Summary
マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備えた同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。
Abstract
それは物理的に細胞内に非浸透性の外因性分子プローブを導入するための非常に強力な技術であるため、エレクトロポレーションは、過去数年間でますます注目を受けている。この作品は、精密な分子に依存するパラメータ制御で、哺乳動物細胞への複数の分子送達を行うことが可能なマイクロ流体電気穿孔プラットフォームを報告します。均一なサイズ分布を有する細胞を単離するシステムの能力は、与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーション効率のより少ない変動を可能にする;したがって、サンプルの生存率を高めた。また、そのプロセスの可視化機能は、効率向上のために、その場で迅速な分子デリバリーパラメータ調整を可能にする、リアルタイムで蛍光分子の取り込み過程を観察することができます。報告されたプラットフォームの膨大な機能を表示するには、異なるサイズおよび電荷（3,000 70,000 DaでMWを有する、例えばデキストラン）を持つ巨大分子であったすべての試験した分子に対して高い送達効率（> 70％）で転移性乳癌細胞に送達する。開発プラットフォームは、オンチップエレクトロポレーション技術は有益である研究分野の拡大に使用するための可能性を証明した。
Introduction
近年では、細胞外分子のサイトゾル送達を容易にするために、電気パルスの使用は、哺乳動物細胞を操作する魅力的な手段となっている。1もエレクトロポレーションと呼ばれるこのプロセスは、可逆的にアクセスするために、本 質的に膜不透過性分子を可能にする、細胞膜を透過性に細胞の細胞内環境に。実質的に任意の分子がエレクトロポレーションを用いた細胞の任意のタイプの膜に一時的に作成細孔を介してサイトゾルに導入することができ、この技術はより再現性であると報告されており、普遍的に適用、およびウイルス媒介化学を含む他の方法よりも効率的であるため細胞が生存し、そのまま保ちながら光学的ア プローチ2-3この技術は、蛍光分子を導入する4医薬品5および核酸6-7利用されている。これらの利点を考えると、エレクトロポレーションは、一般的な労働力として採用されているDNAトランスフェクションのためのatory技術、 インビボ遺伝子治療8および細胞ワクチン接種の研究。成功したエレクトロポレーションに必要な電界強度が密接に細胞の直径と相関するので、従来のエレクトロポレーションシステムは、同時に、サイズが大きな不均一性を有するサンプルのための実用的な効率および生存率を達成することは依然としては困難である。さらに、これらのシステムは、複数の分子量の正確な制御は、バルク確率的分子送達プロセスへの依存に起因して配信されることはできない。9にこれらの問題に対処するために、多くのグループが、より低いポレーション電圧の利点を提供する、マイクロ流体エレクトロポレーション·プラットフォームを開発したより良いトランスフェクション効率、細胞死亡率の大幅な削減、および複数の分子を送達する能力。10〜13これらの利点は、電極ピッチマイクロエレクトロポレーションシステムの小さなフットプリントにより可能となった長さは飛躍的に成功した配信のために必要な電圧を減少させ、サブミリメートルである。さらに、これらのマイクロエレクトロポレーションシステムは、均一な電界分布を得ることができ、迅速に送達効率を高めつつ、縮小細胞死を生じ、発生した熱を放散する。これらのマイクロチップのための透明な材料を利用し、さらに迅速なパラメータ変更のためのエレクトロポレーションプロセスのその場観察ができます。2,12しかし、投与量の制御とmolecular-と携帯依存のパラメータ制御の正確な新興研究および治療 用途のために必要、6、 14-16は依然として未解決のまま。
この研究は、標的細胞の予め選択された同一集団に順次複数の分子を送達することができるマイクロ流体渦アシストエレクトロポレーションシステムを提示する。均一なサイズ分布を有する細胞は、以前に報告されたSiを用いたエレクトロポレーションの前に単離されるぜ選択的捕捉機構。17-18与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーションの効率および拡張生存率の小さい変化が達成された、均一なサイズ分布を有することにより、 図19さらに、連続的に横切る分子の均一な送達のために許可されたマイクロスケールの渦を用いて捕捉された細胞を撹拌結果と一致する全体細胞質ゾルは、以前に別の渦アシストエレクトロポレーションプラットフォームを使用して報告した。20このシステムは広範囲の分子量を有する巨大分子をに配信された、一般的に生物学的用途で利用される分子の広い範囲に適用可能であることを示すために転移性乳癌細胞。また、リアルタイムのプロセス監視の助けを借りて、この作品はelectrporation中の分子配信のメカニズムについての長年の論争に終止符を打つためのより多くの証拠を提供し、主に拡散媒介対電気泳動媒介されている。14 、6,14,21-22薬物送達用途10,19およびエレクトロ分子配信メカニズムの深い理解のために必要とするアプリケーションのための汎用ツールとして実用的な可能性を秘めています。
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Protocol
1。細胞調製
- リーボビッツL-15培地中で組織培養用T75フラスコあたり10 mlの容量でプレート転移性乳癌細胞株MDA-MB-231 1×10 5細胞/ mlを、10％（v / v）のウシ胎児血清および1を補充％ペニシリン - ストレプトマイシン。
- 0％CO 2環境下で37℃の加湿インキュベーター中MDA-MB-231細胞をインキュベートします。
- 2分間0.25％トリプシン-EDTAで細胞を処理し、増殖培地を8mlを添加することによりトリプシンの酵素活性を不活性化することにより2日間播種後の実験のために細胞を回収する。
- 5×10 5細胞/ mlの最終濃度になるようにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（のCa 2 +およびMgなしDPBS、1倍、2 +）で200×gで再懸濁し、5分間の遠心分離により細胞をペレット化。
2デバイスの設計と製作
注：マスク、マスタ金型捏造とプロセスを囲むマイクロチャネルは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ鋳造法は、通常の実験室ベンチトップ上で実行することができるが、クリーンルームの内部に行われるべきである。
- AutoCADのと、図1に示すように、マイクロ流体デバイスを設計します。デバイスは、（L = 7ミリメートルW =40μmであり、H = 70μm）を、複数の注入ポート、粗いフィルターと2平行な長方形の慣性中心にチャンネルの入口で構成する必要があります。個別のストレートチャンネルは、アルミニウム電極用の穴を介して2つとは別に800μmで配置されている5エレクトロポレーションチャンバー（W C = 400μm）で構成されています。二つの横方向に隣接したエレクトロポレーションチャンバーは、負極用の穴を共有しています。二つのストレートチャンネルは、エレクトロポレーション領域の下流にある出口に合流する。
- LinkCADを使用してGDSIIファイルに微細パターンを持つCADファイルを変換します。 5 "×5"フォトマスクブランク上に微細なパターンを書くレーザーマスク描画装置を用いた。製造業者のプロトコルに従って、マスクを開発する。 NOTE：マスク開発プロセスは、フォトレジストの現像、クロムエッチングおよびレジスト除去を含む。代替的に、高解像度の透明度（>2万解像度）に印刷微細パターンが第三者の製造業者から購入し、フォトマスクとして使用することができる。フォトマスク上の最終的なマイクロスケールの機能は、ネガ型フォトレジストの極性を一致させるために透明でなければならない。
- 70μmの最終的な厚さを有するように、2000rpmで4インチシリコンウェハー上にネガ型フォトレジストスピンコートを有する標準ソフトリソグラフィー技術23を用いて、デバイス設計の鋳型を製造する。
- 95℃で20分間、ネガ型フォトレジストを有するウェーハをプリベーク。
- ウェハマスクに連絡し、マスクアライナを使用して、80秒間UV源（17.4 MJ / cm 2）とにさらす。
- SU-8現像液中で4分間露光したウェハを開発する。
- 測定表面形状を使用して、フォトレジストの厚さを開発しました。
- エージェント（シリコーンエラストマーキット）を硬化するエラストマーの1の割合とPDMSレプリカを生成するために、鋳型に混合物を注ぐ。徹底10をミックス。 30分間の鋳造エラストマーを脱ガスし、2時間70℃のオーブン中で、脱気したエラストマーとの鋳型を硬化させる。
- ピンバイスを使って入口、出口及び電極挿入用の金型とパンチ穴からマイクロ流路パターンを硬化したPDMSレプリカを剥離する。注：ピンバイスの通常の切刃径がしっかりと所定の位置にPEEKチューブ（1/32のOD」）とアルミニウム電極（0.029のOD」）を保持するための十分な0.76ミリメートル、である必要があります。
- それぞれ、ガラス75 Wの高周波電力および酸素分圧で7秒間の酸素プラズマクリーナーで処理スライド500ミリトールにPDMSレプリカを接合することによって囲まれたマイクロ流体チャネルを作成する。
3フロー実験
- インサートアルミニウム電極マイクロチャネル内のホールを介して指定の場所へ（0.029 "OD）と出口PEEKチューブ（1/32「OD）（ 図3Bを参照）。
- アルミニウム電極への高電圧短方形波パルスを生成するための18責任の電気機器を接続PDMSモールド中の溶液を流すと接触している（ 図3C参照 ）。注：装置は、パルス発生器と、社内に構築高電圧アンプで構成する必要があります18。
- （ 図3A参照 ）は、4つの50ml遠心個別DPBSを含むチューブに、細胞および生体分子の溶液、および空気式流量制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに各チューブを取り付けるを準備する。18
- マイクロ流体デバイス内の各入口穴にバイアルホルダーから入口PEEKチューブを接続します。
- 電気FIEを有するために100 Vに、方形波パルス、Vの大きさを設定するldは強度は、E = V / Lの電子 、電気室全体で0.7 kVの/ cmのと同等である。注：ここで、L eは正および負の電極が流動する溶液と接触している2点間の距離である（ 図1を参照）。
- 40 psiの圧力調整器を設定します。注：単一の手動調整可能な窒素源が均一にすべてのサンプルバイアルを加圧するために使用され、高速マニホールドが適時特注のLabVIEWソフトウェアを使用して、個別のソリューションポートを活性化するために利用される18
- バルブ制御のために、 バルブランナーラベル特注のLabVIEWソフトウェアを開き、操 作する権利を有するドロップダウンメニューから実行]をクリックします。
- 各対応するバルブのアイコンをクリックすることで、バルブの電源をオンにします。注：それが活性化されると、バルブのアイコンが緑色に点灯します。アクティブなアイコンをクリックすると、非アクティブにし、バルブを閉じます。閉弁アイコンがグレーに変わります。
- （DPBSリザーバー用のバルブを開けすなわち、1.5分間の安定な細胞トラップ渦発生に必要な主要な流速に洗浄液）。
- 30秒（ すなわち 、細胞捕捉ステップ）のためのエレクトロポレーションチャンバー内のトラップ細胞に対する細胞溶液を洗浄溶液から活性溶液ポートを切り替えます。
- ソリューション切り替えステップ中の破壊されていない流れを確保するために、細胞捕捉工程の前に10秒間、同時にデバイスを介して両方の洗浄および細胞のソリューションフロー。注：この簡潔な並行流ステップは、各ソリューション切り替えステップで繰り返されるべきである。
- 洗浄ポートの電源を入れ、非捕捉された混入細胞を除去するために、20秒間のデバイスをフラッシュします。
- デバイスに関心のある第一の分子（3,000 Daの中性及びアニオン性デキストラン分子の0.2 mg / mlの70,000 Daのニュートラルデキストラン分子の1.5 mg / mlの）を含有する溶液を注入する。
- 速やかに注入した後5短パルス（Δtは2秒間隔で30ミリ秒=）を適用分子溶液およびオシロスコープを使用してリアルタイムに印加される電気パルスの大きさおよび持続時間を監視します。
- 配信される追加の分子の数な回数だけ繰り返し手順3.10。各分子送達のために、余分な分子を除去するために100秒間洗浄溶液でデバイスをフラッシュし、その後、分子溶液に100秒間細胞をインキュベート。
- 5 psiの下の運転圧力を低下させることにより、下流解析のために、96ウェルプレート内の細胞を解放します。注：100細胞を用いた溶液約100μlを各リリースから収集されます。
- 実験的には、フローサイトメトリーのために十分な細胞を収集するために3.16三回を通じて3.9ステップ実行します。
- 228×gで5分間処理された細胞を含む96ウェルプレートを遠心する。
- 過剰な蛍光分子を含有する上清を取り除きます。
- フローサイトメトリー分析のためにDPBSで細胞を再懸濁します。
- 分子のuのためのフローサイトメーターでのロードセル効率分析をptake。
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Representative Results
開発された並列マイクロ流体エレクトロは、転移性乳癌細胞を生きたに多様なサイズと電荷を持つ高分子を送達した。成功した分子の送達は、定性的にその場で電気穿孔周回細胞の蛍光強度の変化を監視することによって決定し、フローサイトメトリー分析によって定量的測定によって確認した。 図4Aは、処理された細胞の90％が70,000 Daの中性デキストランを取り込むことを示している。統計分析のために、各フルオロフォアについての強度閾値は、未処理の生きた細胞の大部分（> 99％）が閾値以下にカウントされるように確立された（図4（c）参照 ）。効率は、正常に処理された細胞の総数に対する目的の分子を取り上げる細胞数の比として定義される。 図4Bは効率が実質的分子に依存して変化しないことを示して重量または電荷（P> 0.1）。すべての試験されたデキストラン分子は、70％よりも高い効率で細胞質ゾルに送達された。また、 図4Dは、シーケンシャルな分子の送達に成功し、同一の分子量（MW = 3000ダルトン）を用いて、アニオン性および中性デキストランを使用して56％の二重の分子送達効率で行われたことを示す。現在のシステムは、以前に報告されたシステム18よりも10倍高いスループットおよび多分子送達効率で細胞を処理することができ、この改善は、（それぞれ、アニオン性および中性デキストラン82％および70％）を単分子送達に影響を与えない。
図1（A）、エレクトロポレーション、マイクロ流体システムの概略図、（Cと表記）細胞用の入口からなる、分子（M1およびM2と表記）とフラッシュsolut（Fと表記）イオン、フォーカスが発生する慣性つの直線チャンネル、電極および出口と10エレクトロポレーションチャンバー。1μMFITC溶液とフラッシュ溶液を用いて、入口での（B）の溶液交 換のデモンストレーション（DPBS）が活性溶液いることを示し均一に下流の室の全てのアレイに注入することができる。画像コントラストは、ルックアップテーブル（LUT）を調整することによって強化される。スケールバーは250μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2の正の10（+）五負極からなる短パルス高電圧印加のために利用さ15ピン電極の写真で、（ - ）各正の電極は負極から2ミリメートル離間して、電子れる同じ極性のACH電極は1.35ミリメートル離れている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図実験装置の図3（A）は、流体制御装置、（B）マイクロ流体エレクトロと、（C）電気機器から成る。分子、細胞、きれいな緩衝液を用いて溶液を含有する（A）バイアルを個別に加圧されるオンデマンドでのLabView制御空気圧フローシステムを使用して。加圧されたバイアルから溶液を。インストールチェック弁付PEEKチューブを介してマイクロ流体エレクトロに注入される（B）および（C）の電気信号は、fに接触して、15ピン電極に送られるエレクトロポレーション工程の間に、マイクロ流体システム内のlowingソリューション。プログラムされた持続時間を有する電気パルスは、パルス発生器を使用して生成される電気パルスの大きさは、高電圧増幅器100 Vに増幅される。すべての印加された電気パラメータは、オシロスコープを使用してリアルタイムで監視されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4。代表的な各転送デキストラン分子のためのフローサイトメトリーデータ。成功した制御対応のものと比較して70,000 Daのアニオン性デキストラン分子を取り上げたMDA-MB-231細胞の（A）の蛍光シグナル、（B）の効率重要な分子依存性を示さないバリエーションた（p> 0.1）。（C）エレクトロポレーション（対照）で処理しなかった細胞についてのプロフィール、代表的なフローサイトメトリー。成功した分子の伝達を示す蛍光の閾値は、対照試料からの信号が閾値以下に見られるように、データから設定されます。順次エレクトロポレーションした細胞のためのデータフローサイトメトリー（D）代表流れ。右側のフローサイトメトリープロットと蛍光ストリーク画像内の緑、赤と黄色のボックスは、それぞれ、3000 Daのニュートラルデキストラン専用、アニオン性デキストランのみ、両方のデキストラン分子をuptaking細胞からの蛍光信号を表す。スケールバーは100メートルである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
スループットおよび多分子送達の効率の新しい並列化エレクトロポレーションプラットフォーム、10倍の増強に以前に開発単室システムが提供する全ての利点に加えて、達成された。18以前は利用可能なメリットは、（i）予備精製が含まれる生存能力増強のための均一なサイズ分布、（ii）の正確かつ個別分子の投薬管理、および（iii）低い運用電流を有する細胞を標的とする。これらは、分子量、共役フルオロフォアの種類、及び電荷の広い範囲で容易に利用可能であるため、蛍光標識デキストランは、目的の分子として選択した。彼らは生きている細胞のための不透過性の本質的に膜であり、細胞毒性を示さないので、これらのマクロ分子は、そのような研究のための良好な候補である。24最適な蛍光デキストランの濃度、インキュベーション時間、および電気的パラメータは、従来トン、現在のシステムのために同定されたエレクトロポレーション実験O。最適化プロセスによるリアルタイムでの分子の取り込みプロセスを監視するためのプラットフォームの能力をかなり単純かつ効率的であった。少しツーなしエレクトロポレーションパラメータの知識を有する分子または細胞型が試験されている場合には、このプロセスの可視化は非常に有益である。試験した全ての分子についてのインキュベーション時間は、成功した分子の送達が完了したことを示す、すべてのチャンバ10内に捕捉された細胞を、即座に検出可能な蛍光強度信号を発揮することにより、100秒とした。これは、分子の送達のために必要な最小潜伏期間はないことに注意してください。
それは、単に拡散4,19,25によりまたは電気泳動によって媒介されるかどうかを、エレクトロポレーションを用いた分子配信プロセスに関する長年の議論がありました。分子配達の主要なメカニズムの26の識別、比較、面倒な個別の一連のテストを必要とするトン彼は分子サイズ、電荷および電気パラメータに応じて成果。著者らの知る限りでは、これらの面倒な最適化処理は、従来のエレクトロポレーションシステムで報告されていなかった。支配的な分子配信メカニズムの識別のために許可された4,26-28開発されたシステムのシンプルなパラメータ最適化機能を、エレクトロポレーション効率の変化を調べることにより、分子と電気的パラメータに依存する。結果は、アニオン性の3000 Daのデキストランの効率が観察された分子の取り込みはおそらく拡散によって媒介されたことを示唆し、その中立相手（それぞれ83および75％）よりも有意に異ならなかったことを示した。他のエレクトロポレーションシステムとは異なり、処理された細胞は、連続的に、このシステムでエレクトロポレーションプロセス全体を通して攪拌した。周回細胞の蛍光シグナルの緩やかな増加が拡散はドミナになることを示唆し、観察されたntの配信メカニズム。中性7万Daのデキストラン分子の高効率分子の取り込み（90％）がさらにあっても高分子量で送達プロセスは、拡散の結果として起こることを意味する。最後に、3000 Daのアニオン性および中性デキストランの分子の成功の順次配信は、分子配信が分子料にもかかわらず発生しているとの主張を固化する。この結果は、膜の再封鎖がエレクトロポレーションの3分（分子配達当たり100秒）内に完了しないことを示唆している。
提示された分子配信プラットフォームを順次に関係なく電荷の分子サイズの広い範囲を提供することができます。各パラメータのタイムリーな微調整や修正は、リアルタイムプロセス監視機能によって支援少ない労力で達成することができる。システムのサイズに基づく細胞の精製プロセスは、面倒な試料調製および時間のかかる遠心分離前後のエレクトロポレーションの必要性を排除するステップ。さらに、システムの低動作電流は、実質的に細胞死を減少させる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、ローランドジュニア·フェロー· プログラムによってサポートされています。クリス·ストークス特注の、コンピュータ支援圧力制御のセットアップ博士ダイアンSchaak、の開発に彼の助けのため：著者はハーバード大学ローランド研究所の科学者やスタッフに感謝の意を表したいと思います生体試料処理のための彼女の入力、電気セットアップを開発するためのウィンフィールド·ヒル、Alavaroサンチェス博士のための圧力のセットアップに必要な機械の配管部品を機械加工するためのフローサイトメーター、スコットBevis、ケニースペンサーとドンロジャースへのアクセスを許可する。マイクロ流体のマスターは、ハーバード大学のナノスケールシステムセンター（CNS）で作製した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
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