Summary
En mikroflödes virvel assisterad elektroporering plattform utvecklades för sekventiell leverans av flera molekyler i identiska cellpopulationer med exakt och oberoende doseringskontroll. Systemets storlek baserad målcellen reningssteg före elektroporering hjälp för att öka molekylär leveranseffektivitet och bearbetat cellernas livskraft.
Abstract
Elektroporation har fått ökad uppmärksamhet under de senaste åren, eftersom det är en mycket kraftfull teknik för fysiskt införa icke-genomträngande exogena molekylära sonder in i celler. Arbetet redovisar en mikroflödeselektroplattform som kan utföra flera molekyl leverans till däggdjursceller med exakt och molekylär beroende parameterkontroll. Systemets förmåga att isolera celler med enhetlig storleksfördelning möjliggör mindre variation i elektroporation effektivitet per given elektrisk fältstyrka; därmed förbättrad prov livskraft. Dessutom tillåter sin process visualisering funktion för observation av det fluorescerande molekylära upptagsprocessen i realtid, vilket möjliggör snabb leverans parameterjusteringar molekylära på plats för effektivisering. För att visa de stora funktionerna i redovisade plattformen, makromolekyler med olika storlekar och elektriska laddningar (t.ex. dextran med MW 3000 och 70.000 Da) varlevereras till metastatiska bröstcancerceller med hög leveranseffektivitet (> 70%) för alla testade molekyler. Den utvecklade plattformen har visat sin potential att användas i utbyggnaden av forskningsområden där on-chip elektroporation tekniker kan vara till nytta.
Introduction
Under senare år har användningen av elektriska pulser för att underlätta cytosoliskt leverans av extracellulära molekyler blir ett attraktivt sätt att manipulera däggdjursceller. 1 Denna process, även känd som elektroporering, permeabilizes reversibelt cellmembranet, vilket möjliggör i sig membran ogenomträngliga molekyler för att få tillgång till cellernas intracellulära miljö. Eftersom praktiskt taget alla molekyl kan införas i cytosolen via tillfälliga skapade porer i membranet för alla typer av celler med hjälp av elektroporering har tekniken rapporterats som mer reproducerbar, universellt tillämpligt, och effektivare än andra metoder, inklusive virus-medierad, kemiska och optiska metoder. 2-3 Denna teknik har använts för att införa fluorescerande molekyler, fyra läkemedel 5 och nukleinsyror 6-7 samtidigt som cellerna livskraftig och intakt. Med tanke på dessa fördelar, har elektroporering antagits som en gemensam arbetsmarknadAtory teknik för DNA-transfektion, in vivo-genterapi 8 och vaccinationscellstudier. Det är emellertid fortfarande svårt för konventionella elektroporeringssystem för att samtidigt uppnå praktisk effektivitet och viabilitet för prover med stor heterogenitet i storlek eftersom den elektriska fältstyrkan som krävs för framgångsrik elektroporation korrelerar nära med cellens diameter. Dessutom behöver dessa system inte ger exakt kontroll av de olika molekylära mängder levereras på grund av beroendet av bulk stokastisk molekylär leveransprocessen. 9 För att ta itu med dessa frågor, har många grupper utvecklat mikroflödes elektroporation plattformar, erbjuder fördelen av lägre poreringsspänningar, bättre transfektionseffektivitet, en stor minskning av celldöd, och förmåga att leverera flera molekyler. 10-13 Dessa fördelar möjliggjordes på grund av de små spår av mikroskala elektroporation system vars elektrod tonhöjdlängder är under millimeter, dramatiskt minskar spänningar som krävs för en lyckad leverans. Dessutom kan dessa mikroskala elektroporation system uppnå en jämn elektriskt fält fördelning och snabbt försvinna genererade värme, vilket ger minskad celldödlighet samtidigt förbättra leveranseffektiviteten. Utnyttjandet av transparenta material för dessa mikrochips ytterligare möjliggör in situ observation av elektroprocess för snabba parameterändringar. 2,12 Men exakt dosering kontroll och molekylär- och cellberoende parameterkontroll, som krävs för att framväxande forskning och terapeutiska tillämpningar, 6, 14-16 fortfarande olösta.
Detta arbete presenteras ett mikrofluidvirvelassisterad elektroporation systemet, som kan leverera multipla molekyler sekventiellt i en i förväg vald identisk population av målceller. Celler med jämn storleksfördelning isoleras före elektroporering använder tidigare rapporterade size-selektiva fångstmekanism. 17-18 Genom att ha en jämn storleksfördelning, mindre variation i elektro effektivitet och förbättrad lönsamhet per given elektrisk fältstyrka uppnåddes. 19 Vidare ständigt agitera fångade celler med hjälp av mikroskala virvlar tillåtet för jämn leverans av molekyler över Hela cytosolen, i samförstånd med de resultat som tidigare rapporterats med en annan vortex assisterad elektroporering plattform. 20 För att visa att detta system skulle kunna tillämpas på ett brett spektrum av molekyler som vanligen används i biologiska tillämpningar, makromolekyler med en lång rad molekylvikter levererades till metastatiska bröstcancerceller. Dessutom med hjälp av realtidsprocessövervakning, ger detta arbete mer bevis för att få ett slut på den långvariga debatten om mekanismen för molekylär leverans under electrporation, övervägande elektrofores-medierad kontra diffusion-medierad. 14 6,14,21-22 drogleveransapplikationer 10,19 och applikationer som kräver för fördjupad förståelse av elektroporering molekylära genomförandemekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Framställning
- Plate 1 × 10 5 celler / ml i metastaserande bröstcancer cellinjen MDA-MB-231 i en volym av 10 ml per vävnadsodlings T75-kolv i Leibovitz L-15-medium kompletterat med 10% (vol / vol) fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin.
- Inkubera MDA-MB-231-celler i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 0% CO2 miljö.
- Skörda celler för experiment 2 dagar efter ympning genom att behandla celler med 0,25% trypsin-EDTA under 2 min och inaktivera trypsin s enzymatiska aktiviteten genom tillsats av 8 ml av tillväxtmediet.
- Pelletera celler genom centrifugering under 5 min vid 200 x g och återsuspendera i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS, 1x, utan Ca2 + och Mg2 +) till en slutlig koncentration av 5 x 10 5 celler / ml.
2 Device Design och Fabrication
OBS: Masken, master mögel påhitt ochmikro omslutande process skall genomföras i ett rent rum medan polydimetylsiloxanet (PDMS) mikro gjutning kan utföras på en vanlig laboratorie bänk.
- Utforma en mikrofluidikanordning såsom illustreras i figur 1 med AutoCAD. Enheten ska bestå av ett inlopp med flera injektionsportar, grovfilter och två parallella raka rektangulära tröghets fokuserar kanaler (L = 7 mm, B = 40 pm, och H = 70 pm). Individuell rak kanal består av 5 elektroporeringskammare, som är placerade 800 um från varandra (V C = 400 ^ m) med två via hål för aluminiumelektroder. Två tvären angränsande elektroporation kammare dela hålet för den negativa elektroden. Två raka kanaler samman i ett uttag vid nedströms elektro regionen.
- Konvertera CAD-filen med mikromönster till en GDSII fil med hjälp LinkCAD. Skriv mikromönster på en 5 "x 5" fotomask tommed hjälp av en laser maskritare. Develop masken genom att följa tillverkarens protokoll. OBS: Mask utvecklingsprocessen omfattar fotoresist utveckla, krom etsning och motstå borttagning. Alternativt mikromönster tryckt på en högupplöst transparens (> 20.000 dpi) kan köpas från en utomstående tillverkare och används som en fotomask. Slutliga mikroskala funktioner på en fotomask bör vara öppna för att matcha polariteten av en negativ fotoresist.
- Tillverka gjutformen anordningens utformning med användning av standard mjuk litografitekniker 23 med negativ fotoresist spunnits kappa på en 4 tums kiselskiva vid 2000 rpm för att få den slutliga tjockleken på 70 | im.
- Prebake wafern med negativ fotoresist för 20 min vid 95 ° C.
- Kontakta masken med skivan och utsättas för en UV-källa (17,4 mJ / cm 2) under 80 sekunder med hjälp av en mask Aligner.
- Utveckla den exponerade wafer för 4 min i en SU-8 utvecklare.
- Mätutvecklade fotoresist tjocklek med hjälp av en yta profilometer.
- Noggrant blanda en 10: 1 förhållande av elastomer till härdare (silikonelastomersats) och häll blandningen i gjutformen för att generera PDMS repliker. Avgasa gjutningen elastomeren under 30 minuter och härda i gjutformen med avgasad elast i en ugn vid 70 ° C under 2 tim.
- Delaminerar botas PDMS replik med mikrokanalmönster från formen och slå hål för inlopp, utlopp och elektrod infogningar med en pin skruvstäd. OBS: Den normala framkant diametern på stiftet vise skall vara 0,76 mm, tillräckligt för tätt hålla PEEK slang (OD 1/32 ") och aluminiumelektroder (OD av 0,029") på plats.
- Skapa slutna mikroflödes kanaler genom limning PDMS repliker till en glasskiva behandlad i en syreplasma rengöringsmedel för 7 sek vid en radiofrekvens makt och syrets partialtryck på 75 W och 500 mTorr, respektive.
3. Flödes Experiment
- Infogaaluminiumelektroder (0,029 "OD) och en utlopps PEEK slang (1/32" OD) till anvisade platser via hål i mikro (se figur 3B).
- Anslut den elektriska utrustningen 18 ansvarar för att generera högspännings kort fyrkantpulser till de aluminiumelektroder (se fig 3C) som är i kontakt med strömmande lösningar i PDMS formen. OBS: Utrustningen ska bestå av en pulsgenerator och en in-house byggt högspänningsförstärkare 18.
- Förbered fyra 50 ml centrifugrör för sig innehåller DPBS, lösningar med celler och biomolekyler, och bifoga varje rör till respektive flaska hållare som är ansluten till det pneumatiska flödet styrsystemet (se figur 3A). 18
- Anslut inlopps PEEK slang från flaskhållare i respektive inloppshålen i mikroflödessystem enhet.
- Ställ magnituden av fyrkantpulser, V, till 100 V i syfte att få den elektriska field styrka, E = V / L e, över elektrokammaren motsvara 0,7 kV / cm. ANMÄRKNING: Här, Lg är avståndet mellan två punkter, där de positiva och negativa elektroderna är i kontakt med det strömmande lösning (se Figur 1).
- Ställ in tryckregulatorn till 40 psi. OBS. En enda manuellt justerbar kvävekälla används för att jämnt tryck alla provflaskor och en höghastighetsgrenrör används för att snabbt aktivera individuella lösningar hamnar med hjälp av specialbyggda LabVIEW programvara 18
- För ventilstyrning, öppna specialbyggda LabVIEW programvara märkt Valve Runner, och klicka på Kör i rullgardinsmenyn med titeln skall fungera.
- Slå på ventiler genom att klicka på varje motsvarande ventil ikon. OBS: Ikonen Ventilen ska bli grön när den är aktiverad. Genom att klicka på ikonen aktiva avaktiveras och stänga ventilen. Ikonen stängd ventil ska vända grått.
- Öppna ventilen för DPBS reservoaren (dvs., tvättlösning) att prima flödeshastighet som krävs för en stabil cellfångstvirvelbildningen i 1,5 minuter.
- Slå den aktiva lösningen hamn ur tvättlösningen till cellen lösningen till trap-celler i elektroporering kammare för 30 sek (dvs. den cellinfångningssteget).
- Flow både tvätt och celllösningar genom enheten samtidigt i 10 sekunder innan den cell fånga steg för att säkerställa störningsfri flöde under lösningen matchningssteget. OBS: Detta korta steg sam-flöde ska upprepas vid varje lösning växling steg.
- Slå på tvätt hamnen och spola anordning för 20 sekunder för att avlägsna icke-fångade kontaminerande cellerna.
- Injicera lösningen innehåller den första molekylen av intresse (0,2 mg / ml på 3000 Da neutrala och anjoniska dextran molekyler eller 1,5 mg / ml 70.000 Da neutral dextran molekyl) i enheten.
- Applicera fem korta pulser (At = 30 msek med 2 sek mellanrum) omedelbart efter injektion avmolekylär lösning och övervaka omfattningen och varaktigheten av de använda elektriska pulser i realtid med hjälp av ett oscilloskop.
- Upprepa steg 3.10 så många gånger som antalet ytterligare molekyler som skall levereras. För varje molekyl leverans, inkubera celler för 100 s i molekylär lösning sedan spola anordningen med tvättlösning för 100 s för att avlägsna överskott av molekyler.
- Släpp cellerna i en 96-brunnars platta för nedströms analys genom sänkning av driftstryck under 5 psi. OBS: Cirka 100 l av lösningen med 100 celler samlas in från varje release.
- Kör den experimentella steg 3,9 till 3,16 tre gånger för att samla in tillräckligt med celler för flödescytometri.
- Centrifugera 96-brunnars platta innehållande bearbetade celler för 5 minuter vid 228 x g.
- Avlägsna supernatanten som innehåller överskott av fluorescerande molekyler.
- Resuspendera cellerna i DPBS för flödescytometrianalys.
- Lastceller i flödescytometern för molekylär uptake effektivitetsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den utvecklade parallella mikroflödes elektroporator levererat makromolekyler med varierande storlekar och elektriska laddningar i levande metastaserbröstcancerceller. Framgångsrik molekyl leverans ades kvalitativt bestämmas genom övervakning av förändringar i fluorescensintensitet av electroporated kretsande celler in situ och bekräftas av kvantitativa mätningar via flödescytometrianalys. Figur 4A visar att 90% av de behandlade cellerna penetration 70.000 Da neutral dextran. För den statistiska analysen, var en intensitetströskel för varje fluorofor utformas så att majoriteten (> 99%) av obearbetade levande celler räknas under tröskeln (se figur 4 (c)). Effektiviteten definieras som förhållandet mellan antalet celler som framgångsrikt ta upp molekylerna av intresse till det totala antalet behandlade celler. Figur 4B illustrerar att effektiviteten inte väsentligt varierar beroende på molekylvikt eller elektriska laddningar (P> 0,1). Alla testade dextranmolekyler levererades in i cytosolen med verkningsgrad på mer än 70%. Dessutom uppvisar figur 4D att sekventiell molekyl leverans fördes framgångsrikt med en dubbel molekyl leveranseffektivitet av 56% med användning av de anjoniska och neutrala dextraner med identisk molekylvikt (MW = 3000 Da). Det nuvarande systemet kan behandla celler med 10-faldigt högre genomströmning och multi-molekyl leveranseffektivitet än den tidigare rapporterade systemet 18 och denna förbättring inte påverkar enda molekyl leverans (82% och 70% för anjoniska och neutrala dextran, respektive).
Figur 1 (A) En schematisk bild av mikroflödes elektroporation systemet, som består av inlopp för celler (betecknad C), molekyler (betecknade som M1 och M2) och en flush solutjon (betecknad som F), två raka kanaler där tröghets fokusering sker, 10 elektroporation kammare med elektroder och ett utlopp. (B) Lösning utbyte demonstration vid inloppet med hjälp av en 1 ^ M FITC-lösning och en flush lösning (DPBS) visar att den aktiva lösningen kan vara jämnt injiceras alla arrayer av kammare nedströms. Bildkontrast förhöjs genom att justera uppslagningstabell (LUT). Skala barer är 250 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Ett fotografi av den 15-poliga elektrod utnyttjas för korta pulshögspännings ansökan, bestående av 10 positiva (+) och fem negativa elektroder (-). Varje positiv elektrod avstånd 2 mm från en negativ elektrod, och each elektrod av samma polaritet är på avstånd 1,35 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Schematisk av försöksapparaten, som består av (A) vätske styrenhet, (B) mikroflödes elektroporator, och (C) den elektriska utrustningen. (A) Flaskor som innehåller lösningar med molekyler, celler och ren buffert är individuellt tryck på begäran med hjälp av LabView styrda pneumatiska flödessystem. Lösningen från den trycksatta injektionsflaskan skall sprutas in i mikroflödes elektroporator genom PEEK-slang med en backventil installerad. (B) och (C) De elektriska signalerna sänds till 15-stiftselektroder i kontakt med fjande lösningen i mikroflödessystem under elektroporering steget. De elektriska pulser med den programmerade längden genereras med hjälp av pulsgenerator och storleken av den elektriska pulsen förstärks till 100 V med högspänningsförstärkare. Samtliga tillämpade elektriska parametrar övervakas i realtid med ett oscilloskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Representant flödescytometri data. (A) fluorescenssignaler av MDA-MB-231-celler, som framgångsrikt tog upp 70.000 Da anjoniska dextran molekyl jämfört med den hos kontroll motsvarighet. (B) Effektivitet för varje överfört dextranmolekyl inte uppvisar betydande molekylärt beroendevariation (p> 0,1). (C) Representant flödescytometri profiler för celler, som inte behandlades med elektroporering (kontroll). Den fluorescerande tröskel indikerar framgångsrika molekylär leverans är inställd från data så att signalerna från kontrollprover påträffas under tröskeln. (D) Representant flödescytometri data för sekventiellt elektro celler. Gröna, röda och gula rutor i flödescytometri tomten och fluorescerande streak bilder på höger sida representerar fluorescerande signaler från celler uptaking 3000 Da neutral dextran-bara, dextran-bara och anjoniska både dextran molekyler, respektive. Skala bar är 100 m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den nya parallelliseras elektroporering plattform, 10-faldig förbättring i genomströmning och effektivitet i fler molekyl leverans uppnåddes förutom alla de meriter som den tidigare utvecklade enkelkammarsystem ger. 18 Tidigare tillgängliga meriter inkluderar (i) för-rening av målceller med jämn storleksfördelning för lönsamhetsförbättring, (ii) exakta och individuella molekylär doseringskontroll, och (iii) låg operativ elektrisk ström. Fluorescerande dextraner valdes som molekyler av intresse eftersom de är lätt tillgängliga i en rad olika molekylvikter, konjugerade fluoroforenhetema typer och elektriska laddningar. Dessa makromolekyler är bra kandidater för en sådan studie, eftersom de till sin natur är membran ogenomträngliga för levande celler och inte uppvisar cytotoxicitet. 24 Optimal koncentration av fluorescerande dextran, inkubationstid och elektriska parametrar identifierades för det aktuella systemet före to de elektroporering experiment. Optimeringsprocessen var ganska enkelt och effektivt på grund av att plattformens förmåga att övervaka molekylupptag processen i realtid. Visualisering av denna process är mycket fördelaktigt om en molekyl eller cell typ med liten till ingen kunskap om elektroporation parametrar testas. Inkubationstiden för alla molekyler testade var inställt på att vara 100 s med vilka celler fastnar i alla 10 kamrarna uppvisar detekterbara fluorescerande intensitetssignaler i realtid, vilket indikerar slutförandet av framgångsrika molekylär leverans. Observera att detta inte är det minsta inkubation längd som krävs för molekylär leverans.
Det har varit en långvarig debatt om den molekylära leveransprocessen med hjälp av elektroporering, oavsett om det är enbart förmedlas av diffusion 4,19,25 eller genom elektrofores. 26 Identifiering av den dominerande mekanismen för molekylär leverans omfattar en rad mödosamma enskilda tester, att jämföra tHan utfall beroende på molekylstorlek, elektriska laddningar och elektroporation parametrar. Så vitt författarnas kunskap, dessa arbetskrävande optimeringsprocesser inte rapporterats med konventionella elektroporer system. 4,26-28 Den utvecklade systemets enkla parameteroptimering kapacitet tillåts för identifiering av den dominerande molekylära leveransmekanism, genom att undersöka variationer i elektroeffektiviteten beroende på molekylära och elektriska parametrar. Resultaten visade att effektiviteten i anjoniska 3.000 Da dextran var inte signifikant annorlunda än dess neutrala motsvarighet (83 och 75%, respektive), vilket tyder på att den molekylära upptag observerades eventuellt förmedlas av diffusion. Till skillnad från andra elektroporeringssystem, bearbetades celler kontinuerligt omröres hela elektroporering processen i detta system. Gradvis ökning av fluorescenssignaler från kretsande celler observerades, vilket tyder på att diffusion skulle vara den dominant leveransmekanism. Hög effektivitet molekylär upptag (90%) av neutrala 70.000 Da dextranmolekyler innebär vidare att även vid höga molekylvikter leveransprocessen sker som ett resultat av diffusion. Slutligen stelnar framgångsrika sekventiell leverans av 3.000 Da anjoniska och neutrala dextranmolekyler påståendet att molekylär leveransen sker trots molekylerna laddning. Detta resultat tyder också på att membranåterförslutning inte slutförs inom 3 min av elektroporering (100 sek per molekylär leverans).
Den presenterade molekylära leveransplattform kan sekventiellt leverera breda sortiment av molekylstorlekar oavsett deras elektriska laddningar. Snabb finjustering och modifiering av enskilda parametrar kan uppnås med liten ansträngning med hjälp av realtidsprocessövervakningskapacitet. Systemets storlek baserade cellreningsprocessen eliminerar behovet av mödosam provberedning och tidsödande centrifuge före och efter elektroporeringsteg. Dessutom systemets låga driftström väsentligt reducerar celldödlighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Rowland Junior Fellow-program. Författarna vill uttrycka tacksamhet till de forskare och personal vid Rowland institutet vid Harvard: Chris Stokes för hans hjälp i utvecklingen av skräddarsydda, datorstödd tryckreglering setup, Diane Schaak, Ph.D. för hennes bidrag till biologisk provhantering, Winfield Hill för att utveckla den elektriska installationen, Alavaro Sanchez, Ph.D. för tillgång till flödescytometern, Scott Bevis, Kenny Spencer och Don Rogers för bearbetning av mekaniska VVS komponenter som krävs för installationstrycket. Mikroflödes mästare tillverkades vid Centrum för nanosystem (CNS) vid Harvard University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J.
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C.
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M.
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
