Summary
En microfluidic vortex assistert electroporation plattformen ble utviklet for sekvensiell levering av flere molekyler inn i identiske cellepopulasjoner med presis og uavhengig dosering kontroll. Systemets størrelse basert målcellen rensetrinn før elektroporering styrt for å øke molekylleveringseffektiviteten og behandlet celleviabilitet.
Abstract
Electroporation har fått økt oppmerksomhet de siste årene, fordi det er en svært kraftig teknikk for fysisk å innføre ikke-permeant eksogene molekylære prober inn i cellene. Dette arbeidet rapporterer en microfluidic electroporation plattform stand til å utføre flere molekyl levering til pattedyrceller med presis og molekylær avhengig parameter kontroll. Systemets evne til å isolere celler med ensartet størrelsesfordeling tillater mindre variasjon i elektroporering effektivitet per gitt elektrisk feltstyrke; dermed forbedret sample levedyktighet. Videre sin prosess visualisering funksjonen gir mulighet for observasjon av fluorescerende molekyl opptak prosessen i sanntid, som tillater rask molekylære levering parameterjusteringer in situ for effektivisering. For å vise de enorme mulighetene i rapporterte plattform, makromolekyler med forskjellige størrelser og elektriske ladninger (f.eks Dextran med MW 3000 og 70.000 Da) varlevert til metastatisk brystkreft celler med høy leverings effektivitet (> 70%) for alle testede molekyler. Den utviklede plattformen har vist dens potensial for bruk ved ekspansjon av forskningsfelt hvor på-chip electroporation teknikker kan være fordelaktig.
Introduction
De siste årene har bruken av elektriske pulser til rette cytosolic levering av ekstracellulære molekyler blitt et attraktivt midler til å manipulere pattedyrceller. 1 Denne prosessen, også kjent som elektroporering, permeabilizes reversibelt cellemembranen, slik at for iboende membran ugjennomtrengelig molekyler for å få tilgang til cellenes intracellulært miljø. Fordi praktisk talt en hvilken som helst molekyl kan bli introdusert inn i cytosol via midlertidige opprettet porene i membranen av hvilken som helst type av celler ved hjelp av elektroporering, har teknikken blitt rapportert å være mer reproduserbar, universelt anvendelig, og mer effektivt enn andre metoder, inkludert virus-mediert, kjemisk og optiske metoder. 2-3 Denne teknikken har blitt anvendt for å innføre fluorescerende molekyler, 4 5 medikamenter og nukleinsyrer 6-7 samtidig som levedyktige celler og intakt. Gitt disse fordelene, har elektroporering blitt vedtatt som et felles arbeidsmarkedAtory teknikk for DNA-transfeksjon, in vivo genterapi 8 og cellevaksinasjonsstudier. Det er imidlertid fremdeles vanskelig for konvensjonelle electroporation systemer for samtidig å oppnå praktisk effektivitet og levedyktighet for prøver med stor heterogenitet i størrelse fordi den elektriske feltstyrke som kreves for vellykket electroporation tett korrelerer med cellens diameter. Dessuten gjør disse systemene ikke tillater presis kontroll av flere molekylære beløpene blir levert på grunn av avhengighet av bulk stokastisk molekylær leveringsprosessen. 9 For å løse disse problemene, har mange grupper utviklet microfluidic electroporation plattformer, som tilbyr fordelen av lavere poration spenninger, bedre transfeksjon effektivitet, en stor reduksjon i dødelighet celle, og evne til å levere flere molekyler. 10-13 Disse fordelene ble gjort mulig på grunn av de små fotavtrykk av mikro electroporation systemer som elektrode banenlengder er under millimeter, dramatisk redusere spenninger som kreves for vellykket levering. Videre kan disse mikro electroporation systemer oppnå jevn elektrisk feltfordeling og raskt spre generert varme, noe som gir redusert dødelighet cellen og samtidig forbedre leveringseffektiviteten. Utnyttelsen av transparente materialer for disse mikrobrikker videre tillater in situ observasjon av electroporation prosess for rask parameter modifikasjoner. 2,12 imidlertid presis dosering og kontroll molekylær- og celleavhengig parameter styring, som kreves for frem forskning og terapeutiske anvendelser, 6, 14-16 fortsatt forbli uløst.
Dette arbeidet viser et mikrofluid vortex-assistert electroporation system, som kan levere flere molekyler sekvensielt inn i et forhåndsvalgt identisk populasjon av målceller. Celler med enhetlig størrelsesfordeling isoleres før elektroporering ved å bruke tidligere rapportert SIze-selektiv overlapping mekanisme. 17-18 Ved å ha en uniform størrelsesfordeling, mindre variasjon i elektroporering effektivitet og forbedret levedyktigheten per gitt elektrisk feltstyrke ble oppnådd. 19. Videre kontinuerlig omrøring fanget celler ved hjelp av mikro virvlene tillatt for jevn levering av molekyler over hele Hele cytosol, i overensstemmelse med resultatene som tidligere er rapportert ved bruk av en annen virvel-assistert electroporation plattform. 20. For å demonstrere at dette system ville være anvendbar på et bredt utvalg av molekyler som vanligvis benyttes i biologiske anvendelser, makromolekyler med et bredt område av molekylvekter ble levert metastatisk brystkreft celler. I tillegg, ved hjelp av sanntids prosessovervåking, gir dette arbeidet mer bevis for å få en slutt på den langvarige debatten om mekanismen molekylær levering i løpet electrporation, å være overveiende elektroforese-mediert versus diffusjon-mediert. 14 6,14,21-22 stoffet levering applikasjoner 10,19 og applikasjoner som krever for inngående forståelse av electroporation molekylære leveringsmekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Forberedelse
- Plate 1 x 10 5 celler / ml av metastatisk brystkreft-cellelinje MDA-MB-231 i et volum på 10 ml pr vevskultur T75 kolbe i Leibovitz L-15 medium supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1 % penicillin-streptomycin.
- Inkuber i MDA-MB-231-celler i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 0% CO 2 miljø.
- Slakte celler for forsøk 2 dager etter poding ved å behandle cellene med 0,25% trypsin-EDTA i 2 min og inaktivere trypsin sin enzymatiske aktivitet ved tilsetning av 8 ml av vekstmediet.
- Pellet celler ved sentrifugering i 5 min ved 200 x g og resuspender i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS, 1x, uten Ca 2 + og Mg 2 +) til en endelig konsentrasjon på 5 x 10 5 celler / ml.
2. Enhets design og fabrikasjon
MERK: Masken, master mold fabrikasjoner ogmicrochannel omsluttende prosessen skal gjennomføres inne i et rent rom, mens polydimetylsiloksan (PDMS) microchannel støpeprosessen kan utføres på en vanlig laboratoriebenkeplaten.
- Designe en microfluidic enhet som illustrert i figur 1 med AutoCAD. Anordningen bør bestå av et innløp med flere injeksjonsporter, grove filtre og to parallelle rette rektangulære treghets fokuserte kanaler (L = 7 mm, W = 40 mikrometer, og H = 70 mm). Individuelle rett kanal består av 5 electroporation kamre, som er plassert 800 mikrometer fra hverandre (W C = 400 pm) med to via hull for aluminiumelektroder. To tverrgående tilstøtende electroporation kamre har hull for den negative elektrode. To rette kanaler fusjonere til et uttak på nedstrøms electroporation regionen.
- Konvertere CAD-filen med mikro mønstre til en GDSII fil ved hjelp LinkCAD. Skriv mikro mønstre på en 5 "x 5" fotomaske blankved hjelp av en laser maske forfatter. Utvikle masken ved å følge produsentens protokoll. MERK: Masken utviklingsprosessen inkluderer fotoresist utvikling, krom etsing og motstå fjerning. Alternativt mikro mønstre trykt på en høy transparens oppløsning (> 20 000 dpi) kan kjøpes fra en tredjepart produsent og brukt som et fotomaske. Endelige mikro funksjoner på en fotomaske bør være gjennomsiktig for å matche polariteten en negativ fotoresist.
- Fremstill en støpeform av anordningen ved hjelp av standard utforming myk litografi teknikker 23 med en negativ fotoresist spunnet pels på en 4 tommers silisiumskive ved 2000 rpm for å ha den endelige tykkelse på 70 mikrometer.
- Prebake-skiven med negativ fotoresist i 20 min ved 95 ° C.
- Kontakt masken med wafer og utsettes for en UV kilde (17,4 MJ / cm 2) for 80 sek ved hjelp av en maske aligner.
- Utvikle den eksponerte wafer for 4 min i en SU-8 utvikler.
- Målutviklet fotoresist tykkelse ved hjelp av en overflate profilometer.
- Strengt blande en 10: 1 forhold av elastomer til herdemiddel (silikonelastomer kit) og hell blandingen i støpeformen for å generere PDMS replikaer. Avgasse støpe elastomer i 30 min og herde støpeformen med avgasset elastomer i en ovn ved 70 ° C i 2 timer.
- Avlaminere kurert PDMS replica med microchannel mønstre fra formen og hull for innløp, utløp og elektrodeinnsettinger ved hjelp av en pin skrustikke. NB: Den normale skjærekant diameter av hannskruestikken skal være 0,76 mm, er tilstrekkelig for å holde tett PEEK rør (OD av 1/32 ") og aluminium-elektroder (OD 0,029") på plass.
- Lag lukkede microfluidic kanalene ved liming PDMS kopier til en glass-slide ble behandlet i en oksygenplasmarenser for 7 sek på en radiofrekvens-effekt og oksygenpartialtrykk på 75 W og 500 mTorr, henholdsvis.
3. flømmingseksperimenter
- Sett innaluminiumselektroder (0,029 "OD) og et utløp PEEK rør (1/32" OD) inn i utpekte steder via hull i microchannel (se figur 3B).
- Koble det elektriske utstyret 18 er ansvarlig for generering av høyspente kort firkant-bølge-pulser til aluminiumselektroder (se figur 3C) som er i kontakt med flytende løsninger i PDMS formen. MERK: Utstyret bør bestå av en pulsgenerator og en in-house bygget høyt spenningsforsterker 18.
- Forbered fire 50 ml sentrifugerør inneholdende enkeltvis DPBS, løsninger med celler og biomolekyler, og feste hvert rør til dets respektive ampulle holderen koplet til det pneumatiske strømningsstyresystemet (se figur 3A). 18.
- Koble inntaks PEEK slangen fra flasken eierne i de respektive inntakshullene i microfluidic enheten.
- Sett omfanget av kvadrat-bølgeimpulser, V, 100 V for å få den elektriske fyld styrke, E = V / L e, over elektroporering kammeret være ekvivalent til 0,7 kV / cm. MERK: Her er L e avstanden mellom to punkter, hvor de positive og negative elektroder er i kontakt med den strømmende oppløsningen (se figur 1).
- Sett trykkregulatoren til 40 psi. MERK:. Et enkelt manuelt justerbare nitrogenkilde brukes til jevnt presse alle prøve ampuller og en høyhastighets manifold utnyttes til rettidig aktivere individuell løsning porter ved hjelp av spesialbygde LabVIEW 18
- For ventilkontroll, åpne spesialbygd LabVIEW software merket Valve Runner, og klikk Kjør fra nedtrekksmenyen berettiget operere.
- Slå på ventilene ved å klikke på hver tilsvarende ventil ikon. MERK: Ventilen ikonet skal bli grønn når den er aktivert. Ved å klikke på aktive ikon vil deaktivere og lukke ventilen. Den lukkede ventil ikonet skal gråne.
- Åpne ventilen for DPBS reservoar (ie., vaskeløsning) for å prime strømningshastigheten som skal behøves for en stabil celle-trapping generering av virvelstrømmer i 1,5 min.
- Slå den aktive løsningen porten fra vaskevannet til cellen løsning felle celler i electroporation kammer i 30 sekunder (dvs. cellen fangende trinn).
- Strømnings både vaske-og celle-løsninger gjennom enheten samtidig i 10 sekunder før cellen fangende trinn for å sikre uforstyrret strømning gjennom løsningen vekslingstrinn. MERK: Denne korte co-flow skritt bør gjentas ved hver løsning veksling trinn.
- Slå på vaske port og skylle enheten for 20 sek for å fjerne ikke-fanget forurensende celler.
- Sprøyt løsningen inneholdende det første molekyl av interesse (0,2 mg / ml 3000 Da nøytrale og anioniske dekstran-molekyler eller 1.5 mg / ml 70 000 Da nøytralt molekyl dekstran) inn i enheten.
- Påfør fem korte pulser (At = 30 msek med 2 sek mellomrom) umiddelbart etter injeksjon avmolekylær løsning og overvåke størrelsen og varigheten av de påførte elektriske pulser i sanntid ved hjelp av et oscilloskop.
- Gjenta trinn 3.10 så mange ganger som antallet av ytterligere molekyler som skal leveres. For hver molekyl levering, inkuberes cellene til 100 s i molekyl oppløsningen deretter spyl-enhet med vaskeløsning for 100 s for å fjerne overskytende molekyler.
- Slipp-celler i en 96-brønns plate for genetisk analyse ved å senke driftstrykket under 5 psi. MERK: Ca 100 ul oppløsning med 100 celler er hentet fra hver utgivelse.
- Kjør den eksperimentelle trinn 3.9 gjennom 3.16 tre ganger for å samle nok celler for flowcytometri.
- Sentrifuger 96-brønns plate som inneholder bearbeidede celler i 5 min ved 228 × g.
- Fjern supernatanten som inneholder overskytende fluorescerende molekyler.
- Suspender cellene i DPBS for flowcytometri analyse.
- Veieceller i strømningscytometeret for molekylær uptake effektivitet analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den utviklet parallelt microfluidic electroporator levert makromolekyler med varierte størrelser og elektriske ladninger i levende metastatisk brystkreft celler. Vellykket molekyl leveringen ble kvalitativt bestemmes ved overvåkning av endringer i de fluorescerende intensitet av electroporated kretsende celler in situ, og bekreftet ved kvantitative målinger via strømningscytometri-analyse. Figur 4A viser at 90% av behandlede celler opptak på 70 000 Da nøytral dekstran. For statistisk analyse ble en intensitetsterskel for hver fluorofor etablert slik at majoriteten (> 99%) av ubehandlet levende celler telles under terskelen (se figur 4 (c)). Virkningsgraden er definert som forholdet mellom antall celler med hell å ta opp molekyler av interesse for det totale antall behandlede celler. Figur 4B viser at effektiviteten ikke vesentlig variere avhengig av molekylvekt eller elektriske ladninger (P> 0,1). Alle testede dekstran-molekyler ble levert inn i cytosolen med virkningsgrad større enn 70%. I tillegg oppviser Figur 4D at sekvensiell levering molekyl ble vellykket utført med en dual molekyl leveringseffektiviteten på 56% ved hjelp av den anioniske og nøytrale dekstraner med identisk molekylvekt (MW = 3000 Da). Dagens system kan behandle cellene med 10-ganger høyere gjennomstrømning og multi-molekyl leveringseffektiviteten enn det som tidligere er rapportert systemet 18, og denne forbedringen påvirker ikke enkelt-molekyl levering (82% og 70% for anioniske og nøytrale dekstran, henholdsvis).
Figur 1. (A) En skjematisk av mikrofluid electroporation system, bestående av innløpene for celler (betegnet som C), molekyler (betegnet som M1 og M2) og en spyle solution (betegnet F), to rette kanaler hvor treghets fokus oppstår, 10 electroporation kamre med elektroder og et utløp (B). Løsnings utveksling demonstrasjons ved innløpet ved hjelp av en 1 iiM FITC-oppløsning og en spyleløsning (DPBS) indikerer at den aktive løsningen kan være jevnt sprøytet på alle rekker av kamre nedstrøms. Bildekontrast er forbedret ved å justere oppslagstabell (LUT). Scale barer er 250 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Et fotografi av den 15-polede elektrode benyttes for kort-puls med høy spenning anvendelse, som består av 10 positive (+) og fem negative elektroder (-). Blir hver positiv elektrode i avstand 2 mm bortsett fra en negativ elektrode, og each elektrode av samme polaritet er linjeavstand 1,35 mm fra hverandre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Skjematisk av den eksperimentelle anordning, som består av (A) fluidstyreenhet, (b) en mikrofluid electroporator, og (C) det elektriske utstyr. (A) Ampuller inneholdende løsninger med molekyler, celler og ren buffer er individuelt trykk on demand bruke LabView styrt pneumatisk flow system. Løsningen fra det trykksatte ampulle injiseres i mikrofluid electroporator gjennom PEEK rør med en tilbakeslagsventil installert. (B) og (C) De elektriske signalene blir sendt til 15-pinners elektroder i kontakt med fgende oppløsning i mikrofluidsystem under electroporation trinn. De elektriske pulser med den programmerte varighet er generert ved hjelp av pulsgeneratoren, og størrelsen av den elektriske puls blir forsterket til 100 V ved høye spenningsforsterker. Alle tilkoblede elektriske parametre overvåkes i sanntid ved hjelp av et oscilloskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Representative flowcytometri data. (A) Fluorescerende signaler av MDA-MB-231-celler, som med hell tok opp 70 000 Da anioniske molekyl dekstran, sammenlignet med kontroll motstykke (B). Effektiviteten for hver overført dekstran-molekylet ikke oppviser signifikant molekyl avhengigvariant (p> 0,1). (C) Representative flowcytometri-profiler for cellene, som ikke ble behandlet med elektroporering (kontroll). Den fluoriserende terskel som indikerer vellykket molekyl leveringen innstilles fra data slik at de signaler fra kontrollprøver er funnet under terskelen. (D) Representative flowcytometri data for sekvensielt elektroporert celler. Grønne, røde og gule boksene i flowcytometri tomt og fluorescerende strek bildene på høyre side representerer fluorescerende signaler fra celler uptaking 3000 Da nøytral dekstran beskyttet, anioniske dekstran-bare og begge dekstran molekyler, henholdsvis. Scale bar er 100 moh. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den nye parallelized electroporation plattform, 10-ganger forbedring i hastigheten og effektiviteten av multi-molekyl levering ble oppnådd i tillegg til de fordeler som den tidligere utviklet enkeltkammersystemet gir. 18. Tidligere tilgjengelige fordeler omfatter (i) før rensing av målrette celler med ensartet størrelsesfordeling for levedyktighet forbedring, (ii) presis og individuelle molekyldoseringskontroll, og (iii) lav operativ elektrisk strøm. Fluorescensmerkede dekstraner ble valgt som molekyler av interesse fordi de er lett tilgjengelige i et bredt område av molekylvekter, konjugerte fluoroforen typer og elektriske ladninger. Disse makromolekyler er gode kandidater for en slik studie siden de er iboende membran ugjennomtrengelig for levende celler og ikke oppviser cytotoksisitet. 24. Optimal konsentrasjon av fluorescerende dekstran, inkubasjonstid, og elektriske parametre ble identifisert for den aktuelle systemet før to electroporation eksperimenter. Optimaliseringsprosessen var ganske enkel og effektiv på grunn av plattformens evne til å overvåke den molekylære binding prosessen i sann tid. Visualisering av denne prosessen er meget fordelaktig hvis et molekyl eller celletype med liten til ingen kjennskap electroporation parametere blir testet. Inkubasjonstiden for alle molekyler som ble testet ble satt til å være 100 s ved hvilke celler fanget i alle 10 kamre oppviser fluorescerende detekterbare intensitetssignaler i sann tid, noe som indikerer avslutningen av et vellykket molekyl levering. Merk at dette ikke er den minste inkubering varighet kreves for molekyl levering.
Det har vært en langvarig debatt om den molekylære leveringsprosessen ved hjelp electroporation, enten det er utelukkende mediert ved diffusjon 4,19,25 eller ved elektroforese. 26 Identifikasjon av dominerende mekanismen for molekylær levering innebærer en rekke arbeidskrevende individuelle tester, sammenligne than utfall avhengig av molekylære størrelser, elektriske ladninger og electroporation parametere. Til det beste av forfatternes kunnskap, ikke ble rapportert disse møysommelige optimalisering prosesser med konvensjonelle electroporation systemer. 4,26-28 Den utviklet system enkle parameter optimalisering evne tillatt for identifikasjon av den dominerende molekyl levering mekanisme, ved å undersøke variasjoner i electroporation effektivitet avhengig av molekyl og elektriske parametre. Resultatene viste at effektiviteten av anioniske 3000 Da dekstran var ikke signifikant forskjellig enn for sin nøytrale motstykke (83 og 75%, respektivt), noe som tyder på at den molekylære binding ble observert muligens mediert av diffusjon. I motsetning til andre systemer electroporation, ble behandlet cellene kontinuerlig omrørt gjennom hele electroporation prosessen i dette systemet. Gradvis økning i fluorescerende signaler om bane rundt cellene ble observert, tyder på at spredningen ville være dominant levering mekanisme. Høy effektivitet molekylopptak (90%) av nøytrale 70.000 Da dekstran-molekyler antyder videre at selv ved høye molekylvekter oppstår leveringsprosessen som et resultat av diffusjon. Til slutt, vellykket sekvensiell levering av 3000 Da anioniske og nøytrale dekstran molekyler stivner påstanden om at molekylær levering skjer til tross for molekyler kostnad. Dette resultatet antyder også at membranen resealing ikke er fullført innen 3 min av elektroporering (100 sek per molekylær levering).
Den presenterte molekylære leveranseplattform kan sekvensielt levere et bredt sortiment av molekylære størrelser uavhengig av deres elektriske ladninger. Betimelig finjustering og modifikasjon av enkelte parametrene kan oppnås med liten innsats hjulpet av sanntids prosessovervåking evne. Systemets størrelse basert cellerenseprosessen eliminerer behovet for arbeidskrevende prøvepreparering og tidkrevende sentrifugering før og etter elektroporeringtrinn. Videre systemets lave driftsstrøm reduseres betydelig dødelighet celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Rowland Junior Fellow program. Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til forskere og ansatte ved Rowland Institute ved Harvard: Chris Stokes for hans hjelp i utviklingen av spesialbygde, dataassistert trykkontroll oppsett, Diane Sjakk, Ph.D. for hennes innspill for biologisk prøvehåndtering, Winfield Hill for å utvikle det elektriske oppsettet, Alavaro Sanchez, Ph.D. for å gi tilgang til strømningscytometeret, Scott Bevis, Kenny Spencer og Don Rogers for maskinering mekaniske VVS komponenter som kreves for trykk oppsett. Microfluidic mestere ble fabrikkert ved Senter for nanoskala Systems (CNS) ved Harvard University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
