Summary
Mikrofluidisk vortex bistået elektroporation platform blev udviklet til sekventiel levering af flere molekyler i identiske cellepopulationer med præcis og uafhængig dosering kontrol. Systemets størrelsen baseret målcelle oprensningstrin forud elektroporering hjulpet at forbedre molekylær levering effektivitet og forarbejdet cellelevedygtighed.
Abstract
Elektroporation har fået stigende opmærksomhed i de seneste år, fordi det er en meget kraftfuld teknik til fysisk at indføre ikke-permeantmaterialer eksogene molekylære prober i celler. Dette arbejde rapporterer en mikrofluid elektroporation platform stand til at udføre flere molekyle levering til pattedyrceller med præcise og molekylær-afhængige parameter kontrol. Systemets evne til at isolere celler med ensartet størrelse fordeling tillader mindre variation i elektroporation effektivitet pr given elektrisk feltstyrke; dermed forbedret rentabilitet prøve. Desuden dens proces visualisering funktion giver mulighed for observation af fluorescerende molekylære optagelse proces i real-tid, hvilket sikrer hurtige molekylære justeringer levering parameter i stedet for effektivisering. For at vise de store kapaciteter af rapporterede platform, Makromolekyler med forskellige størrelser og elektriske ladninger (fx Dextran med MW 3.000 og 70.000 Da) varleveret til metastatiske brystkræftceller med høj levering effektivitet (> 70%) for alle testede molekyler. Den udviklede platform har vist sit potentiale til brug i udbygningen af forskningsområder, hvor on-chip elektroporeringsteknikker kan være gavnligt.
Introduction
I de senere år er brugen af elektriske impulser til at lette cytosolisk levering af ekstracellulære molekyler blive et attraktivt middel til at manipulere pattedyrceller. 1. Denne proces, også kendt som elektroporering, reversibelt permeabiliserer cellemembranen, der giver mulighed for selv membran uigennemtrængelige molekyler at få adgang til cellernes intracellulære miljø. Fordi næsten hvilket som helst molekyle kan indføres i cytosolen via midlertidigt skabte porer i membranen af enhver type af celler under anvendelse af elektroporation er teknikken blevet rapporteret som værende mere reproducerbar, universelt anvendelig, og mere effektivt end andre metoder, herunder virus-medieret, kemiske og optiske metoder. 2-3 Denne teknik er blevet anvendt til at indføre fluorescerende molekyler, 4 narkotika 5 og nukleinsyrer 6-7 samtidig holde celler levedygtige og intakte. Med disse fordele er elektroporation blevet vedtaget som en fælles arbejdsmarkedBAGGRUNDEN teknik til DNA-transfektion in vivo genterapi 8 og cellevaccination studier. Det er dog stadig vanskeligt for konventionelle elektroporation systemer samtidigt opnå praktiske effektivitet og levedygtighed for prøver med stor heterogenitet i størrelse, fordi den elektriske feltstyrke, der kræves for en vellykket elektroporation nøje korrelerer med cellens diameter. Hertil kommer, at disse systemer ikke tillader præcis styring af de mange molekylære beløb bliver leveret på grund af afhængighed af størstedelen stokastisk molekylær levering proces. 9 For at løse disse problemer, har mange grupper udviklet mikrofluide elektroporation platforme, der tilbyder den fordel af lavere perforeringselementer spændinger, bedre transfektionseffektiviteten, en stor reduktion i celle dødelighed, og evnen til at levere flere molekyler. 10-13 Disse fordele blev muliggjort på grund af de små spor af mikroskala elektroporation systemer, hvis beglængder er sub-millimeter dramatisk faldende spændinger, der kræves for en vellykket levering. Desuden kan disse mikroskala elektroporation systemer opnå en ensartet elektrisk felt distribution og hurtigt sprede frembragte varme, hvilket giver reduceret cellemortalitet samtidig øge levering effektivitet. Udnyttelsen af transparente materialer til disse mikrochips yderligere tillader in situ observation af elektroporation proces til hurtige ændringer af parametre. 2,12 Men præcis dosering kontrol og molekylære og cellulære afhængige parameter kontrol, der kræves for nye forskning og terapeutiske anvendelser, 6, 14-16 stadig uløst.
Dette arbejde viser en mikrofluid vortex-assisteret elektroporering, i stand til at levere flere molekyler sekventielt i en forudvalgt identisk population af målceller. Celler med ensartet størrelse fordeling er isoleret før elektroporation hjælp tidligere rapporteret size-selektiv indfangning mekanisme. 17-18 Ved at have en ensartet størrelsesfordeling, mindre variation i elektroporation effektivitet og øget levedygtighed pr givet elektriske feltstyrke blev opnået. 19. Endvidere løbende omrøring fanget celler under anvendelse mikroskala hvirvler tilladt for ensartet levering af molekyler på tværs af Hele cytosol, i overensstemmelse med resultaterne tidligere rapporteret at bruge en anden vortex-assisteret elektroporation platform. 20. For at vise, at dette system ville være gældende for en bred vifte af molekyler almindeligvis anvendes i biologiske anvendelser, Makromolekyler med en bred vifte af molekylære vægte blev leveret til metastatiske brystkræftceller. Hertil kommer, ved hjælp af real-time proces overvågning, dette arbejde giver flere beviser for at sætte en stopper for den langvarige debat om mekanismen for molekylær levering i løbet electrporation, bliver overvejende elektroforese-medieret versus diffusion-medieret. 14 6,14,21-22 medikamentleveringssystemerne applikationer 10,19 og applikationer, der kræver til dybdegående forståelse af elektroporation molekylære gennemførelsesmekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celle Fremstilling
- Plade 1 × 10 5 celler / ml metastatisk brystkræft cellelinien MDA-MB-231 i et volumen på 10 ml pr vævskultur T75 kolbe i Leibovitz L-15 medium suppleret med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1 % penicillin-streptomycin.
- Inkuber MDA-MB-231-celler i en befugtet inkubator ved 37 ° C med 0% CO2 miljø.
- Harvest celler til forsøg 2 dage efter podning ved behandling af cellerne med 0,25% trypsin-EDTA i 2 minutter og inaktivere trypsin enzymatiske aktivitet ved tilsætning af 8 ml af vækstmediet.
- Pelleter celler ved centrifugering i 5 minutter ved 200 x g og resuspender i Dulbeccos phosphatpufret saltvand (DPBS, 1x, uden Ca2 + og Mg2 +) til en slutkoncentration på 5 x 10 5 celler / ml.
2. Enhed design og fabrikation
BEMÆRK: Masken, master skimmel påfund ogmikrokanalplade omsluttende proces skal udføres inde i et rent værelse, mens polydimethylsiloxanet (PDMS) mikrokanalplade støbeprocessen kan udføres på en regelmæssig laboratorium bordplade.
- Designe en mikrofluid anordning som vist i figur 1 med AutoCAD. Enheden skal bestå af en fjord med flere indsprøjtningsåbninger, grove filtre og to parallelle rette rektangulære inertielle fokus kanaler (L = 7 mm, B = 40 um, og H = 70 um). Individuel lige kanal består af 5 elektroporation kamre, som er placeret 800 um fra hinanden (W C = 400 um) med to via huller til aluminium elektroder. To tværgående tilstødende elektroporation kamre deler hullet til den negative elektrode. To lige kanaler fusionere i en stikkontakt ved nedstrøms for elektroporation regionen.
- Konverter CAD-filen med mikro-mønstre til en GDSII fil ved hjælp LinkCAD. Skriv mikro-mønstre på en 5 "x 5" fotomasken tomhjælp af en laser maske forfatter. Develop masken ved at følge fabrikantens protokol. BEMÆRK: Masken udviklingsprocessen omfatter fotoresist udvikling, krom ætsning og modstå fjernelse. Alternativt mikro-mønstre trykt på en høj opløsning gennemsigtighed (> 20.000 dpi) kan købes fra en tredje producent fest og bruges som en fotomaske. Endelige mikroskala funktioner på en fotomaske skal være gennemskuelige for at matche polariteten af en negativ fotoresist.
- Fremstille støbeformen af enheden design ved hjælp af standard bløde litografiteknikker 23 med negativ fotoresist spundet pels på en 4 tommer siliciumskive ved 2000 rpm for at få den endelige tykkelse på 70 um.
- Prebake- wafer med negativ fotoresist i 20 minutter ved 95 ° C.
- Kontakt maske med skiven og udsættes for en UV-kilde (17,4 mJ / cm2) i 80 sekunder ved hjælp af en maske aligner.
- Udvikle den udsatte wafer i 4 min i en SU-8 udvikler.
- Måludviklede fotoresist tykkelse ved hjælp af en overflade profilometer.
- Strengt blande en 10: 1-forhold mellem elastomer hærdningsmiddel (silikoneelastomer kit), og hæld blandingen i støbeformen til at generere PDMS reproduktioner. Afgasses støbning elastomer i 30 minutter og hærde støbeformen med afgasset elastomer i en ovn ved 70 ° C i 2 timer.
- Delaminere helbredt PDMS replika med mikrokanalplader mønstre fra formen og huller til fjorde, outlet og elektrode indrykninger ved hjælp af en stift skruestik. BEMÆRK: Den normale forkant diameter af pinden skruestik bør være 0,76 mm, passende til PEEK rør (OD for 1/32 ") og aluminium elektroder (OD af 0,029") stramt holder på plads.
- Opret lukkede mikrofluidkanaler efter limning PDMS replikaer til et objektglas behandlet i en oxygen-plasma renere for 7 sek ved en radiofrekvens magt og oxygenpartialtryk på 75 W og 500 mTorr hhv.
3. Flow Eksperimenter
- Indsætaluminium elektroder (0,029 "OD) og en stikkontakt PEEK slangen (1/32" OD) i udpegede steder via huller i mikrokanalen (se figur 3B).
- Forbind det elektriske udstyr 18 ansvarlig for generering højspændingsledninger kort firkantpulser til aluminium elektroder (se figur 3C), der er i kontakt med strømmende løsninger i PDMS formen. BEMÆRK: Udstyret skal bestå af en puls generator og en in-house bygget højspænding forstærker 18.
- Forbered fire 50 ml centrifugerør individuelt indhold DPBS, løsninger med celler og biomolekyler, og vedhæft hvert rør til dets respektive hætteglas, der er tilsluttet den pneumatiske flow kontrol-system (se figur 3A). 18
- Tilslut indløb PEEK slangen fra hætteglasset holdere til de respektive indløb huller i mikrofluid enhed.
- Indstil størrelsen af firkantpulser, V til 100 V med henblik på at få den elektriske Field styrke, E = V / L e, på tværs af elektroporation kammer være svarende til 0,7 kV / cm. BEMÆRK: Her L e er afstanden mellem to punkter, hvor de positive og negative elektroder er i kontakt med det strømmende opløsning (se figur 1).
- Indstil trykregulatoren til 40 psi. BEMÆRK:. En enkelt justeres manuelt kvælstof kilde bruges til ensartet tryk alle prøvehætteglas og en high-speed manifold udnyttes til rettidig aktivere individuel løsning porte ved hjælp af specialbyggede LabVIEW software 18
- For ventilstyring, åbne specialbyggede LabVIEW software mærket Valve Runner, og klik på Kør fra rullemenuen titlen fungerer.
- Tænd ventiler ved at klikke på hver tilsvarende ventil ikon. BEMÆRK: Ikonet Ventilen skal blive grøn, når den aktiveres. Hvis du klikker på ikonet aktiv vil deaktivere og lukke ventilen. Ikonet lukket ventil skal vende grå.
- Åbn ventilen for DPBS reservoiret (dvs., vask løsning) til prime flow hastighed, der kræves for stabil celle fældefangst vortex generation i 1,5 min.
- Skift den aktive opløsning havn fra vaskeopløsning til cellen løsning til at fange celler i elektroporation kammer i 30 sek (dvs. trin celle-trapping).
- Flow både vask og-løsninger gennem enheden samtidigt i 10 sek forud for trin celle-fældefangst for at sikre uafbrudt flow ved løsningen-switching trin. BEMÆRK: Denne korte co-flow skridt bør gentages ved hver løsning-switching trin.
- Tænd vask havn og skylle enheden i 20 sekunder for at fjerne ikke-fanget kontaminerende celler.
- Injicer opløsningen indeholder det første molekyle af interesse (0,2 mg / ml 3.000 Da neutrale og anioniske dextranmolekyler eller 1,5 mg / ml af 70.000 Da neutral dextranmolekyle) ind i enheden.
- Påfør fem korte pulser (AT = 30 msek med 2 sek mellemrum) omgående efter injektion afmolekylær løsning og overvåge omfanget og varigheden af de anvendte elektriske impulser i realtid ved hjælp af et oscilloskop.
- Gentag trin 3.10 så mange gange som antallet af ekstra molekyler, der skal leveres. For hver molekylær levering inkuberes celler til 100 s i den molekylære løsning, så skylle enheden med vask løsning til 100 s for at fjerne overskydende molekyler.
- Slip cellerne i en 96-brønds plade til nedstrøms analyse ved at sænke driftstryk på under 5 psi. BEMÆRK: Ca. 100 ul opløsning med 100 celler indsamles fra hver udgivelse.
- Kør den eksperimentelle trin 3.9 gennem 3,16 tre gange for at indsamle nok celler til flowcytometri.
- Centrifugeres 96-brønds plade indeholdende forarbejdede celler i 5 minutter ved 228 x g.
- Fjern supernatanten, der indeholder overskydende fluorescerende molekyler.
- Resuspender celler i DPBS til flowcytometri analyse.
- Vejeceller i flowcytometret til molekylær uptake effektivitet analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den udviklede parallelle mikrofluid elektroporator leverede makromolekyler med forskellige størrelser og elektriske ladninger i levende metastatiske brystkræftceller. Vellykket molekylær levering blev kvalitativt bestemmes ved at overvåge ændringer i fluorescerende intensitet elektroporerede kredsende celler in situ og bekræftet ved kvantitative målinger via flowcytometri analyse. Figur 4A viser, at 90% af de behandlede celler optagelse 70.000 Da neutrale dextran. Til den statistiske analyse blev en intensitet tærskel for hver fluorofor fastsat sådan, at de fleste (> 99%) af uforarbejdede levende celler tælles under tærsklen (se figur 4 (c)). Effektiviteten defineres som forholdet mellem antallet af celler med held at optage de molekyler af interesse for det samlede antal behandlede celler. Figur 4B viser, at effektiviteten i det væsentlige ikke varierer afhængigt af molekylærvægt eller elektriske ladninger (P> 0,1). Alle testede dextranmolekyler blev leveret i cytosolen med effektivitet på over 70%. Desuden Figur 4D viser at sekventiel molekylær levering held blev udført med en dobbelt molekyle levering effektivitet på 56% ved hjælp af anioniske og neutrale dextraner med identisk molekylvægt (MW = 3.000 Da). Det nuværende system kan behandle celler med 10 gange højere gennemløb og multi-molekyle levering effektivitet end den tidligere rapporterede systemet 18 og denne forbedring påvirker ikke enkelt molekyle levering (82% og 70% for anioniske og neutrale dextran, henholdsvis).
Figur 1. (A) en skematisk afbildning af mikrofluid elektroporation, bestående af indløb for celler (benævnt C) molekyler (betegnet som M1 og M2) og en flush solution (benævnt F), to lige kanaler, hvor inertielle fokusering sker, 10 elektroporation kamre med elektroder og en stikkontakt. (B) Løsning udveksling demonstration ved indløbet ved hjælp af en 1 uM FITC-opløsning og en flush opløsning (DPBS) angiver, at den aktive løsning kan ensartet injiceres til alle arrays af kamre nedstrøms. Billede kontrasten forbedret ved at justere opslagstabel (LUT). Skalapanelerne er 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Et fotografi af 15-bens elektrode anvendes til korte puls højspænding anvendelse, bestående af 10 positive (+) og fem negative elektroder (-). Hver positiv elektrode anbragt 2 mm fra en negativ elektrode og ever elektrode af samme polaritet er anbragt 1,35 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skematisk af eksperimentelle apparatur bestående af (A) væsken styreenhed, (B) mikrofluid elektroporator, og (C) det elektriske udstyr. (A) Hætteglas indeholdende løsninger med molekyler, celler og ren buffer er individuelt tryk på efterspørgslen ved hjælp af LabView styrede pneumatiske flow-system. Opløsningen fra den tryksatte hætteglas injiceres i mikrofluid elektroporator gennem PEEK slangen med en kontrolventil installeret. (B) og (C) De elektriske signaler sendes til 15-pin elektroder i kontakt med fgende opløsning i mikrofluid systemet under elektroporation trin. De elektriske impulser med programmerede varighed er genereret ved hjælp af impulsgeneratoren og størrelsen af den elektriske puls forstærkes til 100 V af den høje spænding forstærker. Alle anvendte elektriske parametre overvåges i realtid ved hjælp af et oscilloskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative flowcytometri data. (A) Fluorescerende signaler af MDA-MB-231-celler, som med succes optog 70.000 Da anioniske dextranmolekyle, sammenlignet med kontrollen modstykke. (B) Virkningsgraden for hver overført dextranmolekyle ikke udviser signifikant molekylær afhængigvariation (p> 0,1). (C) repræsentant flowcytometri profiler for celler, som ikke blev behandlet med elektroporering (kontrol). Den fluorescerende tærskel indikerer vellykket molekylær levering er indstillet fra sådan, at signalerne fra kontrolprøver findes under tærsklen data. (D) Repræsentant flowcytometri data for sekventielt elektroporerede celler. Grøn, rød og gule bokse i flowcytometri plot og fluorescerende streak billeder på højre side repræsenterer fluorescerende signaler fra cellerne ophæve parkering 3.000 Da neutral dextran-only, anioniske dextran-only og begge dextranmolekyler hhv. Målestokken er 100 meter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den nye paralleliseret elektroporation platform 10 ganges forøgelse i gennemløb og effektiviteten af multi-molekyle levering blev opnået i over alle de fordele, at den tidligere udviklede enkelt kammer systemet giver. 18 Tidligere tilgængelige fordele indbefatter (i) forud for oprensning af målrette celler med ensartet størrelse fordeling for levedygtighed ekstraudstyr, (ii) præcise og individuelle molekylære dosering kontrol, og (iii) lave operationelle elektrisk strøm. Fluorescensmærkede dextraner blev valgt som molekyler af interesse, fordi de er let tilgængelige i en bred vifte af molekylære vægte, konjugerede fluoroforen typer og elektriske ladninger. Disse makro-molekyler er gode kandidater til en sådan undersøgelse, da de i sagens natur er membran uigennemtrængelig for levende celler og udviser ikke cytotoksicitet. 24 Optimal koncentration af fluorescerende dextran, inkubationstid, og elektriske parametre blev identificeret for det nuværende system før to elektroporation eksperimenter. Optimeringsproces var temmelig enkel og effektiv på grund af platformens evne til at overvåge molekylære optagelse proces i realtid. Visualisering af denne proces er meget gavnligt, hvis et molekyle eller en celletype med lille-til-ikke kendskab til elektroporation parametre bliver testet. Inkubationstiden for alle testede molekyler blev sat til at være 100 s ved hvilke celler er fanget i alle 10 kamre udviser påviselige fluorescerende intensitet signaler i realtid, der angiver afslutningen af en vellykket molekylær levering. Bemærk at dette ikke er den mindste inkubation varighed, der kræves til molekylær levering.
Der har været en mangeårig debat om molekylær levering proces med elektroporation, uanset om det udelukkende er medieret ved diffusion 4,19,25 eller ved elektroforese. 26 Identifikation af dominerende mekanisme molekylær levering indebærer en række besværlige individuelle test, sammenligne than resultater afhængigt molekylære størrelser, elektriske ladninger og elektroporation parametre. Til de bedste af forfatternes viden, blev disse arbejdskrævende optimeringsprocesser ikke rapporteret med konventionelle elektroporation systemer. 4,26-28 Det udviklede system enkle parameter optimering kapacitet tilladt for identifikation af den dominerende levering mekanisme molekylære, ved at undersøge variationer i elektroporation effektivitet afhængigt af molekylære og elektriske parametre. Resultaterne viste, at effektiviteten af anioniske 3.000 Da dextran var ikke signifikant anderledes end neutral modpart (henholdsvis 83 og 75%), hvilket antyder, at den molekylære optagelse observeret eventuelt blev medieret ved diffusion. I modsætning til andre elektroporation systemer blev behandlet celler kontinuerligt omrøres hele elektroporation processen i dette system. Gradvis stigning i fluorescerende signaler i kredsløb celler blev observeret, hvilket antyder, at diffusion ville være dominant levering mekanisme. Høj effektivitet molekylær optagelse (90%) af neutrale 70.000 Da dextranmolekyler indebærer endvidere, at selv ved høje molekylvægte leveringsprocessen opstår som følge af udbredelse. Endelig succes sekventiel levering af 3.000 Da anioniske og neutrale dextranmolekyler størkner påstanden om, at molekylær levering forekommer på trods af molekylerne afgift. Dette resultat antyder også, at membranen genlukning ikke er afsluttet inden 3 min af elektroporation (100 sek pr molekylær levering).
Den præsenterede molekylær levering platformen kan sekventielt levere store serier af molekylære størrelser, uanset deres elektriske ladninger. Rettidig finjustering og ændring af de enkelte parametre kan opnås med lille indsats hjulpet af real-time proces overvågningsfunktion. Systemets størrelse baseret celle rensningsprocessen eliminerer behovet for besværlige prøveforberedelse og tidskrævende centrifugering før og efter elektroporeringtrin. Desuden er systemet lave operationelle strøm væsentligt reducerer celle dødelighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af Rowland Junior Fellow-programmet. Forfatterne vil gerne udtrykke taknemmelighed til de forskere og ansatte på Rowland Institute på Harvard: Chris Stokes for hans hjælp i udviklingen af den specialbyggede, computerstøttet setup trykregulering, Diane SCHAAK, Ph.D. for hendes input til biologisk prøvehåndtering, Winfield Hill for at udvikle den elektriske setup, Alavaro Sanchez, Ph.D. for adgang til flowcytometret Scott Bevis, Kenny Spencer og Don Rogers til bearbejdning af mekaniske VVS komponenter, der kræves for trykket opsætning. Mikrofluide mestre blev fabrikeret på Center for Nanoscale Systems (CNS) ved Harvard University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
