Summary
Микрожидкостных вихрь помощь электропорации платформа была разработана для последовательного осуществления различных молекул в одинаковых клеточных популяций с точным и независимой лекарственной контроля. Размер основе стадия очистки клетки-мишени, предшествующий электропорации системы автоматизированного чтобы добавлять на молекулярную эффективность доставки и обработанную жизнеспособность клеток.
Abstract
Электропорация уделяется все больше внимания в последние годы, потому что это очень мощная техника для физически введения не-проникающего экзогенных молекулярных зондов в клетках. Эта работа сообщает микрофлюидном электропорации платформу, способную творить доставку несколько молекул в клетках млекопитающих с точным и молекулярно-зависимого управления параметрами. Способность системы изолировать клетки с равномерным распределением по размерам позволяет за меньшие изменения в эффективности электропорации в данной напряженности электрического поля; следовательно усиливается жизнеспособность образца. Кроме того, его функция визуализации процесса позволяет для наблюдения флуоресцентного молекулярного процесса поглощения в режиме реального времени, что позволяет оперативно коррективы молекулярных параметров поставки на месте для повышения эффективности. Чтобы показать обширные возможности отчетном платформы, макромолекулы с различными размерами и электрических зарядов (например, декстран с молекулярной массой 3000 и 70000 Da) былидоставлены в метастатических клеток рака молочной железы с КПД высокий доставки (> 70%) для всех тестируемых молекул. Разработанная платформа доказала свой потенциал для использования в разложении областях исследований, где на чипе методы электропорации может быть выгодно.
Introduction
В последние годы использование электрических импульсов, чтобы облегчить доставку цитозольного внеклеточных молекул стал привлекательным средством манипулирования клеток млекопитающих. 1 Этот процесс, известный также как электропорация, обратимо permeabilizes клеточной мембраны, что позволяет по своей природе мембран молекул непроницаемых, чтобы получить доступ к внутриклеточной среде клетки. Поскольку практически любую молекулу могут быть введены в цитозоле с помощью временных созданных поры в мембране любого типа клеток с использованием электропорации, техника сообщалось как более воспроизводимым, универсально применимыми, и более эффективным, чем другие методы, включая вирус-опосредованной, химической и оптические подходы. 2-3 Эта техника была использована для введения флуоресцентных молекул, 4 наркотики 5 и нуклеиновых кислот 6-7, сохраняя клетки жизнеспособны и нетронутыми. Учитывая эти преимущества, электропорации был принят в качестве общего трудаТехника Atory для трансфекции ДНК, в естественных условиях генной терапии 8 и исследования вакцинации клеток. Это, однако, все еще трудно обычные системы электропорации одновременно достичь практическую эффективность и жизнеспособность для образцов с большой неоднородности в размере, потому что напряженность электрического поля, необходимые для успешного электропорации тесно коррелирует с диаметром ячейки. Кроме того, эти системы не позволяют точное управление из нескольких молекулярных количествах поставляются в связи с зависимостью от объемной стохастических молекулярных процесса доставки. 9 В целях решения этих проблем, многие группы разработали микрофлюидных платформы электропорации, дает преимущество более низких напряжениях порации, лучше эффективность трансфекции, значительное снижение клеток смертности, и способность доставлять несколько молекул. 10-13 Эти преимущества стали возможными благодаря малых следы микромасштабных систем электропорации, чьи электрод шагдлины суб-миллиметров, резко уменьшая напряжения, необходимые для успешной реализации. Кроме того, эти микромасштабные системы электропорации можно добиться равномерного распределения электрического поля и быстро рассеивается выделяемое тепло, уступая снижением смертности клеток, повысить эффективность доставки. Использование прозрачных материалов для этих микрочипов дальнейших позволяет на месте наблюдения за процессом электропорации для быстрых изменений параметров. 2,12 Однако, точный контроль дозировки и молекулярно-и сотовой зависит от контроля параметров, необходимых для новых исследований и терапевтических приложений, 6, 14-16 все еще остаются нерешенными.
Эта работа представляет собой микрофлюидных вихревую-помощь электропорации систему, способную доставлять несколько молекул последовательно в заранее выбранном одинаковой населения клеток-мишеней. Клетки с равномерного распределения размера изолированы до электропорации с использованием сообщалось ранее сиге-селективный механизм захвата. 17-18 Имея однородное распределение по размеру, меньше отклонений в эффективности электропорации и повышенную жизнеспособность за данной напряженности электрического поля были достигнуты. 19 Кроме того, постоянно агитирует захваченных клеток с использованием микромасштабной вихри разрешено для равномерного доставки молекул через Весь цитозоле, в соответствии с результатами ранее сообщалось, с использованием другого вихревого при содействии электропорации платформу. 20, чтобы продемонстрировать, что эта система будет применяться для широкого диапазона молекул, обычно используемых в биологических приложений, макромолекул с широким диапазоном молекулярных масс были доставлены метастатических клеток рака молочной железы. Кроме того, с помощью мониторинга процесса в режиме реального времени, эта работа дает больше доказательств, чтобы положить конец долгой стоячей дискуссии относительно механизма молекулярной доставкой в electrporation, будучи преимущественно электрофорез опосредованного против диффузии опосредованной. 14 6,14,21-22 наркотиков доставки 10,19 и приложений, требующих для углубленного понимания электропорации механизмов молекулярных доставки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Приготовление клеток
- Пластина 1 × 10 5 клеток / мл метастатического клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 в объеме 10 мл на культуре ткани Т75 колбы в Лейбовица L-15 среде, дополненной 10% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки и 1 % пенициллина-стрептомицина.
- Инкубируйте MDA-MB-231 клеток в увлажненном инкубаторе при 37 ° С с 0% CO 2 окружающей среды.
- Урожай клеток для экспериментов 2 дней после посева при обработке клеток с 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 2 мин и инактивации ферментативной активности трипсина путем добавления 8 мл питательной среды.
- Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 200 х г и ресуспендируют в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (DPBS, 1x, без Са 2 + и Mg 2 +) до конечной концентрации 5 × 10 5 клеток / мл.
2 Дизайн устройства и изготовление
ПРИМЕЧАНИЕ: Маска, мастер плесени измышления иПроцесс вшита микроканальной должны быть проведены внутри чистой комнаты в то время как полидиметилсилоксан (PDMS) микроканальной процесс литья может быть выполнена на регулярной лабораторного лабораторного стола.
- Дизайн микрожидкостных устройств, как показано на рисунке 1 с AutoCAD. Устройство должно состоять из входе с несколькими портами впрыска, фильтры грубой очистки и двумя параллельными прямыми прямоугольными инерциальных фокусировки каналов (L = 7 мм, W = 40 мкм, и H = 70 мкм). Индивидуальный прямо канал состоит из 5 электропорации камер, которые размещены 800 мкм друг от друга (W C = 400 мкм) с двумя проходами для алюминиевых электродов. Два поперечно смежных электропорации камеры поделиться отверстие для отрицательного электрода. Две прямые каналы сливаются в розетке ниже по течению в области электропорации.
- Преобразуйте файл CAD с микро-моделей в файл GDSII использованием LinkCAD. Написать микро-моделей на 5 "х 5" фотошаблона пустойс использованием лазерной маски писателя. Разработка маску, следуя протоколу производителя. ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс разработки маска включает фоторезиста развивается, хром травление и противостоять удаление. Кроме того, микро-модели напечатаны на высокой прозрачностью разрешения (> 20 000 точек на дюйм) можно приобрести у производителя третьей стороны и использовать в качестве фотошаблона. Заключительные микромасштабные особенности на фотошаблон должен быть прозрачным, чтобы соблюдайте полярность негативного фоторезиста.
- Изготовление литейной формы в конструкции устройства с использованием стандартных методов мягкой литографии 23 с отрицательным фоторезиста формованной пальто на 4 дюйма кремниевой пластины при 2000 оборотов в минуту, чтобы иметь конечную толщину 70 мкм.
- Обожженными пластину с негативного фоторезиста в течение 20 мин при 95 ° С.
- Связаться маску с пластины и подвергать УФ источника (17,4 МДж / см 2) в течение 80 сек с использованием маски выпрямитель.
- Разработать открытую пластины для 4 мин в разработчика СУ-8.
- Измерьтеразвитая толщина фоторезиста с использованием поверхности профилометра.
- Строго смешать 10: соотношение 1 из эластомера к отвердителя (силиконового эластомера комплект) и вылейте смесь на литейную форму для создания PDMS реплики. Дегазации литья эластомер течение 30 мин и вылечить литейной формы с дегазированной эластомера в сушильном шкафу при 70 ° С в течение 2 часов.
- Расслаиваться вылечить PDMS реплики с микроканальных моделей из формы и перфорированная для воздухозаборников, выпускных и электродных вставок с использованием пин тиски. ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальный диаметр передний край по выводам тиски должны быть 0,76 мм, достаточно для плотно держит PEEK трубки (OD из 1/32 ") и алюминиевых электродов (ОП 0,029") на месте.
- Создание закрытых микроканалов путем соединения PDMS реплик на предметное стекло обрабатывают в очиститель кислорода в плазме в течение 7 секунд при радиочастотной мощности, и парциальном давлении кислорода 75 Вт и 500 мТорр, соответственно.
3. Эксперименты Flow
- Вставитьалюминиевые электроды (0,029 "OD) и трубки на выходе PEEK (1/32" OD) в предназначенных для этого местах через отверстия в микроканале (рисунок 3б).
- Подключите электрооборудование 18, ответственный за создание высоковольтных короткий прямоугольные импульсы на алюминиевые электроды (рис 3C), что находятся в контакте с проточной решения в форме PDMS. ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование должно состоять из генератора импульсов и в-дом, построенный усилителя высокой напряжения 18.
- Подготовьте четыре 50 мл центрифужные пробирки индивидуально, содержащие DPBS, решения с клетками и биомолекул, и приложите каждую пробирку с соответствующим держателем флакона, подключенного к системе управления пневматической поток (рисунок 3А). 18
- Подключите впускную трубу PEEK из флакона владельцев в соответствующих впускных отверстий в микрожидкостных устройств.
- Установите величину прямоугольных импульсов, V, 100 V, чтобы иметь электрическую тьфуСила сть, Е = V / L е, через электропорации камеры эквивалентно 0,7 кВ / см. Примечание: Здесь L E представляет собой расстояние между двумя точками, где положительные и отрицательные электроды находятся в контакте с текучей раствора (рисунок 1).
- Установите регулятор давления до 40 фунтов на квадратный дюйм. ПРИМЕЧАНИЕ:. Один ручной регулировкой источник азота используется для равномерно давление все ампулами и высокоскоростной коллектор используется для своевременного включения отдельных портов решений с использованием индивидуальному заказу программное обеспечение LabVIEW 18
- Для управления клапаном, открыть по индивидуальному заказу программное обеспечение LabVIEW надписью клапана Runner, и выберите пункт Выполнить из выпадающего меню под названием работают.
- Включите клапанов, нажав на соответствующую иконку клапана. ПРИМЕЧАНИЕ: Значок клапан станет зеленым, когда она включена. При нажатии на активную значок осуществляется отключение и закрыть клапан. Значок закрытого клапана должны седеть.
- Откройте клапан для резервуара DPBS (т.е.., моющий раствор), чтобы премьер скорости потока, необходимого для стабильной генерации вихревого клеток-захвата в течение 1,5 мин.
- Переключение активного порт решение от моющего раствора к клеточной решения ловушки клеток в электропорации камере в течение 30 сек (то есть этап клеток-ловушек).
- Поток как стиральные и клеточные решения через устройство одновременно в течение 10 сек до стадии клеточного захвата, чтобы обеспечить бесперебойное потока во время стадии раствор переключения. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот краткий шаг совместное прохождение следует повторить на каждом шаге решения переключения.
- Включение стиральной порта и промыть устройство в течение 20 сек, чтобы удалить не-ловушке загрязняющих клетки.
- Введите раствора, содержащего первую интерес молекулу (0,2 мг / мл 3000 Да молекул нейтральной и анионной декстран или 1,5 мг / мл 70000 Da нейтральной молекуле декстрана) в устройство.
- Применить пять коротких импульсов (T = 30 мс с 2-секундными интервалами) сразу же после инъекциимолекулярный раствор и контролировать масштабы и продолжительность применяемых электрических импульсов в реальном времени с помощью осциллографа.
- Повторите шаг 3,10 столько раз, сколько количество дополнительных молекул должны быть доставлены. Для каждого молекулярной доставки, инкубировать клетки для 100 с в молекулярном растворе затем промойте устройство с моющим раствором для 100 с для удаления избытка молекул.
- Выпуск клеток в 96-луночный планшет для анализа вниз по течению за счет снижения рабочего давления при температуре ниже 5 фунтов на квадратный дюйм. Примечание: Приблизительно 100 мкл раствора с 100 клеток собрана из каждого выпуска.
- Запуск экспериментального шаги 3,9 через 3,16 три раза, чтобы собрать достаточно клеток для проточной цитометрии.
- Центрифуга 96-луночный планшет, содержащий обработанные клетки в течение 5 мин при 228 х г.
- Удалить супернатант, содержащий лишние молекулы флуоресцентные.
- Ресуспендируют клеток в DPBS для проточной цитометрии.
- Датчики в проточной цитометрии для молекулярной Uptake анализ эффективности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Разработанная параллельно Микрожидкостных Электропоратор доставлен макромолекулы с различных размеров и электрических зарядов в живых метастатических клеток рака молочной железы. Успешное молекулярная поставки был качественно определены путем мониторинга изменений в интенсивности флуоресценции по орбите электропорации клеток в месте, и подтверждается количественных измерений с помощью проточной цитометрии. Фиг.4А показывает, что 90% клеток, обработанных поглощение на 70000 Da нейтральный декстран. Для статистического анализа, порог интенсивности для каждого флуорофора был создан таким образом, что большинство (> 99%) из необработанных живых клеток считается ниже порогового значения (рис 4 (с)). Эффективность определяется как отношение числа клеток успешно занимают молекулы, представляющие интерес для общего количества обработанных клеток. Фиг.4В показывает, что эффективность существенно не меняется в зависимости от молекулярнойвес или электрические заряды (P> 0,1). Все испытанные молекулы декстрана были доставлены в цитозоль с эффективностью, превышающей 70%. Кроме того, рис 4D демонстрирует, что последовательное молекулярная поставки был успешно выполнен с двойным молекул эффективности доставки на 56% с помощью анионные и нейтральные декстраны с одинаковой молекулярной массой (MW = 3000 Да). Нынешняя система может обрабатывать клетки с 10 раз более высокую пропускную способность и мульти-молекулы эффективность доставки, чем сообщалось ранее системы 18, и это улучшение не влияют на размещение одиночных молекул (82% и 70% для анионного и нейтрального декстрана, соответственно).
Рисунок 1 (А) Схема микрожидкостных системы электропорации, состоящий из входных отверстий для клеток (обозначенный как C), молекулы (обозначенный как M1 и M2) и флеш Solutион (обозначается как F), две прямые каналы, где инерционная фокусировки происходит, 10 электропорации камеры с электродами и розетке. (B) Решение обмен демонстрационные на входе с использованием раствора 1 мкм FITC и флеш решение (DPBS) указывает, что активным раствором может быть равномерно вводили всем массивов камер вниз по течению. Контрастность изображения повышается за счет регулировки справочной таблицы (LUT). Масштабные бары 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 фотографии 15-контактному электроду, используемого для применения коротких импульсов высокого напряжения, состоящий из 10 положительных (+) и пять отрицательных электродов (-). Каждый положительный электрод отстоит 2 мм друг от отрицательного электрода, и электроннойACH электрод одной полярности отстоит 1,35 мм друг от друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Схема экспериментальной установки, состоящей из (а) единицу жидкости управления, (B) Микрожидкостных электропоратора, и (C) электрооборудование. (A) Флаконы, содержащие растворы с молекул, клеток и чистой буфера индивидуально под давлением по требованию с помощью LabView контролируется системой пневматической подачи. Раствор из флакона под давлением впрыскивается в микрофлюидном электропоратора через PEEK трубки с обратным клапаном установлен. (В) и (С) электрические сигналы поступают на 15-контактных электродов в контакте с Fмычание решение в микрофлюидном системы во время стадии электропорации. Электрические импульсы с запрограммированной длительности генерируются с помощью генератора импульсов и величину электрического импульса усиливается до 100 V усилителем высокого напряжения. Все применяемые электрические параметры контролируются в режиме реального времени с помощью осциллографа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4 представитель проточной цитометрии данных. (А) флуоресцентных сигналов MDA-MB-231 клетки, которые успешно принимали до молекулу 70000 Да анионные декстрана, по сравнению с контрольной аналога. (Б) эффективность для каждого переданного молекуле декстрана не обладают значительным молекулярным зависитИзменение (р> 0,1). (С) представитель проточной цитометрии профилей для клеток, которые не были обработаны электропорации (контроль). Флуоресцентный пороговое значение, указывающее успешную доставку молекулярную установлен на основании данных таким образом, что сигналы от контрольных образцов находятся ниже порога. (D), представитель проточной цитометрии данных для последовательного электропорации клеток. Зеленые, красные и желтые ящики в проточной цитометрии сюжетных и люминесцентные стрик изображений на правой стороне представляют флуоресцентные сигналы от клеток uptaking 3000 Da нейтральный декстраном только, анионные декстран-только и оба молекул декстрана, соответственно. Шкала бар составляет 100 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С новым распараллелить электропорации платформы, повышение в 10 раз в пропускной способности и эффективности системы оказания мульти-молекулы была достигнута в дополнение ко всем достоинствам, которые обеспечивает ранее разработанная система однокамерный. +18 Ранее доступные заслуги включают (I) предварительной очистки клетки-мишени с равномерным распределением по размерам для повышения жизнеспособности, (II) и точного индивидуального молекулярного контроля дозы, и (III) низкой эксплуатационной электрического тока. Флуоресцентно меченных декстранов были выбраны в качестве молекул, представляющих интерес, потому что они легко доступны в широком диапазоне молекулярных масс, конъюгированных флуорофоров типов и электрических зарядов. Эти макро-молекулы являются хорошими кандидатами для такого исследования, так как они были заведомо мембранным непроницаема для живых клеток и не проявляют цитотоксичность. +24 Оптимальная концентрация флуоресцентного декстрана, времени инкубации, и электрические параметры были определены в текущей версии предварительного то электропорации экспериментов. Процесс оптимизации был довольно прост и эффективен благодаря способности платформы для мониторинга молекулярную процесс поглощения в режиме реального времени. Визуализация этого процесса является очень полезным, если тип молекулы или клетки с небольшим к без знания параметров электропорации проходит проверку. Инкубационный период для всех испытанных молекул было установлено, что 100 с помощью которого клетки, захваченные во всех камерах 10 обладают обнаруживаемыми сигналами интенсивности флуоресценции в реальном времени, что свидетельствует о завершении успешной молекулярной доставки. Обратите внимание, что это не минимальная длительность инкубационного требуется для молекулярной доставки.
Там было давняя дискуссия о молекулярной процесс доставки с помощью электропорации, будь то исключительно при посредничестве диффузии 4,19,25 или с помощью электрофореза. 26 Идентификация доминирующего механизма молекулярной поставки включает в себя ряд трудоемких отдельных тестов, сравнивая тон результатов в зависимости от размеров молекул, электрических зарядов и параметров электропорации. Насколько известно авторам, эти трудоемкие процессы оптимизации не сообщалось с обычными системами электропорации. 4,26-28 просто возможность оптимизации параметров разработанной системы позволило для идентификации доминирующего молекулярного механизма доставки, путем изучения изменений в эффективности электропорации в зависимости от молекулярных и электрических параметров. Результаты показали, что эффективность анионные 3000 Da декстрана существенно не отличалась, чем у ее аналога нейтрального (83 и 75% соответственно), что свидетельствует о том, что молекулярная поглощение наблюдалось было возможно, опосредовано диффузии. В отличие от других систем электропорации, обработанные клетки непрерывно перемешивают в течение всего процесса электропорации в этой системе. Постепенное увеличение флуоресцентных сигналов орбитальных клеток наблюдалось, предполагая, что распространение будет Dominaнт механизм доставки. Высокоэффективный молекулярного поглощения (90%) нейтральных 70000 Да молекул декстрана далее означает, что даже при высоких молекулярных масс процесс доставки происходит в результате диффузии. Наконец, успешное последовательное поставка 3000 Da анионных и нейтральных молекул декстрана затвердевает утверждение, что молекулярная доставка происходит несмотря на молекул заряда. Этот результат также предполагает, что мембрана Пересчет не завершен в течение 3 мин электропорации (100 сек на молекулярном поставки).
Представленная молекулярная доставка платформа может последовательно поставлять широкий диапазон молекулярных размеров, независимо от их электрических зарядов. Своевременное тонкой настройки и модификации отдельных параметров может быть достигнуто с небольшим усилием чему способствует в режиме реального времени возможностью мониторинга процесса. Размер основе процесса очистки клеток системы исключает необходимость трудоемкой пробоподготовки и трудоемкий центрифугирования предварительной и последующей электропорациишаги. Кроме того, низкий рабочий ток системы существенно снижает клеточную смертность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа выполнена в рамках программы Rowland Младший научный сотрудник. Авторы хотели бы выразить благодарность ученых и сотрудников на Rowland института в Гарварде: Крис Стоукс за помощь в развитии заказного, настройки управления давлением с помощью компьютера, Диана Schaak, кандидат для ее ввода для биологической обработки проб, Уинфилд Хилл за разработку электрической установки, Alavaro Санчес, кандидат для предоставления доступа к проточной цитометрии, Скотт Bevis, Кенни Спенсера и Дон Роджерс для обработки механических компонентов сантехника, необходимых для настройки давления. Микрожидкостных мастера были изготовлены в Центре наноразмерных систем (ЦНС) в Гарвардском университете.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
