Summary
Een microfluïdische vortex bijgestaan elektroporatie platform is ontwikkeld voor sequentiële levering van verschillende moleculen in dezelfde cel populaties met een nauwkeurige en onafhankelijke dosering controle. Het systeem afmeting gebaseerd doelcel zuiveringsstap voorgaande elektroporatie geholpen om moleculaire levering efficiëntie en verwerkt levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren.
Abstract
Elektroporatie wordt steeds prominenter in de afgelopen jaren, omdat het een zeer krachtige techniek voor lichamelijk introduceren niet-doordringende exogene moleculaire probes in cellen. Dit werk meldt een microfluïdische elektroporatie platform in staat om meerdere molecuul levering aan zoogdiercellen met nauwkeurige en moleculair-afhankelijke parameter controle. Vermogen van het systeem om cellen te isoleren uniforme grootteverdeling maakt minder variatie in electroporatie efficiency per gegeven elektrische veldsterkte; vandaar verbeterde levensvatbaarheid monster. Bovendien zijn de werkwijze visualisatie functie maakt waarneming van de fluorescerende moleculaire opname in real-time, nopen moleculaire levering parameterinstellingen maakt in situ efficiëntieverbetering. Om de enorme mogelijkheden van de gerapporteerde platform laten zien, macromoleculen met verschillende afmetingen en elektrische ladingen (bijvoorbeeld dextran met MW van 3.000 en 70.000 Da) warengeleverd aan uitgezaaide borstkanker cellen met hoge levering efficiëntie (> 70%) voor alle geteste moleculen. De ontwikkelde platform heeft het potentieel aangetoond voor gebruik in de uitbreiding van onderzoeksgebieden waar on-chip elektroporatie technieken kunnen nuttig zijn.
Introduction
De laatste jaren heeft het gebruik van elektrische pulsen cytosolische levering van extracellulaire moleculen vergemakkelijkt een aantrekkelijke manier manipuleren zoogdiercellen. 1 Deze werkwijze, ook bekend als elektroporatie, omkeerbaar permeabilizes het celmembraan, waardoor inherent ondoorlaatbaar membraan moleculen toegang krijgen intracellulaire milieu van de cellen. Omdat vrijwel elk molecuul in het cytosol worden ingebracht via tijdelijke gemaakt poriën in het membraan van een type cellen middels elektroporatie wordt de techniek gemeld als meer reproduceerbaar en universeel, en efficiënter dan andere methoden die virus-gemedieerde chemische en optische benaderingen. 2-3 Deze techniek is gebruikt om fluorescerende moleculen te introduceren, 4 5 drugs en nucleïnezuren 6-7 terwijl cellen levensvatbaar en intact houden. Gezien deze voordelen is elektroporatie is aangenomen als een gemeenschappelijke arbeidAtory techniek voor DNA transfectie in vivo gentherapie 8 en celvaccinatie studies. Het is echter nog steeds moeilijk conventionele elektroporatie systemen tegelijk het praktische efficiëntie en levensvatbaar monsters met grote heterogeniteit in grootte omdat de elektrische veldsterkte vereist voor succesvolle elektroporatie nauw correleert met de diameter van de cel. Bovendien hoeft deze systemen niet mogelijk een nauwkeurige controle van de verschillende moleculaire verschuldigde bedragen te worden geleverd aan de afhankelijkheid van bulk stochastische moleculaire leveringsproces. 9 Om deze kwesties aan te pakken, hebben veel groepen microfluïdisch elektroporatie platforms ontwikkeld en biedt het voordeel van lagere poratie- spanningen, betere transfectie-efficiëntie, een grote reductie in celsterfte en mogelijkheid om meerdere moleculen te leveren. 10-13 Deze voordelen zijn mogelijk gemaakt door de kleine sporen van microschaal elektroporatie systemen waarvan elektroden veldlengtes zijn sub-millimeter, drastisch verminderen van spanningen die nodig zijn voor een succesvolle levering. Bovendien kunnen deze microschaal elektroporatie systemen uniform elektrisch veld distributie te bereiken en te snelle oplossing van opgewekte warmte, waardoor een verminderde sterfte cel terwijl het verbeteren van de levering efficiëntie. Het gebruik van transparante materialen voor deze microchips verder laat in situ observatie van de elektroporatie proces voor snelle verandering van een parameter. 2,12 Echter, nauwkeurige dosering controle en moleculair en cellulair-afhankelijke parameter controle, die nodig zijn voor de opkomende onderzoek en therapeutische toepassingen, 6, 14-16 nog steeds niet opgelost.
Dit werk geeft een microfluïdische vortex-geassisteerde elektroporatie systeem waarmee meerdere moleculen sequentieel in een vooraf geselecteerde identieke populatie van doelcellen. Cellen met uniforme grootteverdeling worden geïsoleerd voorafgaand aan elektroporatie met eerder gerapporteerde siZE-selectieve trapping mechanisme. 17-18 Door een uniforme grootte distributie, minder variatie in elektroporatie efficiëntie en een verbeterde leefbaarheid per gegeven elektrische veldsterkte werden bereikt. 19 Bovendien, voortdurend roeren gevangen cellen met behulp van microschaal wervels toegestaan voor uniforme levering van moleculen door de gehele cytosol, in overeenstemming met de eerder gerapporteerde resultaten een andere vortex-geassisteerde elektroporatie platform. 20 Om aan te tonen dat dit systeem voor een breed scala aan moleculen gewoonlijk gebruikt in biologische toepassingen zou zijn macromoleculen met een uitgebreide lijst van molecuulgewichten werden geleverd uitgezaaide borstkankercellen. Bovendien, met behulp van real-time proces monitoring, dit werk geeft meer bewijs om een einde tijdens electrporation maken aan de jarenlange discussie over het mechanisme van de moleculaire levering, het zijn voornamelijk elektroforese-gemedieerde versus-diffusie bemiddelde. 14 6,14,21-22 drug delivery toepassingen 10,19 en toepassingen die voor een diepgaande kennis van elektroporatie moleculaire levering mechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Celbereiding
- Plaat 1 x 10 5 cellen / ml van metastatische borstkanker cellijn MDA-MB-231 in een volume van 10 ml per weefselkweek T75 kolf in Leibovitz L-15 medium gesupplementeerd met 10% (v / v) foetaal runderserum en 1 % penicilline-streptomycine.
- Incubeer MDA-MB-231 cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 0% CO2 omgeving.
- Oogst cellen voor proeven 2 dagen na zaaien door het behandelen van cellen met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 2 min en inactiveren enzymatische activiteit van trypsine door toevoeging van 8 ml van de groeimedia.
- Pellet cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 200 xg en resuspendeer in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS, 1x zonder Ca2 + en Mg2 +) tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 5 cellen / ml.
2 Apparaat ontwerp en fabricatie
LET OP: Het masker, meester schimmel verzinsels en demicrokanaal omhullende werkwijze worden uitgevoerd in een schone kamer, terwijl het polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanaal gietproces kan worden uitgevoerd op regelmatige laboratorium benchtop.
- Ontwerp een microfluïdische apparaat zoals geïllustreerd in figuur 1 met AutoCAD. Het apparaat moet bestaan uit een inham met meerdere injectiepoorten, grove filters en twee parallelle rechte rechthoekige traagheids focussen kanalen (L = 7 mm, B = 40 micrometer, en H = 70 micrometer). Individuele rechte kanaal bestaat uit 5 elektroporatie kamers die zijn geplaatst 800 urn uit elkaar (w C = 400 urn) met twee doorgaande gaten voor aluminium elektroden. Twee dwars aangrenzende elektroporatie kamers delen het gat voor de negatieve elektrode. Twee rechte kanalen samen te voegen in een stopcontact in de stroomafwaarts van de elektroporatie regio.
- Zetten het CAD-bestand met micro-patronen om een GDSII bestand met behulp LinkCAD. Schrijf de micro-patronen op een 5 "x 5" photomask leegmet behulp van een laser masker schrijver. Ontwikkel het masker door volgende protocol van de fabrikant. LET OP: Het masker ontwikkelingsproces omvat fotolak ontwikkelen, chroom etsen en ertegen verzetten. Alternatief micro-patronen gedrukt op een hoge resolutie transparantie (> 20.000 dpi) kan worden gekocht bij een derde party en als fotomasker. Final microschaal functies op een fotomasker moet transparant zijn voor de polariteit van een negatieve fotolak passen zijn.
- Fabriceren de gietmal van het ontwerp-apparaat met behulp van standaard zachte lithografie technieken 23 met een negatieve fotolak gesponnen jas op een 4 inch silicium wafer bij 2.000 tpm tot de uiteindelijke dikte van 70 micrometer hebben.
- Prebake de wafer met negatieve fotolak gedurende 20 min bij 95 ° C.
- Contact met het masker en de wafer bloot aan een UV bron (17.4 mJ / cm 2) voor 80 sec met een masker aligner.
- Ontwikkel de blootgestelde wafer voor 4 min in een SU-8 ontwikkelaar.
- Meet deontwikkelde fotoresist dikte met een oppervlak profilometer.
- Streng mix een 10: 1 verhouding van elastomeer verharder (siliconenelastomeer kit) en giet het mengsel in de gietvorm om PDMS replica genereren. Ontgas de casting elastomeer gedurende 30 min en genezen van de gietvorm met ontgaste elastomeer in een oven bij 70 ° C gedurende 2 uur.
- Delamineren genezen PDMS replica met microchannel patronen uit de mal en punch gaten voor inhammen, outlet en elektrode inserties met een naald bankschroef. LET OP: De normale snijvlak diameter van de pin bankschroef moet 0,76 mm, geschikt voor stevig vasthouden PEEK buis (OD van 1/32 ") en aluminium elektroden (OD van 0,029") op zijn plaats zijn.
- Maak omsloten microkanalen door metallisatie PDMS replica een glasplaatje behandeld in een zuurstof-plasma reiniger gedurende 7 seconden bij een radiofrequentie energie en zuurstof partiële druk van 75 W en 500 mTorr, respectievelijk.
3 Flow Experimenten
- Plaatsaluminium elektroden (0.029 "OD) en een uitlaat PEEK buis (1/32" OD) in speciale plaatsen via gaten in de microkanaal (zie figuur 3B).
- Sluit de elektrische uitrusting 18 verantwoordelijk voor het genereren high-voltage short blokgolf pulsen aluminium elektroden (zie figuur 3C) die in contact met stromend oplossingen in de PDMS mal. OPMERKING: Het apparaat moet bestaan uit een pulsgenerator en een in-house gebouwde hoogspanning versterker 18.
- Bereid vier centrifugebuizen van 50 ml DPBS individueel bevattende oplossingen met cellen en biomoleculen en bevestig elke buis om het betreffende vial houder aangesloten op de pneumatische flow control (zie figuur 3A). 18
- Sluit inlaat PEEK slang van de flacon houders in de respectieve inlaat gaten in de microfluïdische apparaat.
- Stel de grootte van blokvormige pulsen, V, 100 V om de elektrische fie hebbenld kracht, E = V / L e, over de elektroporatie kamer gelijk aan 0,7 kV / cm. OPMERKING: Hier, L e de afstand tussen twee punten waar de positieve en negatieve elektroden in contact met de stromende oplossing (zie figuur 1).
- Stel de drukregelaar tot 40 psi. OPMERKING:. Een enkel manueel verstelbare stikstof bron wordt gebruikt voor het gelijkmatig onder druk alle sample flesjes en een high-speed spruitstuk wordt gebruikt om tijdig te activeren individuele oplossing poorten met behulp van de custom-built LabVIEW software 18
- Voor klepbediening, opent u de custom-built LabVIEW software label Valve Runner, en klik op Uitvoeren in het dropdown-menu getiteld opereren.
- Schakel kleppen door te klikken op elke klep icoon. OPMERKING: Het pictogram wordt klep groen wanneer het wordt geactiveerd. Te klikken op het actieve icoon zal deactiveren en sluit de klep. De gesloten klep pictogram moet grijs.
- Open de klep voor de DPBS reservoir (dwz., wassen oplossing) aan premier de stroomsnelheid die nodig is voor een stabiele cel-trapping vortex generatie voor 1,5 min.
- Naar het actieve oplossingspoort van de wasoplossing de celoplossing te vangen cellen in de elektroporatie kamer gedurende 30 seconden (dat wil zeggen de cel invangingsstap).
- Vloeien zowel wassen en mobiele oplossingen door het apparaat tegelijkertijd gedurende 10 seconden voorafgaand aan de cel-trapping stap om ongestoorde doorstroming tijdens de oplossingsgerichte schakelen stap te verzekeren. LET OP: Deze korte co-flow stap moet worden herhaald bij elke oplossing switching stap.
- Zet de wasmachine poort en spoel het apparaat gedurende 20 seconden om niet-gevangen vervuilende cellen te verwijderen.
- Injecteer de oplossing die het eerste molecuul van belang (0.2 mg / ml of 3000 Da neutrale en anionische dextran moleculen of 1,5 mg / ml dextran 70.000 Da neutrale molecuul) in het apparaat.
- Solliciteer vijf korte pulsen (AT = 30 msec met 2 sec interval) onmiddellijk na injectie van demoleculaire oplossing en bewaken van de omvang en duur van het aangelegde elektrische pulsen in real-time met een oscilloscoop.
- Herhaal stap 3.10 zo vaak als het aantal extra moleculen te leveren. Voor elke moleculaire levering incubeer cellen voor 100 s in de moleculaire oplossing vervolgens spoelen van het apparaat met de wasoplossing voor 100 s om overmaat moleculen te verwijderen.
- Laat de cellen in een 96-wells plaat downstream analyse door het verlagen van de werkdruk onder 5 psi. OPMERKING: Ongeveer 100 ul oplossing met 100 cellen verzameld uit elke release.
- Voer de experimentele stappen 3.9 tot 3.16 drie maal om genoeg cellen te verzamelen voor flowcytometrie.
- Centrifugeer de 96-well plaat die verwerkte cellen gedurende 5 minuten bij 228 x g.
- Verwijder het supernatant dat overtollige fluorescerende moleculen bevat.
- Resuspendeer cellen in DPBS voor flowcytometrie analyse.
- Plaats cellen in de flowcytometer voor moleculaire uptake efficiency analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ontwikkelde parallelle microfluïdische electroporator geleverd macromoleculen met verschillende afmetingen en elektrische ladingen in levende uitgezaaide borstkankercellen. Succesvolle moleculaire levering werd kwalitatief bepaald door het volgen veranderingen in fluorescentie-intensiteit van geëlektroporeerde baan cellen in situ en bevestigd door kwantitatieve metingen via flowcytometrie analyse. Figuur 4A toont dat 90% van de behandelde cellen respons Het 70.000 Da neutrale dextran. Voor de statistische analyse de intensiteit drempel voor elk fluorofoor werd vastgesteld zodanig dat de meerderheid (> 99%) verwerkte levende cellen onder de drempel wordt geteld (zie figuur 4 (c)). Het rendement wordt gedefinieerd als de verhouding van het aantal cellen met succes toegang tot de moleculen van belang het totale aantal behandelde cellen. Figuur 4B illustreert dat de efficiëntie hoofdzaak niet Afhankelijk van moleculairegewicht of elektrische ladingen (P> 0,1). Alle geteste dextran moleculen werden gegeven in de cytosol met een rendement van meer dan 70%. Daarnaast figuur 4D toont dat sequentiële moleculaire levering succesvol werd uitgevoerd met een dubbel molecuul levering rendement van 56% met de anionische en neutrale dextranen met identieke molecuulgewicht (MW = 3.000 Da). Het huidige systeem kan verwerken cellen met 10-voudig hogere doorvoer en multi-molecule levering efficiëntie dan het eerder beschreven systeem 18 en deze verbetering niet invloed individuele molecuul levering (82% en 70% voor anionische en neutrale dextran, respectievelijk).
Figuur 1 (A) Een schema van het microfluïdische elektroporatie, bestaande uit inlaten voor cellen (aangeduid als C), moleculen (aangeduid als M1 en M2) en een flush Solution (aangeduid als F), twee rechte kanalen waar inertiële gericht plaatsvindt, 10 elektroporatie kamers met elektroden en een uitlaat. (B) Oplossing uitwisseling om op de inlaat met een 1 uM FITC oplossing en een spoeloplossing (DPBS) geeft aan dat de actieve oplossing kan op dezelfde wijze worden geïnjecteerd om alle arrays van kamers downstream. Beeldcontrast wordt verbeterd door aanpassing look-up table (LUT). Schaal bars zijn 250 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 een foto van de 15-pin electrode gebruikt voor korte puls hoog voltage toepassing, bestaande uit 10 positieve (+) en vijf negatieve elektroden (-). Elke positieve elektrode afstand 2 mm afgezien van een negatieve elektrode, en each elektrode met dezelfde polariteit op afstand staat 1,35 mm van elkaar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Schematische voorstelling van de experimentele inrichting, bestaande uit (A) de vloeistof regeleenheid, (B) de microfluïdische electroporator en (C) de elektrische uitrusting. (A) Flesjes bevattende oplossingen met moleculen, cellen en schoon buffer individueel stromend op aanvraag gebruik van de LabView bediende pneumatische stroom systeem. De oplossing uit de flacon onder druk wordt geïnjecteerd in de microfluïdische electroporator door PEEK buis met een terugslagklep geïnstalleerd. (B) en (C) De elektrische signalen worden naar 15-pinelektrodes verstuurd in contact met de fgende oplossing in het microfluïdische systeem tijdens de elektroporatie stap. De elektrische pulsen met de geprogrammeerde duur worden gegenereerd met de pulsgenerator en de grootte van de elektrische puls wordt versterkt tot 100 V door de hoge spanning versterker. Alle toegepaste elektrische parameters worden opgevolgd in real-time met behulp van een oscilloscoop. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Representatieve cytometrie gegevensstroom. (A) fluorescentiesignalen van MDA-MB-231 cellen, die met succes nam 70.000 Da anionogene dextran molecuul vergeleken met die van de controle tegenhanger. (B) De efficiëntie van elke overgedragen dextran molecuul vertonen geen significante moleculaire afhankelijkvariatie (p> 0,1). (C) Representatieve flowcytometrie profielen cellen, die niet werden behandeld met elektroporatie (control). De fluorescerende drempelwaarde aangeeft succesvolle moleculaire levering ingesteld van de gegevens, dat de signalen uit controlemonsters worden gevonden onder de drempel. (D) Representatieve doorstroomcytometrie gegevens sequentieel geëlektroporeerde cellen. Groen, rood en geel dozen in de flowcytometrie plot en fluorescerende streep beelden op de rechtse kant vertegenwoordigen fluorescerende signalen van cellen terughalen van 3.000 Da neutraal dextran-only, dextran-only anionische en beide dextranmoleculen, respectievelijk. Schaal bar is 100 meter. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de nieuwe parallelized elektroporatie platform, 10-voudige verhoging van de overslag en de efficiëntie van multi-molecuul aflevering werd in aanvulling op alle verdiensten die de eerder ontwikkelde single-kamer-systeem biedt bereikt. 18 Voorheen beschikbaar verdiensten omvatten (i) voorzuivering van doelcellen uniforme grootteverdeling levensvatbaarheid versterking, (ii) nauwkeurige en individuele moleculaire doseringssturing, en (iii) lage operationele elektrische stroom. Fluorescerend gemerkte dextranen werden gekozen als moleculen plaats omdat ze gemakkelijk verkrijgbaar in diverse molecuulgewichten, geconjugeerd fluorofoor types en elektrische ladingen. Deze macro-moleculen zijn goede kandidaten voor een dergelijk onderzoek, omdat ze van nature ondoorlaatbaar membraam voor levende cellen en vertonen geen cytotoxiciteit. 24 Optimale concentratie van fluorescerende dextran, incubatietijd, en de elektrische parameters werden geïdentificeerd voor het huidige systeem voor de to de elektroporatie experimenten. Het optimalisatieproces was vrij eenvoudig en efficiënt door het vermogen van het platform om de moleculaire opname in real-time te volgen. Visualisatie van deze werkwijze is zeer nuttig als een molecuul of celtype met weinig tot geen kennis van elektroporatie parameters wordt getest. De incubatietijd voor alle geteste moleculen werd ingesteld op 100 en waarbij cellen opgesloten in alle 10 kamers vertonen detecteerbare fluorescentie-intensiteit signalen in real time, waarin de succesvolle voltooiing van moleculaire levering. Merk op dat dit niet het minimum incubatie tijd nodig voor een moleculaire levering.
Er is een langdurige discussie over de moleculaire leveringsproces middels elektroporatie, was of deze uitsluitend gemedieerd door diffusie 4,19,25 of elektroforese. 26 Identificatie van het dominante mechanisme van moleculaire brengt een reeks moeizame individuele tests, vergeleken thij uitkomsten afhankelijk van moleculaire afmetingen, elektrische ladingen en elektroporatie parameters. Naar beste weten van de auteurs, werden deze moeizame optimalisatie processen niet gemeld bij conventionele elektroporatie systemen. 4,26-28 eenvoudige parameter optimalisatie mogelijkheden van Het ontwikkelde systeem toegestaan voor de identificatie van de dominante moleculaire levering mechanisme, door het onderzoeken van verschillen in de elektroporatie efficiëntie afhankelijk van de moleculaire en elektrische parameters. De resultaten toonden aan dat de efficiëntie van anionogene 3000 Da dextran was niet significant verschillend van dat van de neutrale tegenhanger (83 en 75%, respectievelijk), hetgeen suggereert dat de moleculaire geobserveerde opname mogelijk gemedieerd door diffusie. In tegenstelling tot andere systemen elektroporatie, werden cellen behandeld continu geroerd gedurende de elektroporatie werkwijze in dit systeem. Geleidelijke verhoging van de fluorescerende signalen van een baan om de cellen werd waargenomen, wat suggereert dat de diffusie zou de domina zijnnt levering mechanisme. High efficiency moleculaire opname (90%) neutrale 70.000 Da dextran moleculen impliceert verder dat zelfs bij hoge molecuulgewichten het leveringsproces optreedt als gevolg van diffusie. Tenslotte succesvolle sequentiële levering van 3.000 Da anionische en neutrale dextranmoleculen stolt de bewering dat moleculaire levering optreedt ondanks de moleculen lading. Dit resultaat suggereert ook dat membraan opnieuw sluiten niet binnen 3 minuten van elektroporatie (100 sec per moleculaire levering) voltooid.
De gepresenteerde moleculaire delivery platform kan sequentieel leveren grote reeksen van moleculaire afmetingen, ongeacht hun elektrische ladingen. Tijdige afstemming en aanpassing van individuele parameters kunnen worden bereikt met weinig inspanning geholpen door de real-time process monitoring mogelijkheden. -Afmeting gebaseerd cell zuivering van het systeem overbodig bewerkelijke monsterbereiding en tijdrovend centrifugatie voor en na elektroporatiestappen. Bovendien, lage operationele stroom van het systeem vermindert aanzienlijk cel sterfte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de Rowland Junior Fellow programma. De auteurs willen graag dankbaarheid aan de wetenschappers en medewerkers van het Instituut Rowland aan de Harvard uitdrukken: Chris Stokes voor zijn hulp bij de ontwikkeling van de custom-built, computerondersteunde drukregeling setup, Diane Schaak, Ph.D. voor haar input voor biologisch monster handling, Winfield Hill voor de ontwikkeling van de elektrische installatie, Alavaro Sanchez, Ph.D. voor het verlenen van toegang tot de flowcytometer, Scott Bevis, Kenny Spencer en Don Rogers voor de bewerking van mechanische onderdelen voor kranen die nodig zijn voor de druk setup. Microfluïdische meesters werden gefabriceerd bij het Center for Nanoscale Systems (CNS) aan de Harvard University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J.
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C.
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M.
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
