i en cirkulær måde ved hjælp af et par krumme saks, og omhyggeligt, flip kraniet knogler med en pincet. Harvest hjernen ved stump dissektion og bruge en ren skalpel, separat cerebrum fra lillehjernen. Placer cerebrum i et rør indeholdende kold 1x PBS og efterlade røret på is indtil forarbejdning.

3.. In Situ Farvning af cerebrale med MHC klasse II (IA r) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Forbered 4% PBS-buffer lavtsmeltende agarose, smelter ved opvarmning til 50 ° C og lade den stå i et 40 ° C vandbad, indtil brug.
  2. Placer cerebrum i en engangs dyb bund skimmel histologi kassetten holdes over is, og hæld smeltet (40 ° C) agarose. Umiddelbart trykke cerebrum forsigtigtmed en pincet til at oversvømme vævet. Lad kassetten på is i 15-20 min, indtil størkningen er fuldstændig.
  3. Fyld vibratome bad med kølet 1x PBS. Fyld rummet omkring vibratome bad med isterninger til at holde temperaturen af ​​PBS mellem 0 og 2 ° C. Løs et rent barberblad i vibratome og sæt klingen vinkel til 15 °.
  4. Placering af væv i vibratom. Trim overskydende agarose fra alle sider indlejret væv og lidt udsætte den ventrale overflade af cerebrum.
    1. Smør vibratome vævsblok med superlim og overføre agarose-indlejret væv i den limede overflade ved at anbringe den eksponerede ventrale overflade af cerebrum over lim til tværgående skæring. Flyt ikke vævet, når vævet er sat over blokken.
    2. Anbring vibratome blokken med agarose-embedded væv på is, og lad limen tørre i 15 min.
  5. I mellemtiden placere væv chammer én pr brønd af en 24-brønds plade. Fyld brøndene indeholdende vævskamre med 1 ml kold 1x PBS og forlader pladen på is.
    1. Forbered vævskamre ved at fastgøre et tyndt nylonnet på cut-enden af ​​en pipette 25 ml polypropylen hjælp superlim; efter trimning overskydende maske omkring pipetten, skæres pipetten til en længde på 1 cm fra masken.
  6. Sænk vibratome klinge til niveauet af den øvre overflade af vævet; indstille vibratome hastighed til 0,22 mm / sek og begynde skæring med en fremadgående bevægelse til at gøre 200 um tykke snit. Overfør en cerebral sektion per brønd ved hjælp af en vandfarve blød børste ind i vævskamre anbragt i brøndene i en 24-brønds plade. Hold pladen på is indtil skæring er fuldført for at forhindre vævsnedbrydning. Bemærk: Følg disse trin for at få i alt, tre parrede sektioner fra tre forskellige områder af hjernen dorsale til den ventrale overflade (Figur 2). Én sektion frahvert par (i alt tre sektioner) anbringes i tre individuelle vævskamre er udpeget til farvning med specifikke dextramers (IA s / PLP 139-151) og anti-CD4. Ligeledes er et andet sæt af tre sektioner, der er placeret i tre individuelle vævskamre udpeget til farvning med kontrol dextramers (IA s / TMEV 70-86) og anti-CD4.
  7. Overfør tre vævskamre indeholder sektionerne udpeget til farvning med specifikke dextramers i tre brønde i en 24-brønds plade med et kammer pr brønd, hvori 300 pi af en cocktail indeholdende allophycocyanin (APC)-konjugerede PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) og anti-CD4-phycoerythrin (PE, 5 ug / ml) i blokerende opløsning (1x PBS med 2% normalt gedeserum) er tidligere blevet tilsat. Dæk brøndene med et låg.
  8. Ligeledes overføre tre vævskamre indeholder afsnittene udpeget til farvning med kontrol dextramers i tre brønde i en 24-brønds plade med et kammer pr vill, hvor der blev 300 pi af en cocktail, der indeholder APC-konjugeret TMEV 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) og anti-CD4-PE (5 ug / ml) i blokerende opløsning tilføjet tidligere. Dæk brøndene med et låg. Bemærk: Se Massilamany m.fl., 8 for udarbejdelse af dextramers, og de ​​dextranmolekyler at forberede dextramers blev venligst leveret af Immudex, København, Danmark..
  9. Mærk brøndene, og wrap pladen med alufolie og læg pladen på en gyngende platform indstillet til blide rotationer i 1,5 time i mørke ved stuetemperatur.
  10. Efter inkubationsperioden vaskes vævssnit på vippeplatform ved at overføre vævskamre til en frisk brønd indeholdende 1 ml kold 1x PBS og undgå drible indholdet af en brønd i den anden. Gentag vask tre gange, så mindst 10 min per vask. Sørg for, at vævssnit ikke bliver tørret, da de kan holde sig til siderne af kammeret.
  11. Fix afsnittene ved at overføre væv chammer i en frisk brønd i 24-brønds plade indeholdende 1 ml filtreret 4% PBS-bufret paraformaldehyd (pH 7,4) på ​​en vippende platform i 2 timer med blide rotationer.
  12. Gentag vask tre gange som beskrevet i trin 3.10.
  13. Placer de farvede og faste sektioner på en ren mikroskopisk dias ved hjælp af en akvarel blød børste. Tør overskydende vand uden at røre sektion, og monter sektion hjælp montage medium. Dæk med en mikroskopisk dækglas og lade dias til tørre ved RT O / N i det mørke rum.
  14. Opbevar dias i en lys-bevis slide opbevaringsboks ved 4 ° C.

4.. Induktion af EAM og Indsamling af Hjerter

  1. Inducere EAM som beskrevet i reference 11.
  2. Aflive mus på dag 21 efter immunisering med rent kammer monteret med CO 2-gasflaske, og nyd dyrene i 70% alkohol. Umiddelbart placere dyrene på en absorberende pude, og ved hjælp af en pincet og saks udsættes hjertets ved at skære gennem brysthulen. Punktere de rigtige bladflige og perfuse ved at injicere 10 ml kold 1x PBS i venstre ventrikler hjerter. Saml hjerter og sted i rør indeholdende kold 1x PBS.

5.. In Situ Farvning af Heart Afsnit med MHC klasse II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers

  1. Forbered 4% PBS-buffer lavtsmeltende agarose, smelter ved opvarmning til 50 ° C og lade den stå i en 40   ° C vandbad indtil brug.
  2. Placer hjerte i en engangs dyb bund skimmel histologi kassette holdt på is, og hæld smeltet 40 ° C agarose indtil vævet er helt nedsænket, som beskrevet i trin 3.2.
  3. Følg trin 3.3.
  4. Trim overskydende agarose fra alle sider indlejret væv og lidt udsætte bunden af ​​hjertet. Smør vibratome vævsblok med superlim og overføre agarose-indlejret væv i den limede overflade ved at anbringe den eksponerede overflade afhjerte over lim. Flyt ikke vævet, når vævet er sat over blokken.
    1. Anbring vibratome blokken med agarose-embedded væv på is, og lad limen tørre i 15 min.
  5. Følg trin 3.5 og 3.6.
  6. Overfør Hjertesektioners hjælp af en vandfarve blød børste ind i vævskamre anbragt i brøndene i en 24-brønds plade. Hold pladen på is indtil sektionering er fuldstændig at forhindre nedbrydning af væv. Bemærk: Følg disse trin for at opnå i alt otte parrede sektioner fra spidsen til bunden af hjertet (figur 2). Placer alle sektioner i vævskamre, tildele op til 3 sektioner pr kammer. Én sektion fra hvert par (i alt otte afsnit) er beregnet til farvning med specifikke dextramers (IA k / MyHC 334-352) og anti-CD4. Ligeledes er et andet sæt af otte sektioner, der er udpeget til farvning med kontrol dextramers (IA k / RNase 43-56) og anti-CD4.
  7. Overførtre vævskamre indeholder sektionerne udpeget til farvning med specifikke dextramers i tre brønde i en 24-brønds plade med et kammer pr brønd, hvori, 300 pi af en cocktail, der indeholder APC-konjugerede MyHC 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) og anti-CD4-PE (5 ug / ml) i blokerende opløsning blev tilføjet tidligere. Dæk brøndene med et låg.
    1. Ligeledes overføres tre vævskamre indeholder sektionerne udpeget til farvning med kontrol dextramers i tre brønde i en 24-brønds plade med et kammer brønd i hvilket 300 pi af en cocktail, der indeholder APC-konjugeret RNase 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) og anti-CD4-PE (5 ug / ml) i blokerende opløsning blev tilføjet tidligere. Dæk brøndene med et låg.
  8. Mærk brøndene, og wrap pladen med alufolie og læg pladen på en gyngende platform indstillet til blide rotationer i 1,5 time i mørke ved stuetemperatur.
  9. Følg trin, 3,10-3,11
  10. Gentag vask thris som beskrevet i trin 3.10.
  11. Placer de farvede og faste sektioner (op til tre sektioner / slide) på et rent mikroskopisk dias ved hjælp af en akvarel blød børste. Tør overskydende vand uden at røre sektionerne, og montere dele med montage medium. Dæk med en mikroskopisk dækglas og lade dias til tørre ved RT O / N i det mørke rum.
  12. Opbevar dias i en lys-bevis slide opbevaringsboks ved 4 ° C.

6.. Analyse af Dextramer + (dext +) CD4 + T-celler ved Laser konfokal mikroskop (LSCM) (fælles for både hjerne og hjerte sektioner)

  1. Brug Nikon A1-Eclipse 90i konfokal mikroskop system for rutinemæssig scanning og erhvervelse af billeder. For at starte Klik åben, NIS Elements AR-software (version 4.13).
    1. Vælg "TRITC" og "Cy5" kanaler fra panelet. Excitation / emission bølgelængder henholdsvis for TRITC og Cy5-kanaler, 561,5 nm / 553-618 nm og 640,7 nm / 663-738 nm vises som standard.
    2. Tildel pseudocolors "grønne" og "røde" for TRITC (CD4-PE) og Cy5 (dextramer-APC) kanaler, hhv.
    3. Anbring dias, der skal undersøges på den mikroskopiske scene og fokusere manuelt under 100X forstørrelse. Indstil "HV" til 110 og offset til "0". Klik på "Focus", og juster "spænding" at optimere lasere.
    4. Klik på "Focus"; scanne afsnittet fra top til bund, og indstille niveauet "Z" for billede erhvervelse. Klik på "CH-serien" og hente billedet sekventielt. Identificer dext + CD4 + T-celler optræder som gule punktformig celler baseret på co-lokalisering af signaler genereret fra både rød (dextramers) og grøn (CD4) kanaler.
  2. Brug Olympus FV500-BX60 konfokal mikroskop for nem kvantitativ opregning af Dext + CD4 + T-celler. Til at begyndeklik åben, FluoView software (version 4.3).
    1. Vælg farvestoffer "Cy3" og "Cy5" fra drop-down menuen, og klik på "Anvend" for at indlæse de respektive lasere. Bemærk: excitation / emission bølgelængder til Cy3 (543 nm / pseudocolored "grønne" CD4-PE) og Cy5 (633 nm / pseudocolored "rød", dextramer-APC) kanaler.
    2. Anbring dias, der skal undersøges på den mikroskopiske slide, og fokusere manuelt under lav forstørrelse (4x eller 10x). Klik på "Focus", mens Cy3 laseren er tændt, og fokusere den inflammatoriske fokus.
    3. Ændre formålet til 100X forstørrelse. Indstil filstørrelsen til "512/512" fra drop-down menu. Klik på "Focus" og juster værdierne for "PMT", "Gain" og "Offset" parametre separat optimere lasere til Cy3 og Cy5.
    4. Klik på "Z scenen" og klik derefter på "Focus", mens begge lasere er på. Settykkelsen af ​​"Z scenen" ved at klikke på "op" og "ned" pile. Indstil "Z"-intervallet til 2 um.
    5. Klik på "Stop", og vælg "Seq123". Klik derefter på "XYZ" og begynde at optjene "Z"-serien billeder til det valgte område inden for inflammatoriske fokus. Gem "Z serielle billeder" som AVI-filer. For at spare billedfiler, skal du vælge billedet fra "Z serielle image" og derefter gemme som "tiff" format.
  3. Undersøg tre parrede sektioner fra cerebrum, hvor et sæt af tre sektioner blev farvet med IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 og det andet sæt af tre sektioner med IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 at udføre kvantitativ analyse.
    1. Ligeledes analysere otte parrede sektioner for hjerte, hvor der var et sæt af otte sektioner farves med IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 og en anden selvt af otte sektioner med RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Undersøg 10 til 15 inflammatoriske foci per sektion i cerebrum, og i hver fokus erhverve et sæt af 15 til 25 serielle billeder sekventielt.
    1. Undersøg alt 20 inflammatoriske foci fra alle otte sektioner af hjerte og fra hver fokus erhverve 10 til 15 serielle billeder sekventielt. Tag 'Z' serielle billeder ved at scanne dias i en »horisontal-vertikal up-vandret-lodret ned 'bevægelse, således at gentagelse af' Z 'serier inden for samme fokus undgås.
    2. Når 'Z' serielle billeder er taget til fange, navngive filerne ved at identificere diasnumre, navn på de afsnit, og antallet af de 'Z' serielle billeder taget.
      1. Brug 'ImageJ »software til at tælle Dext + CD4 + T-celler i forhold til det samlede antal af CD4 + T-celler. Vælg 'type tæller' i 'ImageJ, check &# 8216; vis alle "og begynder at tælle ved at klikke i midten af ​​hver celle og fortsætte med at tælle i forskellige 'Z' serielle billeder ved hjælp af side-pile. Efter at tælle alle de CD4 T-celler, skal du vælge en anden type tæller og tæller CD4 + dext + T-celler. Klikke på fanen resultater for at få det samlede antal talte celler med de to forskellige tællere.
      2. For at opnå det samlede antal, tilføje antallet af celler i alle de 'Z' serielle billeder, der repræsenterer alle de tre cerebrale sektioner eller alle de otte hjerte sektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne rapport er in situ påvisning af antigen-specifikke, autoreaktive CD4 T-celler ved direkte farvning med MHC klasse II dextramers beskrevet. Nyslået cerebrale sektioner blev afledt fra EAE-mus og farves med cocktails indeholdende PLP 139-151 (specifik) eller TMEV 70-86 (kontrol) dextramers og anti-CD4. De øverste paneler i Figur 1 viser LSCM analyse af cerebrale costained med PLP 139-151 dextramers (rød) og CD4-antistof (grøn), hvor dobbelt-positive celler syntes gul. En sådan funktion var fraværende i snit farvet med TMEV 70-86 (kontrol) dextramers (nederst paneler). De costained (Dext + CD4 +-celler) viste punktformig prikker omkring periferien. Kvantitativ analyse af PLP-specifikke T-celler i de cerebrale involverede de følgende trin (figur 2): 1) Dele af tre par blev foretaget, og en sektion fra hvert par blev farvet individuelt med anti-CD4-og PLP 139-151 dextramers. Ligeledes blev et andet sæt af tre sektioner farvet med anti-CD4 og kontrol (TMEV 70-86) dextramers. 2) Fra et givet afsnit, blev inflammatoriske foci (10 til 15) identificeres på baggrund af anti-CD4 farvning. 3) Et sæt af 'Z' serielle billeder (15 til 25) blev taget fra hvert indsatsområde sekventielt fra top til bund med et interval på 2 um mellem hver. I det væsentlige, blev 10 til 15 tilsvarende sæt af 'Z' serielle billeder, der repræsenterer lige antal af inflammatoriske foci analyseres i hvert afsnit. 4) I enkelte billeder, CD4 + celler (grøn), cellerne positive for begge dextramers (rød) og CD4 (grøn), der optrådte som gule punktformig celler blev optalt ved at markere dem individuelt ved hjælp af open source-software, ImageJ, og endelig, en grand total blev opnået for hvert afsnit ved at tilføje antallet af celler tælles i alle de 'Z' serielle billeder. Fordi cellerne blev mærket, muligheden for beretter celler i flere billeder, der eroverlappende blev elimineret. Således kan pålidelig tælling af Dext +-celler i forhold til det totale antal celler, der udtrykker CD4 opnås.

Denne undersøgelse blev yderligere udvidet til at demonstrere brugen af dextramer reagenser til påvisning af antigen-sensibiliserede T-celler in situ i EAM induceret med MyHC 334-352 i A / J-mus, som også er en T-cellemedieret sygdom 13,14. Otte parrede hjerte sektioner blev fremstillet, hver 200 um tykt, fra EAM mus (Figur 2). Fra hvert par blev en sektion (med i alt 8 afsnit) farvet med MyHC 334-352 dextramers og anti-CD4, mens et andet sæt af sektioner (8 i alt) blev farvet med RNase 43-56 dextramers (kontrol) og anti -CD4. Tyve sæt 'Z' serielle billeder, der svarer til, at mange inflammatoriske foci repræsenterer alle otte afsnit blev erhvervet i rækkefølge som ovenfor (Figur 2). Væsentlige, et givent sæt af 'Z' serial imaldre bestod af 10 til 15 individuelle repræsenterede en enkelt inflammatorisk fokus. Analyse af disse billeder af LSCM viste tilstedeværelsen af celler positive for MyHC 334-352 dextramers (rød), og CD4 (grøn) og forventeligt, cellerne bundet med både dextramers og CD4 viste sig som gule punktformig celler (figur 3, top paneler) . Baggrunden farvning for kontrol dextramers var ubetydelig (fig. 3, nederste paneler). Det samlede antal Dext + CD4 + T-celler og det samlede antal af CD4 + T-celler blev bestemt for hver sektion og tæller fra alle sektioner blev lagt sammen for at udlede det samlede antal for hver delmængde (Dext + CD4 + T-celler; CD4 + T-celler).

Figur 1
Fig. 1. Påvisning af PLP-specifikke CD4-T-celler ved in situ farvning med PLP 139-151 dextramers. EAE blev induceret i SJL-mus ved immunisering af dyrene med PLP 139-151 i CFA. Ved afslutning blev cerebrums indsamlet fra EAE-mus indlejret i 4% agarose og sektionerne blev foretaget ved hjælp vibratom. Efter farvning med cocktails, der indeholder enten PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 eller TMEV 70-86 dextramers (kontrol) / anti-CD4 og fastsættelse med 4% PBS-buffer paraformaldehyd blev snit vasket og monteret til undersøgelse ved LSCM. Top paneler: to adskilte sektioner farvet med PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. Bottom paneler: to adskilte sektioner farvet med TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. Venstre panel: CD4, grøn; Midterste panel: dextramers, rød; Højre panel: fusioneret (pile, Dext + CD4 + T-celler). Original forstørrelse 1.000 X (vedtaget:.. Massilamany m.fl. 2014 Direkte Farvning med dominerende histokompatibilitetskompleks klasse II Dextramers Tillader fund af antigen-specifikke, autoreactive CD4 T-celles in situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Forbundne Figur 2.. En tilgang til kvantificere Dext + celler i hjerner og hjerter. Sektioner er fremstillet af cerebrum eller auricle-udskåret hjerte som vist (Panel 1). Én sektion fra hvert par, der svarer til de angivne organer blev udpeget til farvning med specifikke dextramers (cerebrum, PLP 139-151 dextramers, hjerte, MyHC 334-352 dextramers), og det andet sæt af sektioner til kontrol dextramers (cerebrum, TMEV 70 - 86 hjerte, RNase 43-56). Efter fastsættelse og montering blev snittene undersøgt for at lokalisere inflammatoriske foci baseret på farvning med CD4 ved LSCM (original magnification, 40X) (Panel 2). Hver inflammatoriske fokus som visualiseret i tre-dimensionelle (3D) visning (Panel 3) blev udsat for et sæt af 'Z' serielle billeder sekventielt (Panel 4). I alle de billeder blev celler positive for både specifik eller kontrol dextramers og CD4 eller CD4 alene talt med 'ImageJ' software (vedtaget:.. Massilamany m.fl. 2014 Direkte Farvning med dominerende histokompatibilitetskompleks klasse II Dextramers Tillader fund af antigen- Specifikke, autoreaktive CD4 T-celler i Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Fig. 3. Påvisning af cardiac myosin-specifikke CD4-T-celler ved in situ + CD4 + (vedtaget:.. Massilamany m.fl. 2014 Direkte Farvning med dominerende histokompatibilitetskompleks klasse II Dextramers Tillader fund af antigen-specifikke, autoreaktive CD4 T-celler i Situ PLoS ONE 9 (1):. E87519). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I modsætning til MHC klasse I-tetramerer, anvendelse af MHC klasse II-tetramerer til rutinemæssig anvendelse er fortsat udfordrende, især at opregne de precursor-frekvenser med lav affinitet autoreaktive CD4 T-celler, til dels skyldes deres aktivering afhængighed 6,15-17. For nylig blev dette problem omgået ved at skabe den næste generation af tetramere, kaldet "dextramers", tillader os at opdage antigen-specifikke CD4 T-celler for en række autoantigener, såsom PLP 139-151, MOG 35-55 og MyHC 334 - 352 8. I denne rapport, der for første gang, nytten af MHC klasse II dextramers at detektere og kvantificere selvnedbrydende CD4 T-celler in situ er blevet påvist ved brug hjernen sektioner fra EAE mus og hjerte sektioner fra EAM mus. På en reaktion basis dextramers tilbyder den fordel, at der en lille mængde af MHC / peptid-komplekser. I denne protokol, kræver kun 0,75 ug MHC / peptid monomerer hver reaktion. Desuden stalingen med dextramers er en et-trins reaktion, da dextramers er coinkuberet med anti-CD4, og hele proceduren, fra væv sektionering til farvning, kan være færdig på mindre end en dag. I modsætning hertil publicerede protokoller til in situ-farvning med konventionelle tetramerer normalt involvere amplifikationsprocedurer, hvori de fluorescerende signaler forstærkes ved hjælp af sekundære antistoffer til fluoroforer. Som et resultat, kan farvningsprocedurer tage op til tre dage at fuldføre 18-20.

Desuden er brugen af ​​dextramers i cerebrale tillader påvisning af antigen-specifikke T-celler dybt i vævssnit, endda op til 50 um. Det blev bemærket, at PLP 139-151 Dext + CD4 + celler blev fundet at være placeret både perivascularly og også inden parenkym. Endvidere er intensiteten af ​​signaler genereret fra MyHC 334-352 dextramers var lav i hjerte-sektioner, når de sammenlignes med de PLP 139-151 dextramers i hjernens sektioner (fig. 1), og en sådan variation kan afspejle karakteristika unikke for hvert organ. En sådan variabel er lipidindholdet som er til stede i store mængder i hjernevæv i modsætning til hjertevæv, der hovedsagelig indeholder tværstribede muskelfibre, der potentielt kan begrænse let diffusion af dextramers ind i det inflammatoriske fokus. Til støtte for denne opfattelse, blev MyHC 334-352 Dext + celler opdages kun til en dybde på op til 20 um i størstedelen af hjerte-sektioner. Derudover var MyHC 334-352 Dext + celler til stede spredt gennem myokardiet tyder den spredte karakter af inflammatoriske infiltrater i myocarditic læsioner.

Generelt kan to vigtige faktorer negativ indflydelse på påvisning af antigen-specifikke T-celler in situ ved LSCM. For det første kan utilstrækkelige signaler udsendt af fluoroforer føre til behovet for at forstærke signalerne ved hjælp af fluoroforen antistoffer. For det andet, sådan indirekte pletING kan underminere specificitet, som baggrund farvning for kontrolreagenser også kan øge forholdsmæssigt 18,19. Disse begrænsninger blev omgået ved direkte farvning med dextramers. Selvom påvisning af CD4 T-celler er blevet vist med friske sektioner, anvendelse af dextramer reagenser i frosne væv kræver yderligere undersøgelser, som kan være en udfordring opbevaring af væv integritet kan være vanskelig på grund af tendensen til væv for at få smuldrede under diverse farvning trin 18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter blev erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af American Heart Association og Børnenes Kardiomyopati Foundation (SDG2462390204001), og National Institutes of Health (HL114669). CM er en modtager af en postdoc stipendium tildelt af myocarditis Foundation, NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73, (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310, (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9, (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219, (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182, (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92, (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166, (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13, (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170, (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165, (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268, (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
<em>In Situ</em> Påvisning af autoreaktive CD4 T-celler i hjernen og hjertet Brug hovedhistokompatibilitetskompleks klasse II Dextramers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).More

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter