Summary
פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה מולקולרית וכדאיויות תא מעובד.
Abstract
Electroporation זכתה לתשומת לב הולכת וגובר בשנים האחרונות, כי זה הוא טכניקה חזקה מאוד להחדרה פיזית בדיקות מולקולריות אקסוגני שאינו permeant לתוך תאים. עבודה זו מדווחת פלטפורמת electroporation microfluidic מסוגל לבצע משלוח מולקולה מרובה לתאי יונקים עם שליטה מדויקת ומולקולרית תלויה פרמטר. היכולת של המערכת לבודד את התאים עם התפלגות גודל אחידה מאפשרת פחות וריאציה ביעילות electroporation לעוצמת שדה חשמלית נתון; מכאן משופר כדאיות מדגם. יתר על כן, תכונת ההדמיה תהליך שלה מאפשרת להתבוננות בתהליך הניאון המולקולרי הספיגה בזמן אמת, המאפשר התאמות פרמטר מסירה מולקולריות מהירה באתר לשיפור יעילות. כדי להראות את היכולות עצומות של הפלטפורמה דיווחה, מקרומולקולות עם גדלים שונים ומטענים חשמליים (למשל, Dextran עם MW של 3,000 ו -70,000 Da) היהנמסר לתאי סרטן השד גרורתי עם יעילות גבוהה משלוח (> 70%) עבור כל המולקולות שנבדקו. הפלטפורמה שפותחה הוכיחה את הפוטנציאל שלה לשימוש בהרחבה של תחומי מחקר שבו טכניקות electroporation יכולות להיות על שבב מועילות.
Introduction
בשנים האחרונות, השימוש בפולסים חשמליים כדי להקל על משלוח cytosolic של מולקולות תאיים הפך אמצעי אטרקטיבי של מניפולציה תאי יונקים. 1 תהליך זה, המכונה גם electroporation, הפיך permeabilizes קרום התא, המאפשר למולקולות בלתי חדירים קרום מטבע כדי לקבל גישה לסביבה תאית של התאים. כי כמעט כל מולקולה יכולה להיות מוחדר cytosol באמצעות הנקבוביות שנוצרו זמניות בקרום של כל סוג של תאים באמצעות electroporation, הטכניקה דווחה כיותר לשחזור, ישים באופן אוניוורסלי, ויעיל יותר מאשר שיטות אחרות, כוללים וירוס בתיווך, כימי וגישות אופטיות. 2-3 טכניקה זו נוצלה להציג את מולקולות ניאון, 4 תרופות 5 וחומצות גרעין 6-7, תוך שמירה על תאי קיימא ושלמים. בהתחשב ביתרונות הללו, electroporation אומצה כעבודה משותפתטכניקת atory לtransfection DNA, in vivo ריפוי גנטי 8 ומחקרי חיסון תא. היא, לעומת זאת, עדיין קשה למערכות electroporation קונבנציונליות כדי להשיג בו זמנית יעילות מעשית ויכולת קיום לדגימות עם הטרוגניות גדולה בגודלם ועוצמת השדה החשמלי הנדרשת לelectroporation המוצלח בקורלציה הדוקה עם הקוטר של התא. יתר על כן, מערכות אלה אינן מאפשרים שליטה מדויקת של הכמויות מולקולריות מרובות מועברת עקב הסתמכות על תהליך משלוח בתפזורת סטוכסטיים מולקולרי. 9 על מנת לטפל בבעיות אלה, קבוצות רבות פיתחו פלטפורמות electroporation microfluidic, המציעות את היתרון של מתחי poration נמוכים יותר, יעילות טובה יותר transfection, ירידה גדולה בתמותת תאים, והיכולת לספק מולקולות מרובות. 10-13 יתרונות אלה התאפשרו הודות לטביעות הרגליים הקטנות של מערכות electroporation microscale אלקטרודה שהמגרשאורכים הם תת מילימטרים, באופן דרמטי ירידת מתח הנדרש למשלוח מוצלח. יתר על כן, מערכות electroporation microscale אלה יכולים להשיג הפצת שדה חשמלית אחידה ובמהירות לפזר חום שנוצר, מניב תמותת תא מופחת תוך שיפור יעילות משלוח. הניצול של חומרים שקופים לשבבים אלה נוספים מאפשר בתצפית באתרו של תהליך electroporation לשינויים פרמטר הפקודה. 2,12 עם זאת, שליטה במינון מדויקת ושליטה פרמטר מולקולרית ותאית תלויה, הנדרשת למחקר חדש ויישומים טיפוליים, 6, 14-16 עדיין נותר לא פתור.
עבודה זו מציגה מערכת microfluidic בסיוע מערבולת electroporation, מסוגל לספק מולקולות מרובות ברצף לאוכלוסייה זהה שנבחר מראש של תאי מטרה. תאים עם התפלגות גודל האחיד מבודדים לפני electroporation באמצעות si שדווח בעברמנגנון ze סלקטיבי השמנה. 17-18 על ידי בעל התפלגות אחידה בגודל, פחות וריאציה ביעילות electroporation וכדאיות משופרת לעוצמת שדה חשמלית נתון הושגו. 19 יתר על כן, ברציפות התססה תאים לכודים באמצעות מערבולות microscale אפשר למסירה אחידה של מולקולות על פני cytosol כל, בהסכם עם התוצאות שדווחה בעבר באמצעות פלטפורמה אחרת electroporation בסיוע מערבולת. 20 כדי להוכיח כי מערכת זו תהיה ישימה למגוון רחב של המולקולות בשימוש הנרחבים ביישומים ביולוגיים, מקרומולקולות עם מגוון רחב של משקלים מולקולריים הועברו ל תאי סרטן השד גרורתי. בנוסף, בעזרת ניטור תהליך בזמן אמת, עבודה זו מספקת ראיות נוספות כדי לשים קץ לוויכוח הארוך הימים בנוגע למנגנון של משלוח מולקולרי לבמהלך electrporation, מכיוון שרוב תושבי אלקטרופורזה בתיווך מול בתיווך דיפוזיה. 14 6,14,21-22 תרופה 10,19 ויישומים הדורשים להבנה מעמיקה של מנגנוני אספקה מולקולריים electroporation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 תא הכנה
- צלחת 1 × 10 5 / מ"ל תאים של שורת תאי סרטן שד גרורתי מד"א-MB-231 בנפח של 10 מ"ל לבקבוק T75 בתרבית רקמה בשל ליבוביץ L-15 בינוניים בתוספת 10% (v / v) בסרום שור העובר ו1 פניצילין, סטרפטומיצין%.
- דגירה מד"א-MB-231 תאים בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 0% CO 2 בסביבה.
- קציר תאים לניסויים 2 ימים לאחר זריעה על ידי טיפול בתאים עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 2 דקות ולהשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין על ידי הוספת 8 מ"ל של תקשורת הצמיחה.
- תאים גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות בגרמו 200 × וגלול בתמיסת מלח של Dulbecco פוספט (DPBS, 1x, ללא Ca 2 + וMg 2 +) לריכוז סופי של 5 × 5 10 תאים / מ"ל.
2 עיצוב מכשיר וייצור
הערה: המסכה, בדותות עובש אב ותהליך תוחם microchannel הוא להתנהל בתוך חדר נקי בזמן שניתן לבצע תהליך ליהוק microchannel polydimethylsiloxane (PDMS) על benchtop מעבדה רגיל.
- עיצוב מכשיר microfluidic כפי שמודגם באיור 1 עם AutoCAD. המכשיר צריך להיות מורכב של כניסה עם יציאות מרובות הזרקה, מסננים גסים ושני ערוצים מקבילים ישר מלבניים אינרציה התמקדות (L = 7 מ"מ, W = 40 מיקרומטר, וH = 70 מיקרומטר). ערוץ ישר פרט מורכב 5 תאים electroporation, אשר ממוקמים 800 מיקרומטר מזה (W C = 400 מיקרומטר) עם שניים מהם דרך חורים עבור אלקטרודות אלומיניום. שני תאי electroporation transversally סמוכים חולקים את החור להאלקטרודה השלילית. שני ערוצים ישר למזג לשקע במורד הזרם של אזור electroporation.
- להמיר את קובץ CAD עם מיקרו דפוסים לקובץ GDSII באמצעות LinkCAD. לכתוב מיקרו דפוסים על 5 "X 5" photomask ריקבאמצעות סופר מסכת לייזר. לפתח את המסכה על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן. הערה: תהליך פיתוח המסיכה כולל פיתוח photoresist, תחריט כרום ולהתנגד להסרת. לחלופין, מיקרו דפוסים מודפסים על שקיפות רזולוציה גבוהה (> 20,000 dpi) ניתן לרכוש מיצרן צד שלישי ומשמש כphotomask. תכונות מיקרוסקופיות סופית על photomask צריכה להיות שקופות כדי להתאים את הקוטביות של photoresist שלילי.
- לפברק עובש הליהוק של עיצוב המכשיר תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה רכה סטנדרטית 23 עם מעיל photoresist השלילי הסתובב על פרוסות סיליקון 4 אינץ ב2,000 סל"ד כדי לקבל את העובי הסופי של 70 מיקרומטר.
- Prebake הרקיק עם photoresist השלילי עבור 20 דקות על 95 מעלות צלזיוס.
- צור את המסכה עם הרקיק ולחשוף למקור UV (17.4 mJ / 2 סנטימטר) ל80 שניות באמצעות aligner מסכה.
- לפתח את הרקיק החשוף למשך 4 דקות במפתח SU-8.
- מדוד אתעובי photoresist מפותח באמצעות profilometer משטח.
- בקפדנות לערבב 10: 1 יחס של אלסטומר לסוכן ריפוי (ערכת אלסטומר סיליקון) ויוצקים את התערובת על תבנית היציקה כדי ליצור העתקים PDMS. דגה אלסטומר הליהוק ל30 דקות ולרפא את תבנית היציקה עם אלסטומר degassed בתנור על 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- Delaminate העתק PDMS נרפא עם דפוסי microchannel מחורי העובש ואגרוף להוספות פתחי הכניסה, יציאה ואלקטרודה באמצעות צבת סיכה. הערה: קוטר חוד החנית הרגיל של צבת הסיכה צריכה להיות 0.76 מ"מ, מתאים לחוזקה מחזיק צינורות הצצה (OD של 1/32 ") ואלקטרודות אלומיניום (OD של 0.029") במקום.
- ליצור ערוצי microfluidic מוקפים העתקים PDMS מליטה לשקופיות זכוכית שטופלו בשואב חמצן פלזמה ל7 שניות בלחץ חלקי כוח וחמצן בתדר רדיו של 75 W ו500 mTorr, בהתאמה.
.3 ניסויי זרימה
- הכנסאלקטרודות אלומיניום (0.029 "OD) וצינורות הצצה לשקע (1/32" OD) למקומות המיועדים באמצעות חורים בmicrochannel (ראו איור 3 ב).
- חיבור הציוד החשמלי 18 האחראי ליצירת פולסים מרובע גל קצר במתח גבוה לאלקטרודות האלומיניום (ראה איור 3 ג) שנמצאים בקשר עם זורם פתרונות בעובש PDMS. הערה: הציוד צריך להיות מורכב של גנרטור דופק ומגבר מתח גבוה שנבנה בבית 18.
- הכן ארבעה 50 צינורות מ"ל צנטריפוגות בנפרד מכילים DPBS, פתרונות עם תאים ומולקולות ביולוגיים, ולצרף כל צינור לבעל הבקבוקון שלו בהתאמה מחוברת למערכת בקרת זרימת פנאומטי (ראה איור 3 א). 18
- חיבור צינורות הצצה כניסה ממחזיקי הבקבוקון לתוך חורי כניסה המתאימים במכשיר microfluidic.
- הגדר את סדר הגודל של פולסים מרובעים גל, V, ל100 V כדי שיהיה לי אוף החשמליכוח ld, דואר E = V / L, על פני תא electroporation להיות שווה ערך ל0.7 ק ו / סנטימטר. הערה: הנה, דואר L הוא המרחק בין שתי נקודות שבן אלקטרודות החיוביות ושליליות נמצאות בקשר עם הפתרון הזורם (ראה איור 1).
- הגדר את וסת לחץ 40 psi. הערה:. מקור חנקן להתאמה באופן ידני אחת משמש לחצים באופן אחיד את כל בקבוקוני המדגם וסעפת במהירות גבוהה היא מנוצלת להפעלה בזמן יציאות פתרון בודדות באמצעות תוכנת LabVIEW שהותקן 18
- לבקרת שסתום, לפתוח את תוכנת LabVIEW שהותקן שכותרת Valve ראנר, ולחץ לרוץ מהתפריט הנפתח הזכאי לפעול.
- הפעל סתום על ידי לחיצה על כל אחד מסמלים שסתום המתאימים. הערה: סמל השסתום צריך להפוך ירוק כאשר הוא מופעל. לחיצה על הסמל הפעיל לבטל ולסגור את הברז. סמל השסתום הסגור צריכה להאפיר.
- פתח את השסתום למאגר DPBS (כלומר., פתרון כביסה) לראש מהירות זרימה הנדרשת לדור מערבולת תא לכידה יציב ל1.5 דקות.
- לעבור את יציאת פתרון הפעילה מפתרון הכביסה לפתרון התא לתאי מלכודת בתא electroporation ל30 שניות (כלומר, צעד לכידת התאים).
- לזרום פתרונות הכביסה ותא הן באמצעות המכשיר בו זמנית עבור 10 שניות לפני צעד לכידת התאים כדי להבטיח זרימה בלא הפרעה במהלך שלב מיתוג הפתרון. הערה: שיתוף זרימת צעד קצר זה יש לחזור בכל שלב מיתוג פתרון.
- הפעל את יציאת הכביסה ולשטוף את המכשיר ל20 שניות כדי להסיר שאינם לכודים תאים מזהמים.
- הזרק התמיסה המכילה את המולקולה הראשונה של ריבית (0.2 מ"ג / מ"ל של 3,000 מולקולות דה dextran הניטרלי ואניוני או 1.5 מ"ג / מ"ל של 70,000 מולקולת dextran הניטרלי Da) לתוך המכשיר.
- החל חמישה פולסים קצרים (Δt = 30 אלפיות שניים עם 2 מרווחי שניות) מייד לאחר ההזרקה שלפתרון ומולקולרי לפקח על הגודל ומשך הזמן של פולסים החשמליים המיושמים בזמן אמת באמצעות אוסצילוסקופ.
- שיימסר חזור על שלב 3.10 כמה פעמים שמספר מולקולות נוספות. עבור כל משלוח מולקולרי, תאי דגירה ל100 של בפתרון המולקולרי אז לשטוף את המכשיר עם פתרון הכביסה ל100 של להסיר מולקולות עודפות.
- שחרר את התאים בצלחת 96 היטב לניתוח במורד הזרם על ידי הורדת לחץ ההפעלה מתחת ל -5 psi. הערה: כ 100 μl של פתרון עם 100 תאים שנאספו מכל מהדורה.
- הפעל את הניסוי על השלבים 3.9 דרך 3.16 שלוש פעמים כדי לאסוף מספיק תאים לcytometry זרימה.
- צנטריפוגה 96 גם הצלחת המכילה תאי מעובד במשך 5 דקות ב228 × גרם.
- הסר את supernatant המכיל מולקולות ניאון עודפות.
- Resuspend תאים בDPBS לניתוח cytometry זרימה.
- תאי עומס בזרימה cytometer עבור U המולקולריptake ניתוח יעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Electroporator microfluidic המקביל פיתח נמסר מקרומולקולות עם גדלים מגוונים ומטענים חשמליים לתוך תאי חיים סרטן השד גרורתי. משלוח מולקולרי מוצלח נקבע איכותי על ידי מעקב אחר שינויים בעוצמת ניאון של electroporated תאים המקיפים באתר ואושר על ידי מדידות כמותיות באמצעות ניתוח cytometry זרימה. איור 4A מראה כי 90% מתאים שטופלו ספיגים dextran הניטרלי דה 70,000. לניתוח הסטטיסטי, סף עוצמה עבור כל fluorophore הוקם כך שהרוב (> 99%) של תאי חיים לא מעובדים נספר מתחת לסף (ראה איור 4 (ג)). היעילות מוגדרת כיחס בין מספר התאים בהצלחה תופס את המולקולות של עניין למספר הכולל של תאי מעובד. איור 4 ממחיש כי היעילות אינה משמעותי משתנה בהתאם מולקולריחיובים במשקל או חשמלי (P> 0.1). כל מולקולות dextran נבדקו נמסרו לcytosol ביעילות רבה יותר מאשר 70%. בנוסף, איור 4D מציג כי משלוח מולקולרי רציף בוצע בהצלחה עם יעילות כפולה מולקולת מסירת 56% באמצעות אניוני וdextrans הניטרלי עם משקל זהה מולקולרי (MW = 3,000 Da). המערכת הנוכחית יכול לעבד תאים עם פי 10 יעילות משלוח תפוקה ורבת מולקולה גבוהה יותר מאשר המערכת שדווחה בעבר 18 ושיפור זה אינו משפיע על הגשת מולקולה בודדת (82% ו70% לdextran אניוני וניטראלי, בהתאמה).
איור 1 (א) סכמטי של מערכת electroporation microfluidic, בהיקף של פתחי הכניסה לתאים (מסומן כג), מולקולות (מסומן כM1 ו M2) וsolut סומקהיון (מסומן כF), שני ערוצים ישרים שבו אינרציה התמקדות מתרחשת, 10 תאי electroporation עם אלקטרודות ולשקע. הפגנה (ב ') פתרון חליפין בכניסה באמצעות פתרון 1μM FITC ופתרון סומק (DPBS) מצביע על כך שהפתרון הפעיל ניתן להזריק באופן אחיד לכל המערכים של תאים במורד הזרם. לעומת תמונה משופרת על ידי התאמת שולחן להסתכל למעלה (LUT). ברים סולם הם 250 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 תצלום של האלקטרודה 15 הפינים מנוצלת ליישום מתח הגבוה קצר דופק, בהיקף של 10 חיוביים (+) וחמש אלקטרודות שליליות (-). כל אלקטרודה חיובית במרווחים 2 מ"מ מהאלקטרודה שלילית, ודואראלקטרודה ACH של אותה הקוטביות במרווחים 1.35 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 סכמטי של המנגנון הניסיוני, בהיקף של יחידת נוזל השליטה, (ב) electroporator microfluidic, והציוד החשמלי (ג) (). בקבוקים () המכילים פתרונות עם מולקולות, תאים וחיץ נקי הוא בלחץ בנפרד על פי דרישה באמצעות מערכת זרימת פנאומטי LabView מבוקרת. הפתרון מבקבוקון הלחץ מוזרק לתוך electroporator microfluidic דרך צינורות הצצה עם שסתום סימון המותקן. (ב) ו (ג) האותות חשמליים נשלחים לאלקטרודות 15 פינים במגע עם fפתרון געייה במערכת microfluidic במהלך שלב electroporation. פולסים חשמליים עם המשך המתוכנת מופקים באמצעות מחולל דופק ואת עוצמת הדופק החשמלי מוגברת ל100 V על ידי מגבר המתח הגבוה. כל הפרמטרים החשמליים מיושמים מנוטרים בזמן אמת באמצעות אוסצילוסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 נציג cytometry זרימת הנתונים. () אותות פלורסנט של מד"א-MB-231 תאים, אשר בהצלחה לקחו את מולקולת 70,000 dextran אניוני Da, בהשוואה לזה של עמיתו השליטה. (ב ') את היעילות עבור כל מולקולת dextran הועברה אינו מציג משמעותי מולקולרי תלויוריאציה (p> 0.1). (ג) זרימת נציג cytometry פרופילים לתאים, אשר לא טופלו בelectroporation (שליטה). סף הניאון המציין משלוח מולקולרי מוצלח מוגדר מנתונים כגון שהאותות מדגימות בקרה נמצאים מתחת לסף. זרימת נציג (D) cytometry נתונים לתאים ברצף electroporated. תיבות ירוקות, אדומות וצהובות בcytometry זרימת תמונות עלילה ופס ניאון בצד הימני שמייצגים אותות ניאון מתאי uptaking 3,000 dextran בלבד הניטרלי, שני מולקולות דה dextran בלבד ואניוני dextran, בהתאמה. סרגל קנה מידה הוא 100 מ '. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם הפלטפורמה החדשה parallelized electroporation, השיפור של פי 10 בתפוקה ויעילות של משלוח מרובה מולקולה הושגה, בנוסף לכל היתרונות שהמערכת אחת קאמרית שפותחה בעבר מספקת. 18 יתרונות זמינים בעבר כוללים (i) לפני טיהור יעד תאים עם התפלגות אחידה גודל לשיפור כדאיות, (ii) שליטת מינון מולקולרית מדויקת ופרטנית, וכן (iii) זרם חשמלי תפעולי נמוך. Fluorescently dextrans שכותרתו נבחר כמולקולות של עניין, כי הם זמינים במגוון רחב של משקלים מולקולריים, סוגים מצומדות fluorophore, ומטענים חשמליים. מקרו מולקולות אלה הן מועמדים טובים למחקר מסוג זה מאז שהם מטבעם הקרום חדיר לתאי חיים ואינם מציגים רעילה. 24 ריכוז אופטימלי של dextran ניאון, זמן דגירה, ופרמטרים חשמליים זוהו עבור t לפני המערכת הנוכחיתo ניסויי electroporation. אופטימיזציה של התהליך היה די פשוט ויעיל בשל היכולת של הפלטפורמה כדי לפקח על תהליך הספיגה המולקולרי בזמן אמת. ויזואליזציה של תהליך זה היא מאוד מועיל אם סוג מולקולה או תא עם מעט לשום ידע של הפרמטרים electroporation נבחן. הדגירה הזמן לכל נבדקו המולקולות נקבע להיות 100 של שבאמצעותו תאים לכודים בכל 10 התאים מפגינים אותות עוצמת ניאון לזיהוי בזמן אמת, המציין את השלמת המסירה מולקולרית מוצלחת. שים לב שזה לא את משך הדגירה המינימאלי הנדרש למשלוח מולקולרי.
יש כבר ויכוח ארוך שנים בנוגע לתהליך המשלוח המולקולרי באמצעות electroporation, בין אם הוא בתיווך אך ורק על ידי דיפוזיה 4,19,25 או על ידי אלקטרופורזה. 26 זיהוי של המנגנון הדומיננטי של אספקה מולקולרית כולל סדרה של בדיקות פרטניות מייגע, השוואה tהוא התוצאות בהתאם לגדלים מולקולריים, מטענים חשמליים ופרמטרי electroporation. למיטב ידיעתם של המחברים, תהליכי אופטימיזציה מייגע אלה לא דווחו עם מערכות electroporation קונבנציונליות. 4,26-28 יכולת פרמטר אופטימיזציה פשוטה של המערכת שפותחה אפשרה לזיהוי מנגנון האספקה המולקולרי הדומיננטי, על ידי וריאציות בוחנות ביעילות electroporation בהתאם לפרמטרים מולקולריים וחשמליים. תוצאות מחקר הראו כי היעילות של אניוני 3,000 dextran דה לא הייתה שונה באופן משמעותי מזה של מקבילו הניטרלי (83 ו75%, בהתאמה), המצביע על כך את הספיגה המולקולרית שנצפתה הייתה בתיווך ככל הנראה על ידי דיפוזיה. בניגוד למערכות electroporation אחרים, תאי מעובד היו נסערים ברציפות לאורך כל תהליך electroporation במערכת זו. עלייה הדרגתית באותות ניאון של תאים המקיפים נצפתה, המצביע על דיפוזיה שיהיה Dominaמנגנון אספקת NT. ספיגת יעילות גבוהה מולקולרית (90%) של 70,000 מולקולות dextran דה ניטרליים מרמזת כי גם במשקל מולקולרי גבוה תהליך המשלוח מתרחש כתוצאה של דיפוזיה. לבסוף, מסירה רציפה מוצלחת של 3,000 מולקולות dextran אניוני והניטראליים דה מבצרת את הטענה כי מסירה מולקולרית מתרחשת למרות תשלום המולקולות. תוצאה זו גם מצביעה על כך שהודבק מכתבים מחדש קרום לא הושלמו בתוך 3 דקות של electroporation (מחיר למסירה מולקולרית 100 שניות).
פלטפורמת המשלוח מולקולרי הציגה יכולה ברצף לספק טווח רחב של גדלים מולקולריים ללא קשר למטענים החשמליים שלהם. כוונון עדין ושינוי של פרמטרים בודדים בזמן ניתן להשיג עם מעט מאמץ בסיוע יכולת ניטור תהליך בזמן אמת. תהליך טיהור תא המבוסס על הגודל של המערכת מבטל את הצורך בהכנה מייגע מדגם ומראש צנטריפוגה זמן רב ולאחר electroporationצעדים. יתר על כן, הנוכחי התפעולי הנמוכה של המערכת באופן משמעותי מפחית את תמותת תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי תכנית רולנד Junior העמית. המחברים מבקשים להביע את תודה למדענים ואנשי צוות במכון רולנד בהרווארד: כריס סטוקס על עזרתו בפיתוח, ההתקנה שהותקן בסיוע מחשב בקרת לחץ, דיאן Schaak, Ph.D. עבור קלטה לטיפול מדגם ביולוגי, וינפילד היל לפיתוח ההתקנה החשמלית, Alavaro סאנצ'ז, Ph.D. למתן גישה לזרימת cytometer, סקוט בוויס, קני ספנסר ודון רוג'רס לעיבוד רכיבי צנרת מכאניים הנדרשים להתקנת הלחץ. אדוני microfluidic היו מפוברקים במרכז למערכות ננו (CNS) באוניברסיטת הרווארד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J.
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C.
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M.
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
