Abstract
zebrafish वैज्ञानिक अध्ययन के कई विषयों के लिए प्रासंगिक है कि एक मुख्य धारा हड्डीवाला मॉडल बन गया है. Gastrulation से एक बुनियादी stereomicroscope साथ जीवोत्पत्ति को लेकर घटनाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन सक्षम है कि लक्षण के एक नक्षत्र - Zebrafish विशेष रूप से अच्छी तरह से अपने बाह्य निषेचन, भ्रूण आकार, तेजी से व्यक्तिवृत्त, और ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए विकास की प्रक्रिया के आगे आनुवांशिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. इसके अलावा, zebrafish भ्रूण अगुणित राज्य में कई दिनों के लिए जीवित रह सकते हैं. यह पहली पीढ़ी के माता पिता (पी) पीढ़ी में mutagenesis के निम्नलिखित (एफ 1) महिला वाहकों में मौजूद हटने उत्परिवर्ती alleles की पहचान के लिए सक्षम बनाता के रूप में इन विट्रो में अगुणित भ्रूण के उत्पादन, उत्परिवर्तनीय विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. यह दृष्टिकोण इस प्रकार कम करने के साथ साथ शोधकर्ता समय की बचत, कई पीढ़ियों उत्परिवर्ती परिवारों के प्रजनन शामिल है जो (आदि F2, F3,) जुटाने की आवश्यकता समाप्तzebrafish कॉलोनी अंतरिक्ष, श्रम, और पशुपालन की लागत के लिए की जरूरत है. Zebrafish पिछले कई दशकों के लिए स्क्रीन आगे का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ट्रांसजेनिक और जीनोम संपादन उपकरण की एक सतत विस्तार किया गया है. इन उपकरणों अब आगे हड्डीवाला व्यक्तिवृत्त ड्राइव कि जीन विनियामक नेटवर्क काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अगली पीढ़ी के स्क्रीन के लिए सूक्ष्म assays बनाने के तरीके के एक बहुतायत प्रदान करते हैं. यहाँ, हम अगुणित zebrafish भ्रूण तैयार करने के लिए क्या करते हैं. इस प्रोटोकॉल जल्दी भ्रूण चरणों के दौरान फार्म कि प्रक्रियाओं और ऊतकों की एक व्यापक संख्या के लिए विकास के तंत्र को संबोधित करने के लिए, ऐसे बढ़ाने और शमन स्क्रीन में ही उपन्यास भविष्य अगुणित स्क्रीन, के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
हड्डीवाला विकास आर्केस्ट्रा कि मौलिक प्रक्रियाओं मोटे तौर पर 1 संरक्षित कर रहे हैं. विकास में आवश्यक भूमिकाओं के साथ जीन की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका ब्याज की प्रक्रिया में प्ररूपी दोषों को जन्म दे कि पैतृक म्यूटेशनों अलग करने के लिए है. zebrafish, Danio rerio, पिछले कई दशकों से अधिक 2 हड्डीवाला विकास जेनेटिक्स के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल जीव बन गया है कि Cyprinidae मछली परिवार से संबंधित एक छोटे मीठे पानी teleost प्रजाति है. Zebrafish अंडे निषेचन 3 की शुरुआत से युग्मनज के लिए उपयोग की अनुमति, बाहर से निषेचित कर रहे हैं. इसके अलावा, जल्दी भ्रूण एक सरल stereomicroscope 3 के साथ विकास के दृश्य को सक्षम करने, ऑप्टिकली पारदर्शी है. Zebrafish व्यक्तिवृत्त दरार, gastrulation, और बड़े पैमाने पर विकास 3 के पहले दिन पर पूरा ऐसी दिल और गुर्दे के रूप में कई संरचनाएं, की जीवोत्पत्ति की प्रक्रियाओं के साथ, तेजी से है. टीवह यौन परिपक्वता के लार्वा चरणों से समय 2-3 महीने लग जाते हैं, और वयस्कों लंबाई में लगभग 3-4 सेमी, इतने सारे मछली न्यूनतम अंतरिक्ष 2 में बनाए रखा जा सकता छोटे रीढ़ हैं. इसके अलावा, zebrafish वयस्कों सप्ताह 2 प्रति कई सौ भ्रूण का उत्पादन करने में सक्षम प्रत्येक मछली के साथ, उच्च उपजाऊपन है. इन विशेषताओं आगे के लिए zebrafish के शिक्षणीयता गाया और आनुवंशिक स्क्रीन को उल्टा कर दिया है. Zebrafish उनके शरीर रचना विज्ञान, कोशिका जीव विज्ञान, और स्तनधारियों 2,4 तरह और अधिक उन्नत हड्डीवाला प्रजातियों के साथ शरीर क्रिया विज्ञान में संरक्षण के एक उच्च स्तर के अधिकारी. दरअसल, हाल ही अनुक्रम विश्लेषण zebrafish जीनोम मानव जीन 5 के लगभग 70% करने के लिए homologs होता है कि प्रदर्शन किया है. इस संरक्षण भ्रूण और वयस्क स्थितियों 2,4 दोनों सहित कई मानव रोगों, के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए सक्षम है. साथ में ले ली, इन कारकों है कि जीन की पहचान करने के उद्देश्य से स्क्रीन के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली zebrafish बना दिया हैसामान्य हड्डीवाला व्यक्तिवृत्त के लिए आवश्यक.
बड़े पैमाने पर स्क्रीन के एक नंबर zebrafish में बाहर किया गया है और विकास संबंधी जीन 6-8 में कई हजार उत्परिवर्तन की पहचान की है. zebrafish वयस्क पुरुष mutagenesis के लिए उत्तरदायी है, और गुणसूत्र परिवर्तन रासायनिक उत्परिवर्तजन ethylnitrosourea (ENU) 6,7 या रेट्रोवायरल insertional mutagenesis 9 का उपयोग अपेक्षाकृत उच्च आवृत्ति के साथ उत्पन्न किया जा सकता है. तिथि करने के लिए, 9,000 से अधिक पैतृक म्यूटेशन बनाया, और embryogenesis के लगभग सभी पहलुओं को प्रभावित करने वाले जीन शामिल किया गया है. zebrafish समुदाय दुनिया भर से लगभग 5,000 उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक alleles एकत्र किया है जो Zebrafish अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र (या Zirc) 10, पर इन म्यूटेंट की एक केंद्रीकृत बैंक की स्थापना की है. इन म्यूटेशनों से कई का विश्लेषण किया और जैविक विषयों में न्यूमरो अलग तंग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि बहुमूल्य जानकारी शोधकर्ताओं दे, क्लोन किया गया हैzebrafish प्रयोगों के साथ होने वाले अंतर्दृष्टि के माध्यम से हमें सेलुलर और शारीरिक मार्ग.
आगे स्क्रीन महत्वपूर्ण जीनों के एक प्रभावशाली संख्या की पहचान की है, बहुत प्रक्रियाओं के असंख्य कि मध्यस्थता आनुवंशिक विनियामक नेटवर्क के बारे में सराहना की अभी बाकी है. इस प्रकार अब तक किए गए कई स्क्रीन संतृप्ति तक पहुँच नहीं है, और इस तरह आगे और साथ ही रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन embryogenesis के तंत्र की पहचान और विश्लेषण करने के लिए एक आधार बना रहा है. किसी एक zebrafish उत्परिवर्ती लाइन से बटोरा जा सकता है कि जबरदस्त अंतर्दृष्टि रहे हैं, क्षेत्र में एक प्रमुख कारक सीमित ऐतिहासिक स्थितीय क्लोनिंग में शामिल समय लेने प्रयास किया गया है. इस कारण से, कई रासायनिक प्रेरित म्यूटेशन की पहचान एक रहस्य बनी हुई है. हालांकि, तेजी से क्लोनिंग 11-14 की सुविधा है कि पूरे जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण के हाल के आगमन के साथ, आनुवंशिक परिवर्तन के अविश्वसनीय रूप से कुशल पहचान अब फ़े हैasible.
zebrafish में आद्य आगे स्क्रीन (चित्रा 1, स्तंभ छोड़ दिया) तीन पीढ़ियों 6,7 भीतर हटने का म्यूटेशन की पहचान कर सकते हैं कि एक द्विगुणित स्क्रीन है. इस तकनीक को पैतृक (पी) पुरुष के जर्म कोशिकाओं में पैदा म्यूटेशनों शामिल है, और फिर एक जंगली प्रकार महिला के साथ इस पुरुष संभोग. इस संभोग से पहले पीढ़ी (एफ 1) संतान के प्रत्येक उत्परिवर्तित पैतृक जीनोम के गुणसूत्र योगदान की वजह से एक या एक से अधिक अद्वितीय म्यूटेशनों बंदरगाह होगा. F1 संतान उठाया और F2 परिवारों बनाने के लिए जंगली प्रकार के साथ outcrossed रहे हैं. F2 परिवार में भाई बहन जंगली प्रकार या विषमयुग्मजी वाहक या तो हो जाएगा, और ब्याज के phenotype (ओं) के लिए विश्लेषण कर रहे हैं कि F3 चंगुल उत्पन्न करने के लिए बेतरतीब ढंग से incrossed रहे हैं. विषमयुग्मजी वाहकों के F3 चंगुल 25% जंगली प्रकार, 50% विषमयुग्मजी, और 25% homozygous उत्परिवर्ती मछली शामिल होंगे. यह बहु पीढ़ीगत स्क्रीनिंग स्कीमा बहरहाल, यह एक के लिए एक बड़ी खामी प्रभावी हैpproach स्क्रीन के लिए तैयार करने के लिए समय की आवश्यकता शामिल हैं: हर पीढ़ी यौन परिपक्वता तक पहुँचने के लिए 3 महीने के आसपास की आवश्यकता है, क्योंकि अकेले मछली पालन के लिए कम से कम 1 साल, शामिल है. द्विगुणित स्क्रीन के इस प्रकार के अन्य सीमाओं काम, अंतरिक्ष, और आवास की लागत इन पीढ़ियों हैं.
अगुणित स्क्रीन भी इसी mutagenesis रणनीतियों 15 (चित्रा 1, दाएँ स्तंभ) का उपयोग करते हुए पीछे हटने का म्यूटेशन की पहचान करने और बाद में अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक विकल्प है. अगुणित zebrafish भ्रूण का उत्पादन पहली बार 30 साल पहले 16 में वर्णित किया गया था, और एक अगुणित गुणसूत्र ploidy साथ कई दिनों के लिए विकसित करने के लिए सामान्य रूप से द्विगुणित zebrafish की क्षमता इस समय के बाद से कई आनुवंशिक अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है. अगुणित स्क्रीन के प्रमुख लाभ इस विधि हटने उत्परिवर्ती alleles के लिए स्क्रीन के क्रम में F2 परिवारों को ऊपर उठाने को शामिल नहीं करता है. इसके बजाय, F1 पीढ़ी महिलाओं के लिए मूल्यांकन किया जाता हैएक अगुणित हालत में उनके F2 वंश (चित्रा 1, दाएँ स्तंभ) का परीक्षण करके ब्याज की प्रक्रिया में पीछे हटने का म्यूटेशन की heterozygosity. कुल मिलाकर, अगुणित भ्रूण की खरीद के लिए कदम (चित्रा 2) के अपेक्षाकृत सीधा कर रहे हैं. पेट से (या "निचोड़") अंडे बाहर निकालना के रूप में तो शुक्राणु से निपटने के लिए आवश्यक समाधान की तैयारी के बाद, अंडे मैनुअल हेरफेर करके F1 पीढ़ी महिलाओं से प्राप्त कर रहे हैं. अंडे प्राप्त कर रहे हैं, वे पराबैंगनी (यूवी) निष्क्रिय शुक्राणु के लिए जोखिम के लिए इन विट्रो में निषेचित कर रहे हैं. यूवी निष्क्रिय शुक्राणु के कारण छोटी तरंग दैर्ध्य यूवी पैतृक डीएनए crosslinks तथ्य यह है कि अंडे के लिए व्यवहार्य डीएनए योगदान के काबिल नहीं हैं. हालांकि, शुक्राणु अभी भी अंडे की गतिविधि और युग्मज विकास के साथ जुड़े घटनाओं को ट्रिगर करने में सक्षम हैं. चयापचय सक्रियण पर, अंडा अर्धसूत्रीविभाजन II पूरा, और प्रत्येक chromoso का केवल एक ही माता के रूप में जमा की नकल के साथ विकसित करने के लिए आगे बढ़ना होगामुझे. यह एक मातृ गुणसूत्र पर मौजूद है क्योंकि अगर इस 1N ploidy की, भ्रूण, एक पीछे हटने का उत्परिवर्ती एलील की विकासात्मक परिणामों के अधीन है. माँ एक पूरी तरह व्याप्ति हटने एलील की एक विषमयुग्मजी वाहक है, तो इस प्रकार प्रत्येक F2 अगुणित क्लच 50% wildtype और 50% उत्परिवर्ती भ्रूण शामिल होंगे. भ्रूण जीनोटाइप के इस वितरण में रुचि के उत्परिवर्ती phenotype (ओं) की उपस्थिति के लिए क्लच के मूल्यांकन के संदर्भ में रिश्तेदार आसानी सक्षम बनाता है. इस तरह के एक phenotype पाया जाता है, F1 पीढ़ी महिला संस्थापक बाद में अधिक विषमयुग्मजी वाहक बनाने और बढ़ाने के लिए जंगली प्रकार पुरुष zebrafish को outcrossed है. यह स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए कई पीढ़ियों को बढ़ाने के लिए आवश्यक नहीं है, क्योंकि शोधकर्ता काफी समय, श्रम, और मछलीघर स्थान बचा है, लेकिन अभी भी जांच की F1 महिलाओं की संख्या के आधार पर जीनोम का एक महत्वपूर्ण संख्या का सर्वेक्षण करने की शक्ति है सकते हैं. इस प्रकार, अगुणित स्क्रीन absenc में शुरू छोटे प्रयोगशालाओं या परियोजनाओं के लिए विशेष रूप से संभव हैंपर्याप्त धन के ए.
हालांकि, haploids का उपयोग करने के लिए कई सीमाएं और कमियां हैं. सबसे पहले, अगुणित zebrafish भ्रूण में ही कई दिनों तक रहते हैं, और आमतौर पर 3 और 5 के बीच दिनों के बाद निषेचन (DPF) 15 मर जाते हैं. अगुणित zebrafish भ्रूण सबसे पहले उन्हें फिर भी विखंड क्षेत्रों 15,17 की संख्या सामान्य है कि एक छोटी और गठीला शरीर जा रहा है के अलावा, कई विशेषताओं के आधार पर diploids से प्रतिष्ठित किया जा सकता. विकास की प्रगति, आमतौर पर 2-3 DPF और शोफ 15,17 से खून पूलिंग के साथ जुड़े, मस्तिष्क दर्शाती बढ़ कोशिका मृत्यु और परिसंचरण गरीब है. इसके अलावा, haploids तैरने मूत्राशय 15,17 बढ़ असफल. भले ही इन रूपात्मक मतभेद का सबसे प्रमुख अंगों और ऊतकों दिल, आंख, और पृष्ठदंड 15,17 सहित गठन कर रहे हैं. एक विशेषता यह अगुणित चंगुल बारे में उल्लेख किया है कि वे दोषपूर्ण भ्रूण & # की किस्मों के मामले में phenotypes की एक श्रृंखला शामिल है8212; एक सुविधा zebrafish उपभेदों भर में मनाया. ऊतक (एस) और ब्याज का समय बिंदु जंगली प्रकार अगुणित तनाव में यथोचित सामान्य विकास दिखाने यदि इस प्रकार, एक को सत्यापित करना चाहिए और इसलिए एक स्क्रीन या अन्य अनुसंधान परियोजना में आनुवंशिक दोष के लिए मूल्यांकन किया जाना संभावित है.
इन चुनौतियों के बावजूद, अगुणित स्क्रीन zebrafish में जल्दी विकास की प्रक्रिया के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है, और अगुणित प्रोटोकॉल अच्छी तरह से कई साल 15-19 के लिए समुदाय में संसाधनों की स्थापना की गई है. अभी हाल ही में अगुणित मछली भ्रूण पैदा करने की प्रक्रिया अगुणित भ्रूण स्टेम Medaka मछली 20,21 से (ते) सेल संस्कृतियों बनाने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है. इन विट्रो में Medaka अगुणित भ्रूण के उत्पादन के बाद, भ्रूण अगुणित कोशिकाओं का शुद्ध क्लोन के साथ उत्पन्न करने के लिए एक और 5-8 सप्ताह के बाद के बारे में 15 सप्ताह के लिए passaged गया कि प्राथमिक सेल संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गयाES सेल गुण 15-19. मछली अगुणित ES सेल लाइनों की पीढ़ी हड्डीवाला सेल प्रजातियों में पीछे हटने का phenotypes का विश्लेषण करने के लिए व्यापक भविष्य वादा रखती है, और आने वाले वर्षों में आनुवांशिक विश्लेषण के लिए एक नया दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रकार, अगुणित मछली भ्रूण की पीढ़ी के जैव चिकित्सा अनुसंधान समुदाय में आवेदन बढ़ रहा है. इस वीडियो लेख स्थापित प्रोटोकॉल 15-19,22 पर आधारित यूवी निष्क्रिय शुक्राणु का उपयोग इन विट्रो में अगुणित zebrafish भ्रूण उत्पादन के साथ शामिल कदम के एक दृश्य प्रदर्शन प्रदान करता है.
Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित zebrafish भ्रूण के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. नोट: निम्न प्रोटोकॉल पुरुषों की इच्छामृत्यु शामिल है कि शुक्राणु अलगाव के एक प्रदर्शन प्रदान करता है, शुक्राणु की जनन छिद्र से एकत्रित किया जा सकता है कोमल उदर दबाव और शुक्राणु संग्रह 17,18 के लिए एक microcapillary का उपयोग पुरुष zebrafish रह anesthetized. लाइव पुरुषों की फैलाएंगे एक euthanized पुरुष 17,18 से प्राप्त किया जा सकता है कि शुक्राणु के बराबर मात्रा में एकत्र करने के क्रम में इस्तेमाल किया जा करने के लिए कई पुरुषों की आवश्यकता है. हालांकि, फैलाएंगे आया है कि पुरुषों काफी स्वस्थ रहने और प्राकृतिक matings या बाद में इन विट्रो प्रक्रियाओं 17 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब भी संभव हो, चुनी प्रक्रियाओं अनावश्यक मछली बलिदान को कम करना चाहिए.
1. समाधान और zebrafish संभोग मंडलों की तैयारी
<राजभाषा>वृषण की 2. विच्छेदन
- आसुत पानी की 10 मिलीलीटर के लिए सोडियम बाइकार्बोनेट की 0.35 ग्राम जोड़कर हांक स्टॉक समाधान # 6 ताजा बनाओ. सोडियम बाइकार्बोनेट पाउडर भंग करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं.
- शुक्राणु के लिए बफर हांक अंतिम काम समाधान बनाने के क्रम में बर्फ पर एक ट्यूब में निम्नलिखित गठबंधन: शेयर समाधान के 100 μl के साथ हैंक्स जलीय मैं के 9.9 मिलीलीटर # 6.
- अच्छी तरह मिक्स, तो हांक के 500 μl विभाज्य7; बर्फ पर एक microcentrifuge ट्यूब और जगह में अंतिम काम समाधान. नोट: प्रत्येक 500 μl विभाज्य 4-5 पुरुष zebrafish के वृषण से शुक्राणु तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- प्रत्येक शुक्राणु फसल के लिए 4-5 पुरुष zebrafish के बीच का चयन करें. नोट: यह, एकत्र संसाधित, और लगभग 15 अगुणित चंगुल खाद का उपयोग किया जा सकता है, जो एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में जमा करने के लिए पर्याप्त शुक्राणु फसल होगी. प्रयोग के पैमाने के आधार पर अतिरिक्त ट्यूबों को तैयार करने के क्रम में पुरुषों की अतिरिक्त साथियों का चयन करें. चयनित पुरुष zebrafish छोटे हैं या वृषण विच्छेदन अधूरा है, तो आम तौर पर 5 पुरुषों की जरूरत होगी.
- धीरे कमरे के तापमान पर लगभग 5-6 मिनट के लिए 0.2% tricaine युक्त एक डिश में मछली स्थानांतरित करने के लिए एक नेट का उपयोग करके प्रत्येक पुरुष euthanize. नोट: पुरुष ठीक से पूर्व विच्छेदन शुरुआत करने euthanized किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहें. आमतौर पर, मछली स्टॉप चलती के गहरे नाले और मछली के बाद कई (2-3) मिनट इंतजारछूने के लिए उत्तरदायी नहीं रह गया है.
- एक प्लास्टिक के चम्मच के साथ धीरे पुरुष उठाओ और ध्यान से तरल के पुरुष शुष्क दाग. अगला, कैंची की एक तेज जोड़ी के साथ पुरुष के सिर को हटाने और फिर उदर midline के साथ एक चीरा काटा. नोट: मछली से सभी अतिरिक्त तरल का हटाया शुक्राणु की सक्रियता ट्रिगर को रोकने के लिए आवश्यक है.
- निपटान के लिए एक biohazard कंटेनर में ठीक संदंश और जगह का उपयोग कर उदर गुहा से पेट और जुड़े आंत अंगों निकालें.
- Stereomicroscope के तहत जब देखा तैरना मूत्राशय को पार्श्व पृष्ठीय शरीर दीवार के साथ स्थित हैं जो वृषण,, हटाने, और एक सफेद अपारदर्शी उपस्थिति ठीक संदंश का प्रयोग करें. नोट: बरकरार वृषण रखते हुए पानी आधारित शारीरिक तरल पदार्थों को शुक्राणु के प्रदर्शन को रोकने में मदद मिलेगी और इस प्रकार समय से पहले सक्रियण रोका जा सकता है.
- बर्फ पर शुक्राणु समाधान में वृषण प्लेस और अन्य वृषण विच्छेदित कर रहे हैं के रूप में बर्फ पर ट्यूब रखना. दोहराएँ सभी मीटर तक 2.6-2.9 कदमोंएल्स विच्छेदित कर दिया गया है.
- उचित संस्थागत निपटान के लिए एक biohazard कंटेनर में शवों और किसी भी शेष जानवरों के ऊतकों रखें.
3. यूवी शुक्राणु निष्क्रियता
- धीरे एक बाँझ microtube मूसल के साथ microcentrifuge ट्यूब पीस द्वारा वृषण homogenize.
- एक छोटा सा पेट्री डिश या बर्फ पर घड़ी का शीशा स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. नोट: सतह पर तैरनेवाला समाधान के साथ ऊतक मलबे हस्तांतरण न करें. यह छाया बनाने और शुक्राणु की यूवी निष्क्रियता समझौता होगा.
- अतिरिक्त हांक अंतिम काम समाधान (2.2 कदम में तैयार और बर्फ पर संग्रहीत) के 300-400 के बीच μl के साथ शुक्राणु ट्यूब कुल्ला, और छोटे पेट्री डिश को इस सतह पर तैरनेवाला धोने जोड़ने या 3.2 चरण में कांच घड़ी.
- लगभग 15 (38.1 सेमी) में से दीपक स्रोत से एक दूरी पर 2 मिनट की कुल के लिए एक बेंच दीपक (254 एनएम) से यूवी के लिए पकवान बेनकाब. नोट: एक यूवी दीपक के साथ कार्य करते समय सावधानी बरतें और एक चेहरा ढाल या पहननेदूसरी आँख व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण.
- फिर एक ताजा microcentrifuge ट्यूब यूवी निष्क्रिय शुक्राणु हस्तांतरण और बर्फ पर नमूना की दुकान, बर्फ बाल्टी के लिए पकवान लौटें. नोट: इस बिंदु पर अगुणित क्लच निषेचन के लिए यूवी निष्क्रिय शुक्राणु की लगभग 800 μl हो जाएगा. शुक्राणु मादा फैलाएंगे पर खर्च समय की पूरी अवधि के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए. ठंड हांक में शुक्राणु निषेचन परिणाम में किसी भी कमी के बिना अप करने के लिए 6 घंटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दिलचस्प है, अन्य शोधकर्ताओं ठंड हांक में शुक्राणु कई दिनों से 18 कई घंटे से व्यवहार्य है कि सूचना है.
वयस्क zebrafish महिला और क्लच की इन विट्रो निषेचन में से 4. अंडे खरीद
- मछली प्रणाली पानी की 80 मिलीलीटर के साथ 0.2% tricaine स्टॉक का 20 मिलीलीटर के संयोजन के द्वारा संज्ञाहरण के लिए tricaine स्नान तैयार.
- टीआर की डिश में धीरे उसके घर एक शुद्ध प्रयोग, अंडा संग्रह के लिए महिला का चयन करेंicaine.
- महिला anesthetized है जब तक 2-3 मिनट के लिए रुको और अब स्पर्श का जवाब. नोट: महिला twitches या अन्य आंदोलनों elicits हैं, संज्ञाहरण का शिकार करने के लिए उसे अतिरिक्त समय दे.
- धीरे अधिक तरल पदार्थ दूर बाती को एक कागज तौलिया पर महिला रखने से पहले समाधान decanting, महिला लिफ्ट करने के लिए एक प्लास्टिक के चम्मच का प्रयोग करें. नोट: तरल पदार्थ शुक्राणु के अलावा पहले अंडा सक्रियण ट्रिगर किया जाएगा, के रूप में महिला पर अतिरिक्त समाधान छोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
- एक साफ पेट्री डिश में उसकी स्लाइड पर महिला प्लेस और stereomicroscope के तहत उसके पेट कल्पना.
- स्ट्रोक तब तक बस उसे पृष्ठीय शरीर दीवार के पीछे दूसरी ओर से एक या दो उंगलियों स्थिति से महिला की पीठ का समर्थन करते हुए उसके पेट से अंडे निचोड़ एक हाथ से एक या दो उंगलियों का प्रयोग लगभग 10-20 सेकंड के लिए धीरे महिला के पेट. नोट: महिला के पेट पथपाकर पर, अंडे बहुत आसानी से बाहर आ जाना चाहिए. अंडे बुद्धि उभरने नहीं करते हैंज यह जोर से धक्का 'और महिला से बल अंडे के लिए उचित नहीं है कम. इस अंडे निषेचन के लिए तैयार वर्तमान और / या नहीं नहीं कर रहे हैं कि इंगित करता है, और जारी रखा धकेलने महिला (जैसे, तैरना मूत्राशय deflating या अन्य घातक आंतरिक चोट के कारण) को नुकसान पहुँचाने के साथ काफी जोखिम जुड़ा हुआ है. एक महिला निचोड़ा, लेकिन कोई नहीं या कुछ अंडे प्रदान करता है, तो जानवरों की सुविधा के लिए महिला वापसी. बाकी के 1-2 सप्ताह के बाद, अवशिष्ट अंडा मलबे को साफ करने के लिए एक प्राकृतिक संभोग के लिए एक पुरुष के साथ महिला जोड़ी. एक दूसरे निचोड़ की कोशिश कर रहा से पहले आराम की एक और 1-2 सप्ताह के लिए एक टैंक में स्वाभाविक रूप से संभोग कि महिलाओं को अलग. वैकल्पिक रूप से, महिलाओं वे प्राकृतिक matings 15 के लिए स्थापित किया जा सकता है, जो समय के दौरान 4 हफ्तों के लिए विश्राम किया जा सकता है.
- महिला और / या उसके पेट की सतह के नीचे से अंडे बाहर निकालना ठीक एक जांच या छोटा सा रंग का प्रयोग करें.
- धीरे महिला को लिफ्ट और मछली प्रणाली पानी युक्त एक उचित लेबल अलगाव टैंक में उसकी वापसी. </ ली>
- अंडे का क्लच यूवी निष्क्रिय शुक्राणु समाधान के 50 μl जोड़ें, और जो समय के दौरान, महिला माता पिता को सौंपा संख्या के साथ यह ट्रैक करने के लिए डिश के लिए एक इसी लेबल प्रत्यय 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- अंडे को E3 के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- डिश रास्ते के मध्य में भरने के लिए पर्याप्त E3 समाधान जोड़ें, और बाद में ऊष्मायन के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण जगह. नोट: पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1% (v / v) 5,000 इकाइयों पेनिसिलिन और एमएल प्रति 5 मिलीग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त कलम स्ट्रेप समाधान) E3 के लिए 19 अगुणित भ्रूण के समग्र स्वास्थ्य में सहायता कर सकते हैं के अलावा.
5. अवलोकन और अगुणित भ्रूण की हैंडलिंग
- 4-8 घंटे के बाद, पकवान से unfertilized भ्रूण को हटाने और ताजा E3 समाधान के साथ E3 भ्रूण मीडिया की जगह से शेष भ्रूण धो लो. नोट: unfertilized भ्रूण एक सफेद, अपारदर्शी उपस्थिति प्रदर्शित करेगा या एक पारदर्शी एक प्रदर्शित कर सकते हैंएक कुरूप एकल कक्ष के साथ ppearance.
- ब्याज के वांछित समय बिंदु तक सेते हैं, और तब इच्छित स्क्रीन परख या अन्य अनुसंधान आवेदन (ओं) में उपयोग.
Representative Results
अगुणित भ्रूण का उत्पादन haploids mutagenized माता - पिता की संतानों (चित्रा 1) कर रहे हैं कि परिपक्व zebrafish महिलाओं से प्राप्त कर रहे हैं जब F2 पीढ़ी में पीछे हटने का म्यूटेशन की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है. इस शोधकर्ताओं जिसका द्विगुणित संतानों तो ब्याज की phenotypes (चित्रा 1) के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं F2 परिवारों बढ़ाने की जरूरत है, जिसमें परंपरागत द्विगुणित स्क्रीन, की तुलना में समय और स्थान को बचाता है.
प्रोटोकॉल में प्रमुख चरणों में इन विट्रो निषेचन के माध्यम से zebrafish अगुणित भ्रूण प्राप्त करने के लिए ऊपर चरण 1-5 में वर्णित एक फ्लोचार्ट (चित्रा 2) के रूप में schematized रहे हैं. ये कदम शुक्राणु और अंडे खरीद से और इन विट्रो निषेचन (2 दिन) में पीछा किया, समाधान की तैयारी और संभोग टैंक दिवस (1) में पुरुष हार्मोन के संपर्क से महिलाओं की भड़काना शामिल है, और अंत में haploids का पालन (दिनों 3-5) (चित्रा 2). जब कॉमएक आनुवंशिक स्क्रीन के साथ bined ऐसे रेट्रोवायरल आधारित mutagenesis के रूप में अन्य प्रक्रियाओं, लागू किया जा सकता है, हालांकि zebrafish में एक आम mutagenesis प्रक्रिया, ENU तरह एक रासायनिक उत्परिवर्तजन को एक उत्परिवर्तजन (जैसे, के लिए पुरुष zebrafish जंगली प्रकार वयस्कों के पिछले प्रदर्शन भी शामिल है, जो भी ) गुणसूत्र दोष की क्लोनिंग की सुविधा, एक mutagenized F1 पीढ़ी तैयार करने के लिए जंगली प्रकार महिलाओं के साथ प्रजनन के द्वारा पीछा किया. इस तरह की तैयारी बाद mutagenized F1 15,17,22 mutagenesis के प्रदर्शन, रियर जंगली प्रकार के लिए आवश्यक पीढ़ी समय के आधार पर काम के कई महीनों (लगभग 6 महीने) की आवश्यकता होती है, और पीछे.
एक स्क्रीन के लिए haploids रोजगार में विचार के लिए एक अन्य प्रमुख बिंदु zebrafish तनाव का विकल्प है. एबी * (एबी सितारा) तनाव अन्य उपभेदों 15 की तुलना में बेहतर समग्र विशेषताओं और स्वास्थ्य के साथ अगुणित भ्रूण उत्पादन के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है. हालांकि, हमारी प्रयोगशाला में पैदा व्युत्पन्न Tübingen तनाव मेंइतिहास, हमने हाल ही में (अप्रकाशित जी Gerlach और आर Wingert,) गुर्दे प्रणाली के विकास संबंधी विसंगतियों के लिए सफल स्क्रीन के लिए सक्षम है कि embryological सुविधाओं मनाया है. वयस्क zebrafish Tübingen तनाव पुरुषों तीन ENU उपचार की एक श्रृंखला से mutagenized, और फिर जांच के लिए एक F1 पीढ़ी उत्पन्न करने के लिए जंगली प्रकार Tübingen महिलाओं को पार कर रहे थे. F1 महिलाओं अंडे प्राप्त करने के लिए निचोड़ा गया और इन F2 अंडे यूवी निष्क्रिय शुक्राणु के साथ निषेचित किया गया. जंगली प्रकार Tübingen माता पिता (चित्रा 3) के प्राकृतिक matings द्वारा प्राप्त द्विगुणित चंगुल की तुलना में, इन अगुणित Tübingen तनाव चंगुल में भ्रूण अगुणित राज्य की एक छोटी, नाटा ट्रंक विशेषता (आंकड़े 3 बी, सी) का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, अगुणित चंगुल आम तौर पर आगे 15,17 नीचे चर्चा के रूप में, उपभेदों के भीतर अलग अलग करने के लिए जाना जाता है जो हम के रूप में अच्छी तरह से मनाया जो दोष की एक सीमा है, (आंकड़े 3 बी, सी), प्रदर्शित करने वाले भ्रूण भाई बहन से मिलकर. पिछले अध्ययनों से अगुणित फेनोटाइप दोष 15,17 की सीमा को वर्गीकृत करने के लिए, विकास के माध्यम से ग्रेड ए, इसी लिए एक विहित ग्रेडिंग श्रृंखला की स्थापना की है, और इसके साथ ही haploids भी विशेषण अच्छा, मध्यवर्ती और खराब गुणवत्ता के 22 के मामले में भेजा गया है. ग्रेड ए haploids, उच्च गुणवत्ता haploids को इसी का एक छोटा और गठीला शरीर के साथ दिखने में सबसे सामान्य हो रहे हैं, लेकिन कुल मिलाकर अगुणित ग्रेड ए (लेबल को द्विगुणित भाई बहन (डी) की तुलना (diploids 15,17,22 लिए इसी तरह की एक रूपात्मक उपस्थिति दिखाने ए) भाई बहन, चित्रा 3 बी). अगुणित ग्रेड एक भ्रूण भी अगुणित zebrafish विकास 15,17,22 (3B चित्रा) की एक खास विशेषता है जो मामूली pericardial शोफ, विकास. ग्रेड ए haploids, मध्यवर्ती या तथाकथित ग्रेड बी अगुणित भ्रूण की तुलना में (लेबल बी, 3 बी, सी के आंकड़े) एक और छोटा या kinked / twis के विकास से विशिष्ट हैंटेड ट्रंक, एक सिर और पूंछ की सुविधाओं स्पष्ट रूप से पहचाने 15,17,22 कर रहे हैं. अंत में, (भी सी / डी के रूप में कुछ संदर्भों में सूचीबद्ध) ग्रेड सी या खराब गुणवत्ता haploids 15,17,22 अत्यंत खराब कर रहे हैं और एक जर्दी गेंद (लेबल सी, चित्रा -3 सी) के साथ की एसोसिएशन में कोशिकाओं का एक बेतरतीब जन प्रदर्शन. यहां तक कि एक ही तनाव के बीच, अगुणित चंगुल से एक का पालन करेंगे कि ए, बी, और सी phenotypes के वितरण में भिन्नता है. उदाहरण के लिए, एक Tübingen महिला से अगुणित क्लच जिसका क्लच कई ग्रेड सी अगुणित वंश के शामिल है और साथ ही एक दूसरे के Tübingen महिला, से प्राप्त haploids की तुलना में अधिकतर एक साथ और बी ग्रेड अगुणित वंश (3B चित्रा), समग्र बेहतर विकास प्रदर्शित और बी अगुणित phenotypes (चित्रा -3 सी). अगुणित भ्रूण ग्रेड के इसी तरह के तनाव परिवर्तनशीलता पहले से ही अच्छी तरह से 15 एबी और एबी * तनाव मछली में मनाया गया है.
इन mor के बावजूदphological मतभेद, कई इमारतों की जीवोत्पत्ति अगुणित भ्रूण में अपेक्षाकृत सामान्य रूप से आगे बढ़ती है. वे आंखों और दिल जंगली प्रकार द्विगुणित भ्रूण की है कि अपेक्षाकृत समान है, और इस तरह वर्णक कोशिकाओं (melanophores और xanthophores) के रूप में सेल प्रकार भी 15 का मूल्यांकन किया जा सकता है जैसे अंगों की एक छोटी शरीर ट्रंक, विकास दिया है. इसके अलावा, हम pronephros, या भ्रूण गुर्दे, इसी प्रकार जंगली diploids के लिए, जंगली प्रकार अगुणित में 1 दिन के बाद निषेचन द्वारा विकसित की है कि हाल ही में दस्तावेज है. इस बात का सबूत के रूप में, pronephros सेल प्रकार patterning क्षेत्रों का प्रोटोटाइप पैटर्न (चित्रा 4) को प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, इस तरह के retinoic एसिड का उत्पादन कम कर देता है कि उदारीकरण उत्परिवर्तन के रूप में pronephros विकास, परिवर्तन है कि पीछे हटने का म्यूटेशन के phenotype, द्विगुणित राज्य की तुलना में अगुणित राज्य में एक समान पैटर्न (चित्रा 4) 23,24 दिखा. इस अवलोकन अन्य reces की कि के अनुरूप हैयह हमेशा सभी परिवर्तन के साथ ऐसा नहीं है और स्क्रीन रणनीति 15 के इस प्रकार के मूल्यांकन अगर ध्यान में रखा जाना चाहिए, हालांकि, दोनों अगुणित और द्विगुणित हालत में इसी तरह phenotypes के लिए नेतृत्व परिवर्तन है कि निर्णायक.
ऊतकों और अंगों की एक संख्या haploids में आम तौर पर असामान्य हैं. उदाहरण के लिए, haploids vasculogenesis के कुछ पहलुओं का अध्ययन करने की क्षमता 15 सीमित कर सकते हैं जो आमतौर पर खून पूलिंग का प्रदर्शन संचलन में दोष, प्रदर्शन. इसके अलावा, यह haploids इस संरचना में 15 की morphogenesis के साथ शामिल सूक्ष्म प्रक्रियाओं को प्रभावित करने वाले परिवर्तन के लिए नहीं है कि वे पूरी तरह से कान पुटिका गठन को रोकने है कि परिवर्तन के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है कि इस तरह, कान विकास में अनियमितताओं है, लेकिन हो सकता है कि उल्लेख किया गया है. इस का एक और उदाहरण के रूप में, मस्तिष्क morphogenesis haploids में असामान्य है, और इस प्रकार अपेक्षित मस्तिष्क के विकास रास्ते की पहचान करने के लिए अगुणित स्क्रीन 15 सीमित कर रहे हैं. इन सीमाओं के बावजूद, हमारे एकअगुणित राज्य में गुर्दे का विकास (चित्रा 4) के nalysis 'screenable' भ्रूण संरचनाओं की सूची में इस अंग कहते हैं. यह निष्कर्ष एक अगुणित स्क्रीन कार्यप्रणाली गुर्दे पूर्वज patterning की आनुवंशिक घटक काटना इस्तेमाल किया और सरल स्क्रीन दृष्टिकोण हड्डीवाला विकास 15 अध्ययन करने के लिए मूल्यवान नई उत्परिवर्ती मॉडल को उजागर करने के लिए अगुणित भ्रूण व्यक्तिवृत्त की सीमाओं को दरकिनार कर सकते हैं कि भावना को जोर कहते हैं कि हो सकता है पर प्रकाश डाला गया.
चित्रा 1. Zebrafish मॉडल में द्विगुणित और अगुणित स्क्रीन रणनीतियों के योजनाबद्ध. अभिभावकों की पीढ़ी के mutagenesis के बाद, F1 पीढ़ी उठाया और इस्तेमाल किया या तो एक द्विगुणित राज्य में F3 पीढ़ी स्क्रीन (बाईं करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि F2 उत्परिवर्ती परिवारों उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है ) या सीधे स्क्रीनएक अगुणित रणनीति (दाएं) में एड. एक अगुणित स्क्रीन में, यौन परिपक्व F1 पीढ़ी महिलाओं आनुवांशिक विश्लेषण के लिए अगुणित F2 चंगुल एकत्र करने के लिए उपयोग किया जाता है. F2 haploids का लगभग आधा जंगली प्रकार अगुणित भाई बहन (पीला भ्रूण) की तुलना में एक उत्परिवर्ती phenotype (लाल भ्रूण) को प्रदर्शित अगर महिला विषमयुग्मजी वाहक पहचान कर रहे हैं.
कार्य शुक्राणु समाधान और दिन 2 (नारंगी बक्से पर प्रदर्शन प्रधानमंत्री वयस्क zebrafish महिलाओं, कार्य तैयार करने के लिए दिन 1 (गुलाबी बक्से) पर प्रदर्शन के रूप में चित्रा 2. अगुणित भ्रूण उत्पादन प्रवाह चार्ट. अगुणित भ्रूण का उत्पादन करने के लिए इन विट्रो निषेचन के प्रमुख कदम schematized रहे हैं ) को इकट्ठा करने और यूवी निष्क्रिय शुक्राणु, अंडे एकत्रित करने के लिए haploids उत्पन्न करने के लिए यूवी निष्क्रिय शुक्राणु के साथ अंडे की खाद डालना, और उसके बाद महिला मां को पुनर्जीवित करने, और finall कोY कार्यों बाद के दिनों पर प्रदर्शन 3-5 चंगुल अवलोकन और विश्लेषण के लिए वांछित समय बिंदु (ओं) के लिए incubated हैं जब (पीला बॉक्स).
चित्रा 3. द्विगुणित और अगुणित Tübingen तनाव zebrafish भ्रूण की तुलना करें. ए) द्विगुणित जंगली प्रकार भ्रूण प्राकृतिक spawning के द्वारा निर्मित है और फिर लगभग 30 HPF. बी तक incubated रहे थे, सी) अगुणित जंगली प्रकार भ्रूण यूवी निष्क्रिय शुक्राणु के साथ F1 पीढ़ी mutagenized महिलाओं से प्राप्त चंगुल से इन विट्रो निषेचन द्वारा निर्मित है, और जब तक incubated रहे थे लगभग 30 HPF. Haploids द्विगुणित जंगली प्रकार भ्रूण (काला तीर, द्विगुणित इंगित करने के लिए डी) के साथ तुलना में विकास में असामान्यताएं की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया. अपेक्षाकृत सामान्य haploids की ग्रेडिंग स्कीम के अनुरूप एक छोटा, अधिक स्टॉक शरीर थाएक एक अगुणित 15 सकल असामान्यताएं के साथ haploids बी के एक ग्रेड के लिए इसी एक गंभीर रूप से छोटा शरीर अक्ष (बैंगनी तीर, लेबल बी) का प्रदर्शन किया है, जबकि (लाल तीर, एक लेबल), और अंत में ग्रेड सी (नीले तीर, लेबल सी) पर आधारित प्रकाशित विवरणों 15. सभी भ्रूण एक 2.5X बढ़ाई लाइव फोटो खींच रहे थे.
अगुणित Tübingen तनाव zebrafish में pronephros भ्रूण गुर्दे अंग शामिल है कि सेल प्रकार की चित्रा 4. विकास patterning. अगुणित जंगली प्रकार भ्रूण गुर्दे की संरचना (शीर्ष पंक्ति) में सेल प्रकार की एक सामान्य स्वरूप प्रदर्शन किया. भ्रूण गुर्दे nephrons के रूप में जाना खंडों कार्यात्मक इकाइयों की एक जोड़ी के होते हैं. नेफ्रॉन में मौजूद असतत सेल प्रकार के खंडों पैटर्न पूरे माउंट के आधार पर देखे जा सकते हैं
Discussion
अगुणित स्क्रीनिंग जल्दी विकास के चरणों के लिए अपेक्षित आवश्यक जीन की खोज करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. इसके अलावा, Medaka मछली से अगुणित कोशिकाओं के संवर्धन अगुणित कोशिकाओं हड्डीवाला आनुवंशिक अध्ययन 20,21 के अन्य प्रकारों के लिए एक मूल्यवान भविष्य स्थल प्रदान कर सकता है कि प्रदर्शन, कई अनुसंधान अनुप्रयोगों और क्षमता है कि ते तरह सेल लाइनों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल यूवी निष्क्रिय शुक्राणु के साथ इन विट्रो निषेचन के माध्यम से अगुणित zebrafish भ्रूण का उत्पादन प्रदर्शन के साथ शामिल विधियों का एक प्रदर्शन प्रदान करता है. इस पद्धति को जंगली प्रकार, ट्रांसजेनिक या बढ़ाने / शमन स्क्रीनिंग के लिए उत्परिवर्ती उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है जो mutagenized F1 मछली, के साथ आगे अगुणित स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक अगुणित रणनीति का प्रयोग स्क्रीनिंग समय बेहद द्विगुणित स्क्रीनिंग की तुलना में छोटा है, फिर भी यह पूरा करने के लिए कई महीनों का समय लगेगा. हम descri के रूप मेंपहले बिस्तर, विकासात्मक घटनाओं के किसी भी संख्या के बारे में वर्तमान ज्ञान के लिए उपन्यास योगदान बनाने में सहायता कर सकते हैं जो सभी के लिए एक अगुणित स्कीमा का उपयोग कर एक स्क्रीन प्रदर्शन से मौजूद है कि बहुत से लाभ हैं. अगुणित स्क्रीन कार्यप्रणाली के कारण समय, स्थान, और जरूरत है कि मछली की संख्या में कमी करने के लिए द्विगुणित आधारित स्क्रीन से हटने का उत्परिवर्ती alleles की पहचान के लिए और अधिक कुशल है. हालांकि, एक अगुणित स्क्रीन करने के लिए कई नुकसान कर रहे हैं. भ्रूण केवल एक अगुणित जीनोम के साथ एक सीमित समय के लिए जीवित रह सकते हैं के रूप में एक अगुणित स्क्रीन ही, विकास के पहले कुछ दिनों के भीतर सक्रिय हैं कि जीन में म्यूटेंट की पहचान कर सकते हैं. बाद में विकास में व्यक्त कर रहे हैं कि जीन एक द्विगुणित स्क्रीन के रूप में एक अलग तरीका है, के द्वारा की पहचान करने की आवश्यकता होगी. इसके अलावा, कुछ अंगों एक अगुणित जीव में ठीक से विकसित नहीं है. उत्परिवर्तन अगुणित स्क्रीनिंग तकनीक से चूक जाने का कारण बन सकता है जो संरचनात्मक असामान्यताएं, या विकास की एक देरी समय, हो सकता है. मैंn इसके अलावा, मछली के कुछ उपभेदों एक अगुणित हालत 15 में के रूप में अच्छी तरह से विकसित नहीं है. Haploids एक भ्रूण अक्ष में दोष के साथ भ्रूण को नामित करने का सबसे सामान्य, बी होने के साथ, अच्छा मध्यवर्ती और गरीब भ्रूण सुविधाओं की एक ग्रेडिंग श्रृंखला से वर्गीकृत किया जा सकता है, लेकिन एक स्पष्ट सिर और पूंछ, और सी / डी विक्षत साथ भ्रूण को नामित करने के लिए सुविधाओं (जर्दी गेंदों ऊपर कोशिकाओं की जनता) 15,17. इन श्रेणियों के भीतर भ्रूण के अनुपात विशेष आनुवंशिक पृष्ठभूमि 15,17 में अधिक प्रचलित बेहतर गुणवत्ता haploids की बढ़ी संख्या के साथ, zebrafish तनाव से भिन्न होता है. कारण इन कारकों के लिए, यह mutagenesis के और बाद के पार प्रदर्शन करने के लिए zebrafish के एक उचित तनाव को खोजने के लिए आवश्यक है. हाल ही में हमारे अनुभव में, जंगली प्रकार Tübingen तनाव स्क्रीनिंग के लिए व्यवहार्य haploids उत्पादन (3 आंकड़े और के रूप में दिखाया 4) ऐतिहासिक zebrafish शोधकर्ताओं अगुणित experim के लिए अटल बिहारी या अटल बिहारी * उपभेदों का उपयोग किया है, हालांकिentation 15.
इन aforementioned चुनौतियों के अलावा, नहीं सभी primed वयस्क zebrafish महिलाओं फैलाएंगे तकनीक के प्रदर्शन पर एक क्लच का उत्पादन होगा. उदाहरण के लिए, ENU-mutagenized Tübingen तनाव महिलाओं के साथ काम करने में, सभी महिलाओं की लगभग आधा फैलाएंगे पर एक क्लच का उत्पादन किया, और इनमें से कुछ अंश (आमतौर पर 10-30%) गरीब भ्रूण गुणवत्ता थे या निषेचित किया जा सका. इस प्रकार, एक अगुणित स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक जीनोम की वांछित संख्या (प्रत्येक महिला एक जीनोम जांच का प्रतिनिधित्व करता है) स्क्रीन के लिए जरूरत के रूप में कम से कम दो बार के रूप में कई मछली जुटाने की योजना बनानी चाहिए. परख अगुणित राज्य के लिए उत्तरदायी है अगर चाहे इस विचार से, एक बड़े पैमाने पर जानवरों की सुविधा के बिना जीनोम की बड़ी संख्या को कवर करने के लिए स्क्रीनिंग की अगुणित विधि का लाभ वास्तव में काफी महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, यह भी अगुणित क्लच में पहचान उत्परिवर्तन (ओं) के आगे के अध्ययन के लिए सफलतापूर्वक एक को ऊपर उठाने पर पूरी तरह से निर्भर है कि ध्यान दिया जाना चाहिएमहिला संस्थापक एन outcross. किसी भी स्क्रीन के साथ के रूप में, द्विगुणित राज्य में फिर से पहचान की जानी चाहिए शुरू में जांच प्रक्रिया के दौरान पहचान की 'हिट'.
अगुणित स्क्रीन का उपयोग कर के नुकसान के बावजूद, यह वैज्ञानिक क्षेत्र से 15 व्यावहारिक लाभ के साथ गहराई में विश्लेषण किया गया है जो म्यूटेंट, की पहचान करने में बहुत सफल होना दिखाया गया है. अगुणित स्क्रीन हड्डीवाला विकास के अन्य खराब समझ प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है. बढ़ाने और शमन स्क्रीन के लिए haploids का प्रयोग गतिविधियों और ब्याज की एक जीन की विनियामक नेटवर्क में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए एक ही रास्ता है. अगुणित स्क्रीनिंग तकनीक भी enhancers और पहले से ही इस तरह के रासायनिक या insertional mutagenesis के रूप में तरीकों से अलग या आनुवंशिकी रिवर्स तिलिन्ग या TALENS तरह के दृष्टिकोण से किया गया है कि म्यूटेंट के दमन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्षेप में, पहले से पृथक उत्परिवर्ती ENU साथ mutagenized किया जा सकता है और enhancers या एस के लिए जांचमूल उत्परिवर्ती phenotype की uppressors. उत्परिवर्ती वयस्क चरणों तक पहुँचने में सक्षम होना चाहिए, ताकि यह हालांकि transgenesis में हाल के अग्रिमों के शोधकर्ताओं ने इस समस्या से किनारा करने की अनुमति दी है, इस स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक विषमयुग्मजी जानवर या एक कमजोर homozygous उत्परिवर्ती मछली के लिए आवश्यक है. विकास में रास्ते में हेरफेर करने के लिए सीखने रोग राज्यों के इलाज के लिए perturbing रास्ते की संभावना सहित कई रोमांचक संभावनाओं को जन्म दे सकता है.
Acknowledgments
इस काम के बाद से रॉ को धन के द्वारा समर्थित किया गया था: एनआईएच अनुदान K01 DK083512, DP2 OD008470, और R01 DK100237; ऑफ डाइम्स तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान पुरस्कार # 5 FY12-75 के मार्च; विज्ञान और जीव विज्ञान विभाग के नोट्रे डेम कॉलेज के विश्वविद्यालय से धन शुरू; और Gallagher परिवार की ओर से एलिजाबेथ और माइकल Gallagher से नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के लिए एक उदार उपहार स्टेम सेल अनुसंधान को बढ़ावा के लिए. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम उनके समर्थन के लिए जीव विज्ञान विभाग के कर्मचारी धन्यवाद, और हमारे zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके उत्कृष्ट समर्पण के लिए नोट्रे डेम पर Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र. हम चित्रा 4 में प्रदान की तस्वीरें लेने के लिए GF Gerlach धन्यवाद. अंत में, हम उनकी टिप्पणी, विचार विमर्श और insig के लिए हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवादइस काम के बारे में HTS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
References
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genetics. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , Humana Press. (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
