Abstract
ゼブラフィッシュは、科学的な研究の多くの分野に関連する主流の脊椎動物のモデルとなっている。基本的な実体顕微鏡で原腸からの器官形成に至るまでのイベントの直接観察を可能にする形質の星座 - ゼブラフィッシュは、彼らの体外受精、胚の大きさ、急激な個体発生、および光学的透明性に起因する発達プロセスの前進遺伝子分析のために特に適しています。さらに、ゼブラフィッシュ胚は半数体の状態で数日間生存することができる。それは親（P）世代の突然変異誘発の後、第一世代に存在する劣性変異対立遺伝子（F1）女性のキャリアの識別を可能にするように、in vitroで半数体胚の生産は、突然変異分析するための強力なツールです。したがって、この手法は、還元に伴って、研究者の時間を節約し、複数世代変異体ファミリーの繁殖を含む（ 等 F2、F3など）を上げる必要がなくなりゼブラフィッシュのコロニースペース、労働、飼育コストの必要性。ゼブラフィッシュは、過去数十年間の画面を前方に行うために使用されているが、トランスジェニックおよびゲノム編集ツールの着実な拡大があった。これらのツールは、ここでさらに、脊椎動物の個体発生をドライブする遺伝子調節ネットワークを分析するために使用することができ、次世代スクリーンのための微妙なアッセイを作成する方法の茄多を提供します。ここでは、半数体ゼブラフィッシュ胚を準備する方法について説明します。このプロトコルは、初期胚の段階で形成するプロセスや組織の広範な数の開発のメカニズムに対処するために、このようなエンハンサーとサプレッサーの画面のように、新たな未来の半数体スクリーンのために実装することができます。
Introduction
脊椎動物の発生を編成基本的なプロセスは、大きく分けて1を保存されている。開発に重要な役割をする遺伝子を同定するための強力な方法は、対象となるプロセスにおける表現型の欠陥につながる遺伝変異を単離することである。ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、過去数十年にわたり2脊椎動物の発生遺伝学のために広く使われているモデル生物となっているコイ科の魚のファミリーに属する小さな淡水硬骨魚種である。ゼブラフィッシュの卵は、受精3の開始から受精卵へのアクセスを許可する、外部で受精されています。さらに、初期胚は、簡単な立体顕微鏡3で開発の可視化を可能にする、光学的に透明である。ゼブラフィッシュ個体発生は、切断、原腸形成、および大部分の開発3の最初の日をかけて完成、心臓や腎臓など多くの構造、、の器官形成過程で、迅速である。 T彼が性的に成熟する幼虫の段階から時間が2〜3ヶ月かかり、大人が、長さが約3〜4センチ、非常に多くの魚が最小限のスペース2に維持することができる小型の脊椎動物である。また、ゼブラフィッシュ大人は週2当たり数百の胚を生成することができ、それぞれの魚で、高い繁殖力を持っている。これらの属性は、前進のためのゼブラフィッシュの扱い易さをレンダリングし、遺伝子スクリーニングを逆にしている。ゼブラフィッシュは、彼らの解剖学、細胞生物学、および哺乳類2,4など、より高度な脊椎動物種と生理中の高度の保存性を有する。実際、最近の配列分析は、ゼブラフィッシュゲノムは、ヒト遺伝子の約5〜70％の相同体を含有することを実証した。この保存は、胚および成体条件2,4の両方を含む多数のヒト疾患のモデルとしてゼブラフィッシュを使用するために研究者を可能にしました。まとめると、これらの要因は、ゼブラフィッシュ遺伝子を同定することを目的とスクリーンのための優れたシステムで行った通常の脊椎動物の個体発生に不可欠。
大型画面の数は、ゼブラフィッシュで行われており、発生遺伝子6-8に数千の変異を同定した。ゼブラフィッシュ成人男性は、変異導入に適しており、染色体変化は、化学変異原エチルニトロソ尿素（ENU）6,7またはレトロウイルス挿入突然変異9を使用して比較的高い周波数を生成することができる。現在までに、9,000以上の遺伝変異が作成され、胚発生の事実上すべての側面に影響を与える遺伝子が含まれています。ゼブラフィッシュのコミュニティは、世界中から約5000変異体およびトランスジェニック対立遺伝子を収集したゼブラフィッシュ国際リソースセンター（またはZIRC）10、これらの変異体を集中バンクを確立しています。これらの変異の多くは、分析的および生物学的分野にわたってニュメロを離れて悩ますするために使用されている貴重な情報を研究者に与えて、クローン化されているゼブラフィッシュの実験で、発信洞察を通して私たちの細胞および生理学的経路。
フォワードスクリーンは重要な遺伝子の印象的な数を特定しているが、多くのプロセスの無数を仲介する遺伝子制御ネットワークについて理解されるように至っていない。これまで行われ、多くの画面が飽和状態に達していないため、前進だけでなく、逆遺伝学的スクリーニングは、胚発生のメカニズムを特定し、分析するための基礎と推移している。任意の単一のゼブラフィッシュ変異体のラインから収集することができる驚異的な洞察力がありますが、フィールド内の主要な制限要因は、歴史的にポジショナルクローニングに必要な時間のかかる努力している。このため、多くの化学的に誘発突然変異の同一性は、謎のままである。しかし、迅速なクローニング11月14日を容易に全ゲノムシーケンシングアプローチの最近の出現で、遺伝的変異の信じられないほど効率的な同定は今Feであるasible。
ゼブラフィッシュにおけるプロトタイプの前進画面は3世代6,7（ 図1、左の列）内の劣性変異を同定することができ、二倍体の画面です。この技術は、親（P）雄の生殖細胞に変異を生成し、次いで、野生型の雌とを交配するこの雄含む。この交配からの第一世代（F1）の子孫のそれぞれが、変異した父方のゲノムの染色体の貢献のために1つ以上のユニークな変異を保有します。 F1子孫を上げるとF2ファミリーを作成するために野生型と外部交配されています。 F2ファミリでは、兄弟は、野生型またはヘテロ接合性の担体のいずれかとなり、対象とする表現型について分析するクラッチF3（s）を生成するためにランダムにincrossedされる。ヘテロ接合キャリアのF3クラッチは25％、野生型、50％のヘテロ接合、および25％のホモ接合変異体の魚が含まれています。この多世代スクリーニングスキーマはしかし、このAに1大きな欠点効果的であるpproachは、画面の準備に必要な時間が含まれています。各世代が性的に成熟するために3カ月の周りに必要とするためだけでは魚の飼育の少なくとも1年は、関与している。二倍体の画面のこのタイプの他の制限は、仕事、スペース、住宅のコスト、これらの世代である。
半数体スクリーンは、同様の変異誘発ストラテジー15（ 図1、右欄）を使用して劣性変異を同定し、続いて単離するために使用され得る一つの代替である。半数体ゼブラフィッシュ胚の生成は、最初の30年以上前に16に説明され、半数体の染色体倍数性との数日間を開発することは通常の二倍体ゼブラフィッシュの能力は、この時以来、多数の遺伝学的研究のために利用されている。半数体スクリーンの主な利点は、この方法が劣性突然変異対立をスクリーニングするために、F2の家族を高める関与しないということです。その代わりに、F1世代の雌を評価される半数体状態でのF2子孫（ 図1、右欄）を調べることによって、対象プロセスにおける劣性変異のヘテロ接合。全体的に、半数体胚を調達するための手順は、（ 図2）は比較的簡単である。腹から（または「スクイーズ」）卵を押し出すように精子を処理するために必要な溶液の調製後、卵を手動操作することによりF1世代雌から得られる。卵が得られると、それらは、紫外線（UV）不活性化精子への曝露によってインビトロで受精される。紫外線不活性化された精子は、短波長紫外線父方のDNAを架橋するという事実のために卵に対する実行可能なDNAに貢献することができない。しかし、精子はまだ卵の活動および接合体の開発に関連するイベントをトリガすることができる。代謝活性化されると、卵は減数分裂IIを完了し、各chromosoの唯一の母系堆積コピーを使用して開発を進める私。それが母性染色体上に存在する場合、このために1Nの倍数性、胚は、劣性変異対立遺伝子の発達の影響を受けます。母親が十分に浸透劣性対立遺伝子のヘテロ接合キャリアであればこのように、各F2一倍クラッチは、50％の野生型および50％変異胚が含まれます。胚の遺伝子型のこの分布は、関心のある変異体の表現型の存在のためにクラッチを評価するという点で比較的容易にできるようになります。このような表現型が検出された場合、F1世代の女性の創設者は、その後、より多くのヘテロ接合キャリアを作成し、高めるために、野生型雄のゼブラフィッシュに外部交配されています。それは、画面を実行するために複数の世代を調達する必要がないため、研究者はかなりの時間、労力、そして水槽の容量を節約するが、それでも検討F1雌の数に基づいて、ゲノムのかなりの数を調査する権限を持っていることができます。このように、半数体の画面がabsencに開始小さな研究室やプロジェクトのために特に実現可能である相当な資金調達のE。
しかし、半数体の使用にいくつかの制限と欠点があります。まず、半数体ゼブラフィッシュ胚は数日のために生きる、と一般的に3〜5日後に受精（DPF）15ダイ 。半数体ゼブラフィッシュ胚は何よりも彼らはそれにもかかわらず、体節のセグメント15,17の正常な数を持って短く、ずんぐりした体である中で、いくつかの特性に基づいて二倍体と区別することができる。現像が進行するにつれて、通常は2-3のdpfおよび浮腫15,17により血液プールに関連付けられた、脳示す、細胞死が増加し、循環が悪い。さらに、半数体は浮き袋15,17を膨らませることができない。にかかわらず、これらの形態学的な違いの、ほとんどの主要な臓器や組織は、心臓、目、および脊索15,17を含めて、形成されている。一つの特徴は、一倍体のクラッチについて述べたそれらが不完全胚＆＃の品種の観点から表現型の範囲を含むことである8212;ゼブラフィッシュ系統間で観測された特徴。組織（S）と目的の時点が、野生型の半数体株では合理的に正常な発育を示した場合このように、1は確認する必要があるため、画面やその他の研究プロジェクトにおける遺伝的欠陥のために評価される可能性がある。
これらの課題にもかかわらず、半数体の画面は、ゼブラフィッシュの初期の開発プロセスのために必要な遺伝子を同定するために成功裏に実施されてきた、と一倍プロトコルがよく、長年15〜19のためのコミュニティ内のリソースを確立されている。より最近では、半数体魚類胚を生成する処理は、メダカ20,21から一倍体胚性幹（ES）細胞培養物を作成するために研究者によって使用されている。 インビトロでメダカ半数体胚の製造後、胚を有する半数体細胞の純粋なクローンを生成するために、別の5-8週間、続いて約15週間継代した初代細胞培養物を得るために使用したES細胞の特性15〜19。魚半数体ES細胞株の生成は、脊椎動物の細胞系譜に劣性の表現型を解析するための幅広い将来性を秘めていますし、今後数年間で遺伝子分析のための新しいアプローチを示しています。このように、半数体の魚の胚の生成は、生物医学研究コミュニティでのアプリケーションの成長しています。このビデオの記事は、確立されたプロトコル15-19,22に基づくUV不活化精子を用いてインビトロで半数体ゼブラフィッシュ胚を生産して必要な手順を視覚的にデモを提供しています。
Protocol
注：このプロトコルに記載ゼブラフィッシュ胚を操作するための手順は、ノートルダム大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。注：以下のプロトコルは、男性の安楽死を伴う精子の分離のデモが用意されていますが、精子が優しく腹圧と精子採取17,18のためのマイクロキャピラリーを用いて麻酔住む男性のゼブラフィッシュの生殖孔から採取することができます。生きた男性の圧搾は、一安楽死雄17,18から得ることができる精子の当量を収集するために使用されるいくつかの男性を必要とする。しかし、圧迫受けた男性は、非常に健康を維持し、自然交配またはその後のin vitroでの手順17に使用することができます。可能な限り、選択した手順が不要な魚の犠牲を最小限に抑える必要があります。
1。溶液の調製およびゼブラフィッシュ嵌合チェンバース
<OL>精巣の2。解剖
- 蒸留水10mlに炭酸水素ナトリウム0.35グラムを追加して、ハンクの原液＃6フレッシュを作る。重炭酸ナトリウム粉末を溶解するためによく混合する。
- 精子のためのバッファリングされたハンクの最終的な作業溶液を作製するために、氷上のチューブに次のように結合します。原液を100μlのハンクスプレミックスIの9.9ミリリットル＃6。
- ハンク500μlのアリコートをして、よく混ぜる7。氷上のマイクロ遠心チューブ、所定の位置にSの最終作業溶液。注：各500μlのアリコートを4-5男性のゼブラフィッシュの精巣から精子を調製するために使用されます。
- 各精子の収穫のために4-5男性のゼブラフィッシュの間で選択します。注：これは、収集、処理、および約半数体15クラッチを受精させるために利用することができるもの1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内に格納するのに十分な精子を採取するであろう。実験の規模に応じて、追加のチューブを準備するために、男性の追加のコホートを選択します。選択された男性のゼブラフィッシュが小さいか、精巣郭清が不完全な場合、一般的に5人の男性が必要となります。
- 穏やかに室温で約5-6分間、0.2％トリカインを含む皿に魚を転送するためにネットを使用して、各雄を安楽死させる。注：男性が適切に先立って解剖を開始するに安楽死されていることを確認するように注意してください。一般的に、魚の停止、移動や魚の鰓後数（2-3）分を待つタッチに反応はなくなりました。
- プラスチックスプーンでそっとオスをピックアップし、慎重に液体の雄乾燥ブロット。次に、ハサミで男性の頭を削除してから、腹側正中に沿って切開をカット。 NOTE：魚からの全ての過剰な液体の除去は、精子のトリガ活性化を防止することが不可欠である。
- 処分のためのバイオハザード容器に細かい鉗子と場所を使用して腹腔から腸および関連する腸の臓器を取り出します。
- 、背側体壁に沿って配置されている精巣を取り除く浮き袋に横方向、および実体顕微鏡下で見たときに白い不透明な外観を持つように細かい鉗子を使用してください。注：完全な精巣を保つことは水ベースの体液への精子の暴露を防ぐため、時期尚早の活性化を防止するのに役立ちます。
- 氷の上に精子液に睾丸を置き、他の精巣を解剖しているようにチューブを氷上に保つ。繰り返します、全てのMまで2.6から2.9を繰り返しアレスを解剖されています。
- 適切な制度的処分のためのバイオハザード容器に死骸、残りの動物組織を置きます。
3。紫外線精子不活性化
- 優しく無菌マイクロチューブ乳棒でマイクロチューブを粉砕して精巣を均質化。
- 小さなペトリ皿や氷の上で時計皿に上清を移します。注：上澄み液と一緒に組織片を転送しないでください。これは影を作成し、精子の紫外線不活性化が損なわれます。
- 追加のハンクの最終作業溶液（ステップ2.2で調製し、氷上で保存）の300〜400の間μlの精子の管をすすぎ、小さなペトリ皿に、この上清の洗浄を追加したり、ステップ3.2ガラスを見る。
- 約15（38.1センチメートル）内のランプ光源からの距離で2分間、合計ベンチランプ（254 nm）でのUVに料理を公開します。注：UVランプで作業する場合は注意が必要ですし、顔面シールド、または着用他の目の個人用保護具。
- 新しいマイクロチューブに紫外線不活化精子を転送し、氷上でサンプルを保存して、氷のバケツにお皿を返します。注：この時点で、半数体クラッチ受精ためのUV不活性化された精子の約800μlのがあるでしょう。精子は、女性を絞るに費やした時間の全期間を通じて氷上で保存する。冷ハンクス精子は、受精の結果の低下なしに、最大6時間のために使用することができる。興味深いことに、他の研究者は、寒さハンクの精子は数日から18数時間から実行可能であることを報告している。
アダルトゼブラフィッシュ女性から、クラッチの体外受精 4。卵調達
- 魚の系統水80mlで0.2％トリカインの株式の20ミリリットルを組み合わせることにより、麻酔のためのトリカインバスを準備します。
- TRの皿にそっと彼女を配置するために、ネットを使用して、採卵用メスを選択icaine。
- 女性に麻酔をし、もはや触れるに応答するまで、2〜3分間待ちます。注：女性のけいれんや、他の動きを誘発する場合、麻酔に屈するために彼女の追加の時間を与える。
- 優しく余分な流体を移送するために、ペーパータオルの上に女性を配置する前に解決策をデカント、女性を持ち上げるためにプラスチック製のスプーンを使用してください。注：流体が精子を添加する前に卵の活性化をトリガーするように、女性に余分なソリューションを残さないように注意してください。
- きれいなペトリ皿の中で彼女のスライドに女性を配置し、実体顕微鏡下で彼女の腹を可視化する。
- 脳卒中一方ちょうど彼女の背側体壁の後ろ一方から1つまたは2本の指を配置することによって、女性の背中を支える、彼女の腹部から卵を圧迫する1手から1または2本の指を使用して約10〜20秒間穏やかに女性の腹。注：女性の腹部を撫ですると、卵は非常に簡単に出てくる必要があります。卵はウィット出ていない場合はHはそれが難しくプッシュ」と女性からの力の卵することはお勧めできません和らげる。これは卵が受精の準備が存在し、および/ またはしないではないことを示しており、継続的なプッシュは女性（ 例えば 、浮き袋を収縮または他の致命的な内部の損傷の原因となる）を害するかなりのリスクと関連している。女性が圧迫が、どれか、いくつかの卵を提供している場合は、動物施設にメスを返す。残りの1〜2週間後、残った卵の残骸をきれいにする自然交配用の雄と雌のペアリング。第二のスクイズを試みる前に、残りのもう1〜2週間のタンクに自然に交尾の雌を分離。別の方法として、女性は彼らが自然交配15用に設定することができ、その間4週間、安静にすることができます。
- 女性および/または彼女の腹の表面の下から卵をかき出すように細いプローブまたは小さなへらを使用してください。
- 優しく女性を持ち上げ、魚系の水を含有する適切に標識されたアイソレーションタンクに彼女を返す。</李>
- 卵のクラッチに紫外線不活性化された精子溶液50μlを追加し、その時間の間に、女性の親に割り当てられた番号とそれを追跡するために皿に対応したラベルを貼付し30秒間、室温でインキュベートする。
- 卵にE3の1ミリリットルを追加し、1分間室温でインキュベートする。
- お皿を途中で充填するのに十分なのE3のソリューションを追加し、その後のインキュベーション、28℃で胚を置く。 NOTE：E3のペニシリン/ストレプトマイシン（5,000単位のペニシリン1mlあたり5mgのストレプトマイシンを含有する1％（v / v）のペニシリン-ストレプトマイシン溶液）の添加は、19の一倍体胚の全体的な健康を支援することができる。
5。観察と半数胚の取扱い
- 4-8時間後、皿から未受精胚を取り除き、新鮮E3溶液で、E3胚の媒体を交換することによって、残りの胚を洗浄します。注：未受精卵の胚は、白、不透明な外観を表示しますか、透明Aを表示することができます不格好な単一のセルでppearance。
- 興味のある所望の時点までインキュベートしてから、目的の画面アッセイまたはその他の研究アプリケーション（S）で利用している。
Representative Results
半数体胚の生産は、一倍体は、突然変異誘発された親の子孫（ 図1）は、成熟したゼブラフィッシュ雌から得られた場合F2世代における劣性変異を同定するために実施することができる。これは研究者が、その二倍体子孫次いで、目的の表現型（ 図1）のために評価されたF2家族を調達する必要があった従来の二倍の画面と比較して、時間と空間を節約できます。
体外受精によってゼブラフィッシュ半数体胚を得るため、上記の手順1〜5に記載されているプロトコルの主な手順をフローチャート（ 図2）のように図式化している。これらのステップは、精子と卵子の調達によっておよび体外受精（2日目） に続いて、溶液の調製のと相手タンク（1日目）での男性ホルモンへの曝露による雌のプライミングに関与し、最終的に半数体の育成（3〜5日） （ 図2）。場合には、COM遺伝学的スクリーニングでbinedレトロウイルスベースの突然変異誘発などの他の手順は、実装することができますが、ゼブラフィッシュでは一般的突然変異誘発手順は、ENUのような化学的な変異原への変異原（ 例えば 、オスゼブラフィッシュの野生型成人の前の露出を含むも）染色体の欠陥のクローニングを容易に、突然変異誘発されたF1世代を作成するために、野生型の雌と繁殖させた。このような調製物は、その後の突然変異誘発された、F1 15,17,22の変異導入を行い、リア野生型に必要な世代時間に基づいて作業の数ヶ月（約6ヶ月）を必要とし、リア。
スクリーンのために半数体を採用した中での検討のための別の主なポイントは、ゼブラフィッシュ株の選択である。 AB *（A-Bスター）株は他の株15よりも優れた全体的な特徴や健康に半数体胚を生産するためによく知られるようになった。しかし、我々の実験室で飼育派生テュービンゲン株ではトーリー、我々は最近、（未発表G.ゲルラッハとR. Wingert、）腎臓系の発達異常を成功画面を有効にして発生学的な特徴を観察している。大人のゼブラフィッシュテュービンゲン株の雄は3 ENUの一連の処理により突然変異を誘発し、その後、スクリーニングのために、F1世代を生成するために、野生型テュービンゲン雌と交配させた。 F1雌が卵を得るために、圧迫され、これらのF2の卵は、UV不活性化精子と受精させた。野生型テュービンゲン両親（ 図3A）の自然交配して得られた二倍体のクラッチに比べて、これらの一倍テュービンゲン株クラッチ内の胚は半数体の状態（ 図3B、C）を短く、ずんぐりした体幹特性を示した。さらに、半数体は、典型的には、クラッチ15,17、さらに後述するように、株内で変化することが知られている（ 図3B、C）、我々は同様に観察され、欠陥の範囲を表示胚の兄弟からなる。 これまでの研究では、半数体の表現型欠陥15,17の範囲を分類するために、AからDの等級Aに対応し、標準的なグレーディングシリーズを確立して、さらに一倍も形容詞良い、中間および低品質22の用語で呼ばれています。グレードAの半数は、高品質の半数に相当する、短くてがっちり体型で、外見はほとんど正常であるが、全体の半数体A級（ラベルに二倍体の兄弟（d）を比較する（二倍体15,17,22と類似の形態学的な外観を示しているA）兄弟、 図3B）。一倍グレードAの胚も半数体ゼブラフィッシュの開発15,17,22（ 図3B）の典型的な特徴である緩やかな心膜浮腫を発症する。グレードAの半数体と比較して、中間体、いわゆるグレードB半数体胚（ラベルB、3B、Cフィギュア ）をさらに短縮又はキンク/ twisの開発によって区別されるテッドトランク、頭と尾の特徴を明確に区別15,17,22であるけれども。最後に、（また、C / Dのようないくつかの参考文献に記載されている）グレードCまたは低品質半数は15,17,22非常に欠陥があると卵黄球（ラベルC、 図3C）との会合に、細胞の無秩序な質量を表示します。でも、同じ株の中で、一倍クラッチは1が観察する、A、B、Cの表現型の分布が異なります。例えば、1テュービンゲンの女性からの半数体のクラッチは、そのクラッチ数多くのグレードC半数体の子孫だけでなく、から成っ二テュービンゲン女性から得られた半数体に比べて、主にAとBグレード半数体の子孫（ 図3B）で、全体のより良い発展を表示とB半数体の表現型（ 図3C）。一倍体胚グレードの同じようなひずみの変動は、以前にも15 ABとAB *歪みの魚で観察されている。
これらのMORにもかかわらず、phological違いは、多くの構造の器官形成は、一倍体胚では比較的正常に進行。それらは短い体幹を有するが、目や心臓などの臓器の発達は、野生型二倍体胚のものと比較的類似しており、そのような色素細胞（メラニン保有細胞とxanthophores）のような細胞タイプはまた、15を評価することができる。加えて、我々は前腎、または胎児腎臓は、同様に、野生型二倍に、野生型の半数体で1日後の受精によって開発されていることが最近に文書化している。この証拠として、前腎細胞型のパターニングは、セグメントの原型パターン（ 図4）が表示されます。また、このようなレチノイン酸産生が減少し、LIB変異として前腎の開発を変える劣性突然変異の表現型は、二倍体の状態（ 図4）23,24と比べて半数体の状態で同様のパターンを示している。この観察結果は、他の不況のそれと一致しているこれは常に、すべての変異を有する場合ではないとスクリーン戦略15のこのタイプを評価する場合に留意すべきであるにもかかわらず、両方の半数体と二倍体の状態に類似した表現型を引き起こす変異をSIVE。
組織および器官の数は半数体で典型的に異常である。たとえば、半数体は血管形成のいくつかの側面を研究する能力が15を制限することがあり、一般的に血液のプールを示す循環の欠陥を、表示。また、半数体は、この構造体15の形態形成に関与する微妙なプロセスに影響を与える突然変異のためではない、それらが完全に耳胞の形成を防止する変異について評価することができるように、耳の開発に凹凸を有するができることが注目されている。これの別の例として、脳の形態形成は、半数体の異常であるため、必要な脳の発達経路を同定するためのスクリーニングは、半数体15が限定されている。これらの制限にもかかわらず、私たちのA半数体の状態（ 図4）における腎臓発生のnalysisは「スクリーニング可能な「胚性構造体のリストに、この器官が追加されます。この知見は、半数体スクリーンの方法論は、腎臓前駆細胞のパターニングの遺伝的要素を分析するために使用され、独創的なスクリーンのアプローチは脊椎動物の発生15を研究するための貴重な新しい変異体のモデルを明らかに半数体胚個体発生の制限を回避できることを感情に重点を追加することができることを強調しています。
図1。ゼブラフィッシュモデルでは二倍体と一倍スクリーン戦略の概略図。親世代の突然変異誘発の後、F1世代を上げ、二倍体の状態（左にF3世代をスクリーニングするために使用され、F2変異体ファミリーを生成するのにも使用することができます）または直接画面半数体戦略（右）に編半数体の画面では、性的に成熟したF1世代の雌を遺伝子解析のための半数体のF2クラッチを収集するために使用されています。 F2の半数の約半数が、野生型の半数体の兄弟（黄色の胚）に比べて変異体の表現型（赤胚）を表示した場合、女性のヘテロ接合キャリアが識別されます。
図2。半数体胚生産フローチャート。半数体胚を生成するために、体外受精の主なステップは、精子のソリューションおよびプライム大人のゼブラフィッシュの雌、2日目に実行されるタスク（オレンジ色のボックスを準備するために、1日目（ピンクボックス）で実行されるタスクとして図式化されている）を収集し、UV不活性化精子、卵を収集するために半数体を生成するために、UV不活性化精子と卵子を受精させる、その後、女性の母親を復活させる、と最終的に表示するYのタスクは、後続の日に行っ3-5クラッチを観察し、分析のために所望の時点（複数可）にインキュベートする（黄色のボックス）。
図3。二倍体と一倍テュービンゲンひずみゼブラフィッシュの胚の比較。 A）二倍体は、野生型の胚は、天然の産卵により製造し、次いで約30ゼブラまでインキュベートした。B、C）半数体は、野生型の胚は、UV不活性化精子とF1世代突然変異誘発雌から得られ、そしてまでインキュベートしたクラッチの体外受精により産生された約30 HPF。半数は二倍体の野生型胚（黒矢印、二倍体を示すD）と比較して、開発中の異常の範囲を示した。比較的正常半数は等級制度に類似した短縮、もっとストックボディを持っていた半数体15肉眼的異常を持つ半数体は、Bの等級に対応する深刻な切り捨て体軸（紫矢印、ラベルB）を示したが、（赤矢印は、Aと表示）、そして最後にグレードC（青矢印、ラベルC）に基づいて公表の記述15。すべての胚を2.5倍の倍率でのライブ写真撮影した。
半数体テュービンゲン株ゼブラフィッシュにおいて前腎胚腎臓器官を含む細胞型の図4発達パターニングは、野生型は半数体胚腎臓構造（最上行）に細胞型の正常パターンを示した。胎児腎臓はネフロンとして知られているセグメント化された機能ユニットのペアで構成されています。ネフロン中に存在する別個の細胞型のセグメント化されたパターンは、ホールマウントをもとにして視覚化することができる
Discussion
半数体スクリーニングは早期の発達段階のために必要な必須の遺伝子を発見するために有用な技術である。また、メダカから一倍体細胞の培養は、半数体細胞は、脊椎動物遺伝子研究20,21の他のタイプの貴重な将来の場を提供し得ることを実証し、数多くの研究用途および電位を有するES様細胞株を単離するために使用されている。このプロトコルは、UV不活性化された精子と体外受精によって半数体ゼブラフィッシュ胚の生産を行うに関わる方法のデモが用意されています。この方法論は、エンハンサー/サプレッサースクリーニングのための野生型、トランスジェニックまたは突然変異株を用いて作製することができる突然変異誘発されたF1の魚と前方半数体スクリーニングを行うために使用することができる。
半数体の戦略を用いたスクリーニングの時間が大幅に二倍体のスクリーニングに比べて短くなっていますが、それにもかかわらず、完了までに数ヶ月かかります。我々はdescriとして以前ベッド、発生事象の任意の数に関する現在の知識への新たな貢献をするのを助けることができるすべてが一倍スキーマを使用して画面を実行することによって、存在する多くの利点があります。半数体スクリーンの方法論は、時間、空間、そして必要とされている魚の数の減少に二倍体ベースの画面よりも劣性突然変異対立遺伝子を同定するための、より効率的である。しかし、半数体の画面には、いくつかの落とし穴があります。胚のみ半数体ゲノムと限られた時間のために生き残ることができるように一倍画面は、開発の最初の数日以内にアクティブである遺伝子に変異体を同定することができます。後で開発において発現される遺伝子は、二倍体スクリーンのような異なる方法によって同定される必要がある。また、一部の臓器は半数体生物において正常に発達しない。変異は半数体スクリーニング技術では見逃される可能性があり、解剖学的異常、または発生の遅延時間が、あるかもしれません。私Nさらに、魚のいくつかの株が一倍状態15においても発症しない。半数体胚軸の欠陥で胚を指定するためにほとんどの正常、Bはで、良い中間貧しい胚性機能のグレーディングシリーズ別に分類することができますが、明確な頭と尾、およびC / Dが認識できないとの胚を指定する特徴（卵黄球の上に細胞の塊）15,17。これらのカテゴリの中の胚の割合は、特定の遺伝的背景15,17でより普及してより良い品質の半数体数の増加とともに、ゼブラフィッシュ株によって異なります。これらの要因により、それが突然変異誘発およびその後の交雑を行うことがゼブラフィッシュの適切な菌株を見出すことが必要である。私たちの最近の経験では、野生型テュービンゲン株は、スクリーニングのための実行可能な半数体を生成し（ 図3、図4に示すように）歴史的にゼブラフィッシュ研究者が一倍experimため、ABまたはAB *株を利用してきたのにentation 15。
これらの前述の課題に加えて、全てのプライマー処理された成体ゼブラフィッシュ雌圧搾法を行う際に、クラッチを生成する。たとえば、ENU-変異誘発さテュービンゲン株の雌での作業では、すべての女性の約半数が圧迫時にクラッチを生産しており、これらのいくつかの割合（通常は10から30までパーセントは）悪い胚の質だったか受精することができなかった。このように、半数体の画面を実行するために1はゲノムの希望数を（それぞれの女性が1ゲノムスクリーニングを表す）をスクリーニングするために、必要に応じて2倍以上多くの魚を調達することを計画しなければならない。アッセイは半数体の状態に適しているかどうにかかわらず、この対価の、大規模な動物施設なしでゲノムの多数をカバーするためのスクリーニングの半数体法の利点は確かに非常に重要である。しかしながら、半数体クラッチで同定された突然変異のさらなる研究（s）は正常αを上げる上で完全に依存していることにも留意すべきである女性の創業者からn個の交配。任意の画面と同様に、最初にスクリーニングプロセス中に識別 'ヒット'を二倍体の状態で再識別されなければならない。
半数体スクリーンを使用することの落とし穴にもかかわらず、それは科学的なフィールド15に洞察力に利益を徹底的に分析されている変異体を、特定するのに非常に成功したことが示されている。半数体スクリーンは、脊椎動物の発生の他のあまり理解のプロセスを調査するために実施することができる。エンハンサーとサプレッサースクリーンのため半数体を使用すると、活動や興味のある遺伝子の調節ネットワークへのより多くの洞察を得るための一つの方法である。半数体スクリーニング技術はまた、エンハンサーおよび既に化学的または挿入突然変異のような方法によって単離または逆遺伝学またはTILLING TALENS近づくようにされている変異体のサプレッサーを同定するために用いることができる。一言で言えば、以前に単離された変異はENUで突然変異誘発することができ、エンハンサーまたはSに関してスクリーニングオリジナルの変異体の表現型のuppressors。突然変異は、成人の段階に到達することができなければならないので、しかし遺伝子組換えにおける最近の進歩は、研究者は、この問題をスカートさせているが、この画面を実行するためにヘテロ接合性動物または弱いホモ変異魚を有することが必要である。開発に経路を操作する方法を学ぶことは疾患状態を治療するための経路を乱すの見通しなど、多くのエキサイティングな可能性につながることができます。
Acknowledgments
この作品は、以下から生するための資金によってサポートされていました：NIHの助成金K01 DK083512、DP2 OD008470、およびR01 DK100237;ダイムバジルオコナースターター奨学生賞＃5-FY12-75年の3月。科学と生物科学専攻のノートルダム大学の大学から資金を起動する。そしてギャラガー家族に代わってエリザベスとマイケル·ギャラガーからノートルダム大学に寛大な贈り物は、幹細胞研究育成する。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。私たちは、ゼブラフィッシュのコロニー·福祉での顕著な献身のために彼らのサポートのために生物科学の部門のスタッフに感謝し、ノートルダム寺院でのゼブラフィッシュ研究センター。我々は、図4に設けられた写真を撮るために、GFゲルラッハに感謝します。最後に、我々は彼らのコメント、議論やINSIGのための私達の研究室のすべてのメンバーに感謝この作品についてHTS。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
References
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