Summary
Un tourbillon microfluidique plate-forme d'électroporation assistée a été développé pour la livraison séquentielle de plusieurs molécules dans des populations de cellules identiques avec contrôle de dosage précis et indépendant. Basé sur la taille de l'étape de purification de la cellule cible de l'électroporation précédentes du système aidé à améliorer l'efficacité d'administration moléculaire et la viabilité des cellules traitées.
Abstract
L'électroporation a reçu une attention croissante au cours des dernières années, car il s'agit d'une technique très puissante pour l'introduction de sondes moléculaires exogènes physiquement non par pénétration dans les cellules. Ce travail présente la plate-forme d'électroporation microfluidique capable d'effectuer la livraison de molécule multiple de cellules de mammifères avec contrôle des paramètres précis et moléculaire dépendant. La capacité du système à isoler les cellules avec une distribution uniforme de la taille permet une moindre variation de l'efficacité d'électroporation par l'intensité du champ électrique donné; donc amélioré viabilité de l'échantillon. Par ailleurs, sa fonction de visualisation de processus permet l'observation du processus d'absorption moléculaire fluorescent en temps réel, ce qui permet des ajustements de paramètres moléculaires rapides de délivrance in situ pour l'amélioration de l'efficacité. Pour montrer les vastes capacités de la plate-forme signalé, macromolécules de différentes tailles et des charges électriques (par exemple, Dextran avec MW de 3000 et 70 000 Da) étaientdélivré à des cellules de cancer du sein métastatique avec des rendements élevés de distribution (> 70%) pour toutes les molécules testées. La plate-forme développée a prouvé son potentiel d'utilisation dans l'expansion des domaines de recherche où sur puce techniques d'électroporation peuvent être bénéfiques.
Introduction
Au cours des dernières années, l'utilisation d'impulsions électriques pour faciliter la délivrance cytosolique des molécules extracellulaires est devenue un moyen attrayant de la manipulation de cellules de mammifères. 1 Ce processus, également appelé électroporation, perméabilise la membrane cellulaire de façon réversible, ce qui permet de façon inhérente des molécules membranaires imperméables à accéder au milieu intracellulaire des cellules. Étant donné que pratiquement n'importe quelle molécule peut être introduit dans le cytosol par les pores créés temporaires dans la membrane de n'importe quel type de cellules en utilisant l'électroporation, la technique a été rapporté comme étant plus reproductible, universellement applicable, et plus efficace que d'autres méthodes, y compris le virus à médiation chimique et les approches optiques 3.2. Cette technique a été utilisée pour introduire des molécules fluorescentes, quatre médicaments et des acides nucléiques 5 7.6 tout en conservant les cellules intactes et viables. Compte tenu de ces avantages, l'électroporation a été adopté comme un travail communtoire technique de l'ADN pour la transfection in vivo du gène thérapeutique et huit études de vaccination cellulaire. Il est cependant toujours difficile pour les systèmes classiques d'électroporation pour réaliser simultanément l'efficacité pratique et la viabilité des échantillons avec une grande hétérogénéité de taille car l'intensité du champ électrique nécessaire pour l'électroporation est en étroite corrélation avec succès le diamètre de la cellule. En outre, ces systèmes ne permettent pas un contrôle précis des quantités moléculaires multiples livré à cause du besoin en vrac processus moléculaire stochastique de livraison. 9 Afin de répondre à ces questions, de nombreux groupes ont développé des plates-formes d'électroporation microfluidiques, offrant l'avantage de tensions de poration inférieurs, meilleure efficacité de la transfection, une réduction importante de la mortalité cellulaire, et la capacité de fournir de multiples molécules. 10-13 Ces avantages ont été rendus possibles grâce aux petites empreintes de systèmes d'électroporation à micro-électrode dont la hauteurlongueurs sont des sous-millimètres, ce qui diminue considérablement les tensions nécessaires à la livraison réussie. De plus, ces systèmes à micro-électroporation peut obtenir une répartition uniforme du champ électrique et rapidement se dissiper la chaleur générée, ce qui donne une réduction de la mortalité cellulaire, tout en améliorant l'efficacité d'administration. L'utilisation de matériaux transparents pour ces puces électroniques supplémentaires permettant l'observation in situ du procédé d'électroporation pour des modifications de paramètres d'invite. 2,12 Toutefois, le contrôle du dosage précis et un contrôle de paramètres molecular- et cellulaire dépendante, nécessaires à la recherche et des applications thérapeutiques, 6 émergente, 14-16 restent encore en suspens.
Ce travail présente un système microfluidique d'électroporation assistée vortex, capable de délivrer de manière séquentielle de multiples molécules dans une population identique pré-sélectionnée de cellules cibles. Les cellules dont la distribution de taille uniforme sont isolés avant l'électroporation en utilisant si antérieurementMécanisme de ze-sélectif piégeage. 17-18 En ayant une distribution uniforme de la taille, moins la variation de l'efficacité de l'électroporation et la viabilité accrue par la force du champ électrique donné ont été obtenues. 19 En outre, l'agitation continue des cellules piégées à l'aide de tourbillons microscopique a permis de distribution uniforme de molécules à travers la toute cytosol, en accord avec les résultats précédemment déclaré utiliser une autre plate-forme d'électroporation assisté vortex. 20 Pour démontrer que ce système serait applicable à un large éventail de molécules couramment utilisées dans les applications biologiques, macromolécules avec une large gamme de poids moléculaires ont été livrés à cellules de cancer du sein métastatique. En outre, à l'aide de la surveillance des processus en temps réel, ce travail fournit plus de preuves pour mettre fin au débat de longue date en ce qui concerne le mécanisme de livraison moléculaire au cours electrporation, étant essentiellement électrophorèse médiée par rapport à la diffusion médiation. 14 6,14,21-22 10,19 et pour les applications nécessitant une compréhension en profondeur des mécanismes de prestation moléculaires d'électroporation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Préparation des cellules
- Planche 1 × 10 5 cellules / ml de la lignée cellulaire de cancer du sein métastatique MDA-MB-231 dans un volume de 10 ml par culture de tissus T75 ballon en milieu L-15 de Leibovitz supplémenté avec 10% (v / v) de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine.
- Incuber les cellules MDA-MB-231 cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 0% de CO 2 environnement.
- Récolte des cellules pour les expériences 2 jours après l'ensemencement des cellules par traitement avec 0,25% de trypsine-EDTA pendant 2 min et inactiver l'activité enzymatique de la trypsine en ajoutant 8 ml de milieu de croissance.
- un culot de cellules par centrifugation pendant 5 min à 200 x g et remise en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS, 1x sans Ca 2 + et Mg 2 +) à une concentration finale de 5 x 10 5 cellules / ml.
2. Dispositif Conception et fabrication
REMARQUE: Le masque, fabrications maître de moisissure et laprocessus d'enceinte de microcanaux doivent être menées à l'intérieur d'une salle blanche tandis que le polydiméthylsiloxane (PDMS) procédé de coulée de microcanaux peut être effectuée sur une paillasse de laboratoire régulière.
- Conception d'un dispositif microfluidique, comme illustré sur la figure 1 avec AutoCAD. Le dispositif devrait être composé d'une entrée avec des ports d'injection multiples, filtres grossiers et deux inertie en se concentrant canaux rectangulaires droites parallèles (L = 7 mm, W = 40 um, et H = 70 pm). Chaîne droite individuelle se compose de cinq chambres d'électroporation, qui sont placés en dehors de 800 um (C = W 400 um) avec deux trous d'interconnexion des électrodes d'aluminium. Deux chambres d'électroporation transversalement adjacents partagent le trou de l'électrode négative. Deux chaînes droites fusionnent en une sortie à l'aval de la région d'électroporation.
- Convertir le fichier CAO avec des micro-modèles dans un fichier GDSII utilisant LinkCAD. Ecrire les micro-motifs sur un 5 "x 5" photomasqueavec un graveur de masque laser. Développer le masque en suivant le protocole du fabricant. REMARQUE: Le processus de développement de masque comprend résine photosensible développement, la gravure de chrome et résister à l'enlèvement. Sinon, micro-motifs imprimés sur un transparent à haute résolution (> 20 000 ppp) peut être acheté auprès d'un fabricant tiers et utilisé comme un masque photographique. Fonctions à micro-finales sur un photomasque devraient être transparentes pour correspondre à la polarité d'une résine photosensible négative.
- Fabriquer le moule de coulée de la conception du dispositif en utilisant des techniques classiques de lithographie douce 23 avec une couche photosensible négative filé sur une tranche de silicium de 4 pouces à 2000 tours par minute pour avoir l'épaisseur finale de 70 pm.
- Précuites la plaquette de résine photosensible négative pendant 20 min à 95 ° C.
- Contacter le masque avec la tranche et exposer à une source d'UV (17,4 mJ / cm 2) pendant 80 secondes en utilisant un aligneur de masque.
- Développer la tranche exposée pendant 4 minutes dans un révélateur SU-8.
- Mesurer l'l'épaisseur de la résine photosensible développée en utilisant un profilomètre de surface.
- Rigoureusement mélanger un ratio de 10: 1 en élastomère à l'agent (kit d'élastomère de silicone) le durcissement et versez le mélange sur le moule pour produire des répliques PDMS. Dégazer l'élastomère de coulée pendant 30 minutes et traiter le moule de coulée d'élastomère dégazé dans une étuve à 70 ° C pendant 2 heures.
- Décoller guéri réplique PDMS avec des motifs de microcanaux du moule et percer des trous pour les entrées, sorties et électrodes insertions en utilisant un étau broches. Remarque: le diamètre de bord de coupe normale de l'étau de la broche doit être de 0,76 mm, suffisante pour maintenir fermement un tube en PEEK (OD de 1/32 ") et des électrodes en aluminium (DO de 0,029") à la place.
- Créer des canaux microfluidiques fermés par collage PDMS répliques sur une lame de verre traitée dans un nettoyeur à plasma d'oxygène pendant 7 secondes à une puissance et pression partielle d'oxygène de 75 W et 500 mTorr, respectivement fréquence radio.
3. Expériences de débit
- Insérerdes électrodes d'aluminium (0,029 ") de diamètre extérieur et un tube de sortie de PEEK (1/32" DO) en des endroits désignés par l'intermédiaire de trous dans les microcanaux (voir la figure 3B).
- Brancher l'équipement électrique 18 responsable de la production à haute tension de courtes impulsions rectangulaires aux électrodes d'aluminium (voir la figure 3C) qui sont en contact avec des solutions qui coule dans le moule PDMS. REMARQUE: L'équipement devrait être composé d'un générateur d'impulsions et d'un amplificateur de haute tension dans la maison construite 18.
- Préparer 50 ml de quatre tubes à centrifugation contenant individuellement DPBS, des solutions avec des cellules et des biomolécules, et fixer chaque tube à son support de flacon respectif connecté au système de commande d'écoulement pneumatique (voir la figure 3A) 18.
- Connecter le tuyau d'PEEK entrée des détenteurs des flacons dans les trous d'entrée respectives dans le dispositif microfluidique.
- Réglez l'amplitude d'impulsions rectangulaires, V, 100 V afin d'avoir la FIE électriquerésistance à ld, E = V / e L, à travers la chambre d'électroporation être équivalent à 0,7 kV / cm. NOTE: Ici, L e est la distance entre deux points où les électrodes positive et négative sont en contact avec la solution qui s'écoule (voir figure 1).
- Régler le régulateur de pression de 40 psi. REMARQUE:. Une source d'azote réglable manuellement unique est utilisé pour mettre sous pression de manière uniforme tous les flacons d'échantillon et un collecteur à haute vitesse est utilisé pour activer en temps opportun des ports individuels de la solution en utilisant le logiciel LabVIEW intégré personnalisé 18
- Pour le contrôle de la vanne, ouvrir le logiciel intégré de LabVIEW personnalisé appelé Valve Runner, et cliquez sur Exécuter dans le menu déroulant intitulé fonctionnent.
- Ouvrir les robinets en cliquant sur l'icône de chaque soupape correspondant. REMARQUE: L'icône de la vanne doit devenir vert quand il est activé. Cliquez sur l'icône active désactiver et fermer la vanne. L'icône de la vanne fermée devrait devenir gris.
- Ouvrez la vanne du réservoir DPBS (c.-à-., la solution de lavage) pour amorcer la vitesse d'écoulement stable nécessaire à la cellule de piégeage de génération de vortex pendant 1,5 min.
- Mettre l'orifice de solution active à partir de la solution de lavage à la solution de cellules à piéger les cellules dans la chambre d'électroporation de 30 secondes (à savoir, l'étape de piégeage de cellule).
- Circuler dans les deux solutions de lavage et de cellule à travers le dispositif pendant 10 secondes à la fois, avant l'étape de piégeage de cellule à assurer un écoulement sans perturbation pendant l'étape de mise en solution. REMARQUE: Cette étape co-courant bref doit être répété à chaque étape de solution de commutation.
- Tournez sur le port de lavage et rincer l'appareil pendant 20 secondes afin d'éliminer les cellules contaminantes non piégés.
- Injecter la solution contenant la première molécule d'intérêt (0,2 mg / ml de 3.000 Da molécules de dextran neutre et anionique ou 1,5 mg / ml de 70 000 Da neutre molécule de dextran) dans le dispositif.
- Appliquer cinq impulsions courtes (At = 30 ms avec 2 secondes d'intervalle) rapidement après l'injection de lasolution moléculaire et contrôler l'amplitude et la durée des impulsions électriques appliquées en temps réel à l'aide d'un oscilloscope.
- Répétez l'étape 3.10 autant de fois que le nombre de molécules supplémentaires pour être livré. Pour chaque livraison moléculaire, incuber les cellules pour 100 s dans la solution moléculaire puis rincer l'appareil avec la solution de lavage pour 100 s pour éliminer les molécules excédentaires.
- Libérer les cellules dans une plaque à 96 puits pour l'analyse en aval en réduisant la pression de fonctionnement inférieure à 5 psi. REMARQUE: Environ 100 pi de solution avec 100 cellules est prélevé sur chaque version.
- Exécutez l'expérimental étapes 3.9 par 3.16 trois fois de recueillir suffisamment de cellules pour la cytométrie de flux.
- Centrifuger la plaque de 96 puits contenant des cellules traitées pendant 5 min à 228 x g.
- Eliminer le surnageant qui contient des molécules fluorescentes excès.
- Remettre en suspension les cellules dans du DPBS pour cytométrie de flux.
- Les cellules de charge dans le cytomètre de flux pour u moléculaireptake analyse de l'efficacité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le électroporateur microfluidique parallèle développé livré macromolécules avec des tailles variées et des charges électriques dans les cellules de cancer du sein métastatique vivre. Livraison réussie moléculaire a été déterminée qualitativement par des changements dans l'intensité de fluorescence des cellules par électroporation en orbite autour de la surveillance in situ et confirmée par des mesures quantitatives par analyse de cytométrie en flux. Figure 4A montre que 90% des cellules traitées meilleure assimilation du dextrane 70 000 Da neutre. Pour l'analyse statistique, un seuil d'intensité pour chaque fluorophore a été établi de telle sorte que la majorité (> 99%) des cellules vivantes à l'état brut est compté au-dessous du seuil (voir la figure 4 (c)). Le rendement est défini comme le rapport du nombre de cellules avec succès reprenant les molécules d'intérêt pour le nombre total de cellules transformées. Figure 4B illustre que le rendement ne varie pas sensiblement selon moléculairepoids ou électriques charges (P> 0,1). Toutes les molécules de dextrane testés ont été délivrés dans le cytosol avec une efficacité supérieure à 70%. En outre, la figure 4D montre que la livraison moléculaire séquentielle a été effectuée avec succès avec une double efficacité de livraison molécule de 56% en utilisant les tensioactifs anioniques et neutres dextranes de poids moléculaire identique (MW = 3000 Da). Le système actuel peut traiter les cellules avec 10 fois plus élevée débit et multi-molécule efficacité de livraison que le système précédemment rapporté 18 et cette amélioration n'affecte pas la livraison de molécule unique (82% et 70% pour les tensioactifs anioniques et neutres dextran, respectivement).
Figure 1: (A) Un schéma du système d'électroporation microfluidique, comprenant des entrées pour des cellules (notée C), les molécules (désignés par M1 et M2) et une chasse d'eau solution (notée F), deux canaux rectilignes où inertielle se concentrant se produit, 10 chambres de l'électroporation avec des électrodes et une sortie. (B) Solution change démonstration à l'entrée à l'aide d'une solution à 1 uM FITC et une solution de rinçage (DPBS) indique que la solution active peut être uniformément injecté à tous les tableaux de chambres en aval. le contraste de l'image est améliorée en ajustant la table de consultation (LUT). Les barres d'échelle sont de 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Une photographie de l'électrode à 15 broches utilisé pour l'application de courte impulsion de haute tension, consistant en 10 positif (+) et cinq électrodes négatives (-). Chaque électrode positive est espacé de 2 mm en dehors d'une électrode négative, et eélectrode haque de la même polarité est espacée de 1,35 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Schéma de l'appareil expérimental, constitué de (A), l'unité de régulation de fluide, (B) l'électroporateur microfluidique, et (C) de l'équipement électrique. (A) Les flacons contenant les solutions avec des molécules, des cellules et un tampon propre sont mis sous pression individuellement à la demande en utilisant le système d'écoulement pneumatique LabView contrôlée. La solution dans le flacon sous pression est injecté dans le tube à travers électroporateur microfluidique PEEK avec un clapet anti-retour installé. (B) et (C) Les signaux électriques sont envoyés aux électrodes 15 broches en contact avec le fsolution ci-système microfluidique dans le cours de l'étape d'électroporation. Les impulsions électriques à la durée programmée sont générés en utilisant le générateur d'impulsions et l'amplitude de l'impulsion électrique est amplifié à 100 V par l'amplificateur haute tension. Tous les paramètres électriques appliqués sont surveillées en temps réel à l'aide d'un oscilloscope. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 4 représentant la cytométrie de flux de données (A). Signaux fluorescents des cellules MDA-MB-231, qui a eu avec succès la molécule 70 000 Da de dextrane anionique, par rapport à celle de la contrepartie de commande (B). L'efficacité de chaque molécule de dextran transféré ne présentent pas significative moléculaire dépendvariation (p> 0,1). (C) de flux représentant des profils de cytométrie de cellules, qui n'ont pas été traités avec l'électroporation (contrôle). Le seuil de fluorescence indiquant la livraison réussie moléculaire est défini à partir des données de telle sorte que les signaux provenant des échantillons de contrôle se trouvent au-dessous du seuil. (D) représentant le débit des données pour les cellules par cytométrie de manière séquentielle à une électroporation. Boîtes vertes, rouges et jaunes dans la cytométrie en flux et à balayage, l'intrigue fluorescent images sur le côté droit représentent les signaux fluorescents à partir de cellules uptaking 3000 Da dextran-seulement neutre, anionique dextran seulement et deux molécules de dextran, respectivement. La barre d'échelle est de 100 m. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avec la nouvelle plate-forme d'électroporation parallélisée, l'amélioration de 10 fois le débit et l'efficacité de la livraison multi-molécule qui a été accompli en plus de tous les avantages que le système unique de la chambre précédemment développé fournit. 18 mérite Auparavant disponibles incluent (i) pré-purification de des cellules cibles avec une distribution uniforme de la taille de l'amélioration de la viabilité, (ii) un contrôle précis et dosage individuel moléculaire, et (iii) un faible courant électrique opérationnelle. Fluorescence dextranes marqués ont été choisis comme molécules d'intérêt parce qu'ils sont facilement disponibles dans une large gamme de poids moléculaires, les types de fluorophores conjugués, et des charges électriques. Ces macro-molécules sont de bons candidats pour une telle étude, car ils sont intrinsèquement membrane imperméable pour les cellules vivantes et ne présentent pas de cytotoxicité. 24 concentration optimale de dextran fluorescent, le temps d'incubation, et les paramètres électriques ont été identifiés pour le système actuel avant to les expériences d'électroporation. Le processus d'optimisation est plutôt simple et efficace grâce à la capacité de la plate-forme à surveiller le processus d'absorption moléculaire en temps réel. La visualisation de ce procédé est très avantageux si une molécule ou d'une cellule de type à peu-à-pas de la connaissance des paramètres d'électroporation est testé. Le temps d'incubation de toutes les molécules testées a été fixé à 100 l par lequel les cellules piégées dans les 10 chambres présentent des signaux d'intensité de fluorescence détectable en temps réel, indiquant la fin de la distribution moléculaire succès. A noter que ce n'est pas la durée minimale d'incubation nécessaire pour la livraison moléculaire.
Il ya eu un débat de longue date en ce qui concerne le processus de livraison moléculaire utilisant l'électroporation, si elle est uniquement médiée par diffusion 4,19,25 ou par électrophorèse. 26 identification du mécanisme dominant de livraison moléculaire implique une série de tests individuels laborieuses, en comparant til les résultats en fonction de dimensions moléculaires, des charges électriques et les paramètres d'électroporation. Au meilleur de la connaissance de l'auteur, ces processus d'optimisation laborieuses n'ont pas été rapportés avec les systèmes d'électroporation classiques. 4,26-28 simples capacité d'optimisation des paramètres du système mis au point a permis d'identifier le mécanisme moléculaire dominante de livraison, en examinant les variations de l'efficacité d'électroporation en fonction des paramètres électriques et moléculaires. Les résultats ont montré que l'efficacité des agents tensioactifs anioniques 3000 Da dextrane n'a pas été significativement différente de celle de sa contrepartie neutre (83 et 75%, respectivement), ce qui suggère que l'absorption moléculaire a été observée éventuellement médiée par diffusion. Contrairement à d'autres systèmes d'électroporation, les cellules traitées ont été agitées de façon continue pendant tout le processus d'électroporation dans ce système. A été observée augmentation progressive des signaux de fluorescence de cellules en orbite, ce qui suggère que la diffusion serait la dominamécanisme de livraison nt. Absorption moléculaire à haut rendement (90%) de 70 000 Da neutres molécules de dextrane implique en outre que, même à des poids moléculaires élevés du processus de livraison se produit à la suite de la diffusion. Enfin, la livraison séquentielle succès de 3000 Da molécules de dextran anioniques et neutres solidifie l'affirmation selon laquelle la livraison moléculaire se produit malgré la charge de molécules. Ce résultat suggère également que refermeture de la membrane n'est pas terminée à moins de 3 min de l'électroporation (100 secondes par livraison moléculaire).
La plate-forme de livraison moléculaire présentée peut séquentielle livrer de larges gammes de tailles moléculaires, indépendamment de leurs charges électriques. Opportun de réglage fin et la modification des paramètres individuels peuvent être obtenus avec peu d'effort aidé par la capacité de surveillance de processus en temps réel. Le procédé de purification de cellules fondé sur la taille du système élimine la nécessité d'une préparation de l'échantillon laborieux et prend du temps avant et après la centrifugation, l'électroporationétapes. En outre, un faible courant de fonctionnement du système réduit considérablement la mortalité cellulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le programme Rowland boursier junior. Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude aux scientifiques et le personnel de l'Institut Rowland à Harvard: Chris Stokes pour son aide dans le développement de l', dispositif de contrôle de pression assistée par ordinateur sur mesure, Diane Schaak, Ph.D. pour sa contribution à la manipulation des échantillons biologiques, Winfield Hill pour développer l'installation électrique, Alvaro Sanchez, Ph.D. d'accorder l'accès à la cytométrie en flux, Scott Bevis, Kenny Spencer et Don Rogers pour l'usinage de pièces de plomberie mécaniques requises pour la configuration de pression. Maîtres microfluidiques ont été fabriqués au Centre pour les systèmes à l'échelle nanométrique (CNS) à l'Université de Harvard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
