Abstract
Zebrafisken er blevet en mainstream hvirveldyr model, der er relevant for mange discipliner videnskabelig undersøgelse. Zebrafisk er specielt velegnet til fremad genetisk analyse af udviklingsprocesser på grund af deres ydre befrugtning, embryonale størrelse, hurtig ontogeni og optisk klarhed - en konstellation af træk, der muliggør direkte observation af arrangementer lige fra gastrulation til organogenese med en grundlæggende stereomikroskop. Endvidere kan zebrafisk embryoner overleve i flere dage i haploid tilstand. Produktionen af haploide fostre in vitro er et kraftfuldt værktøj til mutationsanalyse, da den gør det muligt at identificere recessive mutantalleler til stede i første generation (F1) kvindelige bærere efter mutagenese i forældrenes (P) generation. Denne fremgangsmåde eliminerer behovet for at gøre flere generationer (F2, F3, etc.), som indebærer opdræt af mutante familier, og dermed spare forskeren tid sammen med at reducerebehovene for zebrafisk koloni plads, arbejdskraft og opdrætsmetoder omkostninger. Selv zebrafisk er blevet brugt til at foretage videre skærme for de sidste mange årtier har der været en støt udvidelse af transgene og genom-redigeringsværktøjer. Disse værktøjer nu tilbyde et væld af måder at skabe nuancerede analyser for næste generation af skærme, der kan bruges til yderligere at dissekere gen regulerende netværk, der drev hvirveldyr ontogeni. Her beskriver vi, hvordan man forbereder haploide zebrafisk embryoner. Denne protokol kan implementeres for nye fremtidige haploide skærme, såsom i forstærker og suppressor skærme, for at løse de mekanismer for udvikling af en bred række processer og væv, der danner i den tidlige embryonale stadier.
Introduction
De grundlæggende processer, der orkestrere hvirveldyr udvikling er stort set bevaret 1. En kraftfuld måde at identificere gener med vigtige roller i udviklingen er at isolere arvelige mutationer, der fører til fænotypiske defekter i processen med interesse. Den zebrafisk, Danio rerio, er en lille ferskvand teleost arter, der tilhører Cyprinidae fisk familie, der er blevet en udbredt model organisme til hvirveldyr udviklingsmæssige genetik i løbet af de sidste årtier 2. Zebrafisk æg befrugtet eksternt, tillader adgang til det zygote fra starten af befrugtning 3. Endvidere tidlige embryo er optisk transparent, muliggør visualisering af udvikling med en simpel stereomikroskop 3. Zebrafisk ontogenese er hurtig, og de processer af spaltning gastrulation og organogenese mange strukturer, såsom hjerte og nyre, som afsluttet i løbet af den første dag i udvikling 3. Than tid fra larvestadier til kønsmodenhed tager 2-3 måneder, og de voksne er små hvirveldyr ca 3-4 cm i længden, kan så mange fisk opretholdes i minimal plads 2. Desuden zebrafisk voksne har høj frugtbarhed, med hver fisk i stand til at producere flere hundrede embryoner pr uge 2. Disse egenskaber har gjort sporbarhed zebrafisk for frem og bak genetiske skærme. Zebrafisk besidder en høj grad af beskyttelse i deres anatomi, cellebiologi og fysiologi med mere avancerede hvirveldyr arter som pattedyr 2,4. Faktisk har de seneste sekvens analyse viste, at zebrafisk genom indeholder homologer til næsten 70% af menneskelige gener 5. Denne bevarelse har gjort det muligt for forskerne at bruge zebrafisk som model for mange menneskelige sygdomme, herunder både embryonale og voksne forhold 2,4. Tilsammen har disse faktorer gjorde zebrafisk et fremragende system til skærme henblik på at identificere gener, der erafgørende for en normal hvirveldyr ontogenese.
En række store skærme er blevet udført i zebrafisk og har identificeret flere tusinde mutationer i udviklingsmæssige gener 6-8. Zebrafisk voksne mand er modtagelig for mutagenese, og kromosomale ændringer kan genereres med relativt høj frekvens ved kemisk mutagen ethylnitrosourinstof (ENU) 6,7 eller retroviral insertionsmutagenese 9. Til dato er blevet skabt over 9.000 arvelige mutationer, og omfatter gener, der påvirker næsten alle aspekter af embryogenese. Zebrafisk samfund har etableret en central bank af disse mutanter på zebrafisk International Resource Center (eller Zirc) 10, der har indsamlet cirka 5.000 mutant og transgene alleler fra hele verden. Mange af disse mutationer er blevet analyseret og klonet, hvilket giver forskere på tværs af biologiske discipliner værdifulde oplysninger, der er blevet brugt til at drille hinanden numeroos cellulære og fysiologiske veje gennem de indsigter oprindelse med zebrafisk eksperimenter.
Selv forward skærme har identificeret et imponerende antal vigtige gener, meget mangler endnu at blive værdsat om genetiske regulerende netværk, der medierer et utal af processer. Mange skærme foretaget hidtil ikke har nået et mætningspunkt, og dermed fremad samt reverse genetiske skærme er forblevet en hjørnesten for at identificere og analysere mekanismer embryogenese. Mens der er enorme indsigt, der kan udledes en enkelt zebrafisk mutant linje er en væsentlig begrænsende faktor i marken historisk set været den tidskrævende indsats, der er involveret i positionel kloning. Af denne grund har identiteten af mange kemisk inducerede mutationer var et mysterium. Men med den seneste fremkomsten af hele genomsekventering tilgange, der letter hurtig kloning 11-14, utrolig effektiv identifikation af genetiske mutationer er nu feasible.
Den prototypiske fremad skærm i zebrafisk er en diploid skærm, der kan identificere recessive mutationer inden for tre generationer 6,7 (fig. 1, venstre spalte). Denne teknik indebærer at generere mutationer i kimceller forældrenes (P) Mand, og derefter parre denne mand med en vildtype kvindelige. Hver af første generation (F1) afkom fra denne parring harbor én eller flere unikke mutationer på grund af de kromosomale bidrag fra den muterede paternelle genom. Afkom F1 er rejst, og udkrydsede med vilde typer til at skabe F2 familier. I F2 familie, vil søskende være enten vildtype eller heterozygote bærere og er incrossed tilfældigt at generere F3 koblinger, der analyseres for fænotype (r) af interesse. F3 kløerne på heterozygote bærere vil indeholde 25% vildtype, 50% heterozygot og 25% homozygote mutant fisk. Denne multi-generationsskifte screening skema er effektiv, men en stor ulempe til dette enMETODE omfatter den tid, der kræves for at forberede sig til skærmen: mindst 1 års fisk dyrehold alene er involveret, da hver generation kræver omkring 3 måneder til kønsmodne. Andre begrænsninger af denne type af diploide skærmen er arbejde, plads og boligudgifter disse generationer.
Det haploide skærmen er en alternativ, der kan anvendes til at identificere og derefter isolere recessive mutationer under anvendelse af lignende mutagenese-strategier 15 (fig. 1, højre kolonne). Produktionen af haploide zebrafisk embryoner blev først beskrevet mere end 30 år siden 16, og evnen af den normalt diploide zebrafisk at udvikle til flere dage med en haploid kromosomalt ploidi er blevet anvendt til en lang række genetiske undersøgelser, da dette tidspunkt. Den største fordel af det haploide skærm er, at denne metode ikke indebærer hæve F2 familier med henblik på at screene for recessive mutantalleler. I stedet er de hunner F1 generation evalueret forheterozygositet af recessive mutationer i processen af interesse ved at undersøge deres F2-afkom i haploid tilstand (fig. 1, højre spalte). Samlet set er de skridt til at skaffe haploide embryoner er forholdsvis ligetil (Figur 2). Efter fremstilling af de nødvendige løsninger for sperm håndtering, er æg fra F1 generation hunner ved manuel manipulation, således at ekstrudere (eller "klemme"), æg fra maven. Når æggene er fremstillet, er de befrugtet in vitro ved udsættelse for ultraviolet (UV) inaktiveret sædceller. UV inaktiverede sæd er i stand til at bidrage levedygtige DNA til ægget på grund af det faktum, at kortbølget UV krydsbinder faderens DNA. Men sædcellerne er stadig i stand til at udløse æg aktivitet og de begivenheder, der er forbundet med zygotisk udvikling. Ved metabolisk aktivering, vil ægget fuldføre meiose II, og fortsætte med at udvikle med kun én moderen deponerede kopi af hver chromosomig. På grund af denne 1N ploidi embryonet er underlagt de udviklingsmæssige konsekvenser af en recessiv mutant allel, hvis det er til stede på en maternel kromosom. Således hver F2 haploide kobling vil indeholde 50% vildtype og 50% mutant embryoner, hvis moderen er en heterozygot bærer af en fuldt gennemgribende recessive allel. Denne fordeling af embryonale genotyper muliggør relativ lethed i form af evaluering af koblingen for tilstedeværelsen af mutantfænotypen (r) af interesse. Hvis der konstateres en sådan en fænotype, er F1 generation kvindelige grundlægger efterfølgende udkrydsede til vildtype mandlige zebrafisk til at oprette og hæve flere heterozygote bærere. Fordi det ikke er nødvendigt at hæve flere generationer til at udføre skærmen, kan forskeren spare megen tid, arbejdskraft og akvarium plads, men stadig har magt til at overskue et betydeligt antal genomer baseret på antallet af F1-hunner undersøgt. Således haploide skærme er særligt muligt for små laboratorier eller projekter iværksat i absence af betydelige midler.
Der er imidlertid flere begrænsninger og ulemper ved anvendelsen af haploider. Først haploide zebrafisk embryoner lever kun flere dage, og typisk dør mellem 3 og 5 dage efter befrugtning (DPF) 15. Haploide zebrafisk embryoner kan skelnes fra diploider baseret på flere egenskaber, først og fremmest blandt dem er en kort og tætbygget krop, der ikke desto mindre har det normale antal somite segmenter 15,17. Som udvikling skrider frem, hjernen udviser forøget celledød og cirkulation er dårlig, som regel forbundet med blodophobning med 2-3 dpf og ødem 15,17. Endvidere haploider undlader at oppuste en svømmeblære 15,17. Uanset disse morfologiske forskelle, er de fleste vigtige organer og væv dannet, herunder hjertet, øjet, og notochord 15,17. En funktion bemærkede om haploide koblinger er, at de indeholder en vifte af fænotyper i form af sorter af defekte embryoer & #8212; en funktion observeret på tværs af zebrafisk stammer. Således bør man kontrollere, om vævet (e) og tid punkt af interesse viser rimelig normal udvikling i vildtype haploide stamme og derfor har potentiale til at blive evalueret for genetiske defekter i en skærm eller andet forskningsprojekt.
På trods af disse udfordringer har haploide skærme er blevet gennemført med succes at identificere gener, der er nødvendige for tidlige udviklingsprocesser i zebrafisk, og haploide protokoller er blevet godt etableret ressourcer i samfundet i mange år 15-19. For nylig er processen med at generere haploide fisk embryoner blevet brugt af forskere til at skabe haploide embryonale stamceller (ES) cellekulturer fra Medaka fisk 20,21. Efter fremstilling af Medaka haploide fostre in vitro blev embryoner anvendes til at aflede primære cellekulturer, der blev passeret i 15 uger efterfulgt af yderligere 5-8 uger at frembringe rene kloner af haploide celler medES celle egenskaber 15-19. Den generation af fisk haploide ES-cellelinjer besidder bred fremtidig løfte til analyse recessive fænotyper i hvirveldyr celleafstamninger, og repræsenterer en ny tilgang til genetisk analyse i de kommende år. Således har generation af haploide fisk embryoner voksende applikationer i den biomedicinske forskningsverden. Denne video artikel giver en visuel demonstration af de skridt, der er involveret med at producere haploide zebrafisk embryoner in vitro ved hjælp af UV-inaktiveret sperm baseret på etablerede protokoller 15-19,22.
Protocol
BEMÆRK: Procedurerne for at arbejde med zebrafisk embryoner beskrevet i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Notre Dame. BEMÆRK: Selvom den følgende protokol giver en demonstration af sædceller isolation, der indebærer aflivning af hanner sperm kan indsamle fra underlivet pore i bedøvet levende mandlig zebrafisk hjælp blid abdominal pres og en microcapillary for sperm kollektion 17,18. Klemme levende hanner kræver flere mænd til at blive anvendt med henblik på at indsamle de tilsvarende mængde af sæd, der kan opnås fra en aflivet mandlig 17,18. Men mænd, der har gennemgået klemme forblive ganske sundt og kan bruges til naturlige parringer eller efterfølgende in vitro procedurer 17. Når det er muligt, bør udvalgte procedurer minimerer unødvendig fisk offer.
1.. Udarbejdelse af løsninger og Zebrafisk Parring Chambers
<ol>2.. Dissektion af testikler
- Gør Hanks Stock Solution # 6 frisk ved at tilføje 0,35 g natriumbicarbonat til 10 ml destilleret vand. Bland godt for at opløse natriumbicarbonat pulver.
- Kombiner følgende i et rør på is for at gøre pufret Hanks endelige brugsopløsning for sæd: 9,9 ml Hanks Premix I med 100 gl stamopløsning # 6.
- Bland godt, så udportionerer 500 ul af Hank7; endelige brugsopløsning i et mikrocentrifugerør og anbring på is. BEMÆRK: Hver 500 pi alikvot vil blive anvendt til fremstilling af sæd fra testiklerne 4-5 han zebrafisk.
- Vælg mellem 4-5 mandlig zebrafisk for hver sperm høst. BEMÆRK: Dette vil høste nok sæd, der skal indsamles, behandles og lagres i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, som kan udnyttes til at befrugte cirka 15 haploide koblinger. Vælg yderligere grupper af mænd for at forberede yderligere rør afhængigt af omfanget af eksperimentet. Hvis den valgte mandlige zebrafisk er små eller testiklerne dissektion er ufuldstændig, vil typisk være behov for 5 hanner.
- Aflive hvert han ved hjælp af et net til forsigtigt at overføre fisken i en skål indeholdende 0,2% tricaine i ca 5-6 minutter ved stuetemperatur. BEMÆRK: Vær omhyggelig med at sikre, at den mandlige er korrekt aflives forud for starten af dissektion. Typisk vente flere (2-3) minutter efter gæller af fisk stoppet bevægende og fiskikke længere reagerer at røre ved.
- Pick den mandlige forsigtigt op med en plastik ske og forsigtigt skamplet mandlige tør for væske. Dernæst fjerner hovedet af mand med en skarp saks og derefter skære et snit langs den ventrale midterlinjen. BEMÆRK: Fjernelse af al overskydende væske fra fisken er vigtigt at undgå at udløse aktivering af sperm.
- Fjern tarmen og tilhørende tarm organer fra bughulen ved hjælp af fine tænger og sted i en biologisk fare beholder til bortskaffelse.
- Brug fin pincet til at fjerne testiklerne, som er placeret langs den dorsale kropsvæg, tværgående til svømmeblære og har en hvid uigennemsigtig udseende, når de ses under stereomikroskop. BEMÆRK: Hold testiklerne intakt, kan bidrage til at forhindre eksponering af sæd til vandbaserede kropsvæsker og dermed forhindre for tidlig aktivering.
- Placer testiklerne ind i sperm løsning på is og holde røret på is som de andre testiklerne bliver dissekeret. Gentag trin 2,6-2,9 indtil alle males er blevet dissekeret.
- Placer slagtekroppe og eventuelle resterende dyrevæv ind i en biologisk fare beholder til rette institutionelle bortskaffelse.
3.. UV Sperm Inaktivering
- Homogeniseres testiklerne ved forsigtigt at formale mikrocentrifugerør med en steril mikrorør pistil.
- Supernatanten overføres til en lille petriskål eller urglas på is. BEMÆRK: Du må ikke overføre væv vragrester sammen med supernatantopløsningen. Dette vil skabe skygger og kompromittere UV inaktivering af sperm.
- Skyl sperm rør med mellem 300-400 pi yderligere Hanks Final brugsopløsning (udarbejdet i trin 2.2 og opbevares på is), og tilføje dette supernatant vask til den lille petriskål eller se glas i trin 3.2.
- Udsætte skålen UV fra en bænk lampe (254 nm) for i alt 2 minutter ved en afstand fra lampekilde omtrent 15 i (38,1 cm). BEMÆRK: Vær forsigtig, når du arbejder med en UV-lampe og bære en ansigtsskærm ellerandet øje personlige værnemidler.
- Retur parabol til is spand, derefter overføre UV inaktiveret sæd til en frisk mikrocentrifugerør og gemme prøven på is. BEMÆRK: På dette tidspunkt vil der være cirka 800 ul UV inaktiveret sæd til haploide kobling befrugtning. Sæden skal holdes på is under hele af tid brugt på at presse hunner. Sperm i koldt Hanks kan anvendes i op til 6 timer uden reduktion i befrugtning resultat. Interessant nok har andre forskere rapporteret, at sæd i kold Hanks er levedygtig fra flere timer til flere dage 18.
4.. Egg Indkøb fra Adult zebrafisk Kvinde og in vitro befrugtning af Clutch
- Forbered tricaine bad for anæstesi ved at kombinere 20 ml 0,2% tricaine lager med 80 ml af fisk systemets vand.
- Vælg hunnen ægudtagningen, ved hjælp af et net til at placere hende blidt i skålen af tricaine.
- Vent i 2-3 min, indtil hunnen er bedøvet, og ikke længere reagerer at røre ved. BEMÆRK: Hvis de kvindelige ryk eller fremkalder andre bevægelser, give hende ekstra tid til at bukke under for anæstesi.
- Brug en plastikske til forsigtigt at løfte den kvindelige, klaring løsningen, før du placerer den kvindelige på et stykke køkkenrulle til at væge væk overskydende væske. BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at forlade ekstra løsning på de kvindelige, som væske vil udløse æg aktivering før tilsætning af sperm.
- Placer kvinde på hendes dias i en ren petriskål og visualisere hendes mave under stereomikroskop.
- Slagtilfælde kvindens mave forsigtigt i ca 10-20 sekunder ved hjælp af en eller to fingre fra den ene hånd til at presse æg fra hendes underliv, i mellemtiden støtter kvindelige ryg ved at placere en eller to fingre fra den anden side lige bag hendes ryg krop væg. BEMÆRK: Ved at stryge den kvindelige underliv, bør æggene kommer ud meget let. Hvis æg ikke dukke op with lethed er det ikke tilrådeligt at "skubbe hårdere" og tvinge æg fra hunnen. Dette indikerer, at æggene ikke er til stede og / eller ikke er klar til befrugtning, og fortsatte med at skubbe er forbundet med en betydelig risiko for at skade den kvindelige (f.eks deflatere svømmeblære eller forårsager anden dødbringende intern skade). Hvis en kvindelig er klemt, men giver ingen eller få æg, returnere den kvindelige til dyret facilitet. Efter 1-2 ugers hvile, parre hunnen med en mandlig til en naturlig parring til at rense ud resterende æg snavs. Adskille hunner, der parrer sig naturligt ind i en tank til en anden 1-2 ugers hvile, før du prøver en anden klem. Alternativt kan hunner være udhvilet i 4 uger, i hvilket tidsrum de kan sættes op efter naturlige parringer 15.
- Brug en fin sonde eller lille spatel til at øse æg ud fra under den kvindelige og / eller hendes mave overflade.
- Løft forsigtigt den kvindelige og returnere hende til en passende mærket isolation tank med fisk systemet vand. </ Li>
- Tilsæt 50 ul af UV inaktiveret sperm løsning på kobling af æg, og inkuberes ved stuetemperatur i 30 sek i hvilket tidsrum, anbringe en tilsvarende etiket til fadet for at spore den med nummeret på den kvindelige forælder.
- Tilsæt 1 ml E3 til æggene, og der inkuberes ved stuetemperatur i 1 min.
- Tilsæt tilstrækkeligt E3 løsning til at fylde fadet midtvejs, og placere embryoner ved 28 ° C til efterfølgende inkubation. BEMÆRK: Tilsætning af penicillin / streptomycin (1% (v / v) pen-strep-opløsning indeholdende 5.000 enheder penicillin og 5 mg streptomycin pr ml) 19 til E3 kan hjælpe i den samlede sundhed af haploide embryoner.
5.. Observation og håndtering af haploide embryoner
- Efter 4-8 timer, fjerne ubefrugtede embryoner fra fadet og vaske de resterende embryoner ved at erstatte E3 embryo medier med frisk E3 løsning. BEMÆRK: Ugødet embryoner vil vise en hvid, uigennemsigtig udseende eller kan vise en gennemsigtigppearance med et misdannet enkelt celle.
- Inkuber indtil ønskede punkt af interesse, og derefter udnytte i den ønskede skærm assay eller anden forskning anvendelse (r).
Representative Results
Produktionen af haploide embryoner kan gennemføres for at identificere recessive mutationer i F2-generationen, når haploider opnås fra modne zebrafisk hunner, der er afkom af mutageniserede forældre (figur 1). Det sparer tid og plads i forhold til den traditionelle diploide skærm, hvor forskere har brug for at hæve F2 familier, hvis diploide afkom derefter evalueres for fænotyper af interesse (Figur 1).
De vigtigste trin i den protokol, der er beskrevet i trin 1-5 ovenfor for at opnå zebrafisk haploide embryoner gennem in vitro-befrugtning er skematiseret som et flowchart (figur 2). Disse trin involverer fremstilling af opløsninger og priming af hunner ved udsættelse for mandlige hormoner i parring tanke (dag 1), efterfulgt af sperm og æg indkøb og in vitro fertilisering (dag 2), og endelig opdræt af haploider (Days 3-5) (figur 2). Når comkombineret med en genetisk skærm, en fælles mutagenese procedure i zebrafisk omfatter tidligere eksponering af de mandlige zebrafisk vildtype voksne for et mutagen (fx til et kemisk mutagen som ENU, selv om der kan gennemføres andre procedurer, såsom retrovirale baseret mutagenese, som også fremme kloning af kromosomfejl), efterfulgt af avl med vildtype hundyr for at skabe en mutageniseret F1-generationen. Sådanne præparater kræve flere måneders arbejde (ca. 6 måneder) baseret på generation tider er nødvendige for at bageste vilde typer, udføre mutagenese, og bag den efterfølgende mutageniserede F1 15,17,22.
Et andet vigtigt punkt til overvejelse i at ansætte haploider for en skærm er valget af zebrafisk stamme. AB * (AB stjerne) stamme er blevet kendt for at producere haploide embryoner med bedre overordnede karakteristika og sundhed end andre stammer 15. Men i den afledte Tübingen stammen opdrættet i vores laborahistorie, har vi for nylig observeret embryologiske funktioner, der har gjort det muligt succesfulde skærme for udviklingsmæssige anomalier i det renale system (G. Gerlach og R. Wingert, upubliceret). Voksen zebrafisk Tübingen stamme hanner blev mutageniseret ved en serie af tre ENU behandlinger, og derefter krydsede til vildtype Tübingen kvinder til at generere en F1 generation til screening. De F1-hunner blev presset til at få æg, og disse F2 æg blev befrugtet med UV inaktiveret sperm. Sammenlignet med diploide koblinger opnået ved fysiske parringer af vildtype Tübingen forældre (figur 3A), embryoner i disse haploide Tübingen strain koblinger udviste en kortere, kompakt krop karakteristisk for den haploide tilstand (figur 3B, C). Endvidere haploide koblinger består typisk af embryo søskende, der viser en række mangler, som vi observerede samt (figur 3B, C), som er kendt for at variere inden for stammer, som diskuteret yderligere nedenfor 15,17. Tidligere undersøgelser har etableret en kanonisk klassificering serie, svarende til lønklasse A til D, at kategorisere den række af haploide fænotype defekter 15,17, og derudover haploider er også blevet henvist til i form af adjektiver god, mellemliggende og dårlig kvalitet 22. Klasse A haploider, svarende til høj kvalitet haploider, er de mest normale i udseende, med en kort og tætbygget krop, men generelt viser en morfologisk udseende ligner diploider 15,17,22 (sammenlign diploide søskende (D) til haploide lønklasse A (mærket A) søskende, figur 3B). Haploide klasse A embryoner også udvikle beskeden perikardiel ødem, hvilket er et typisk træk ved haploidt zebrafisk udvikling 15,17,22 (figur 3B). I forhold til klasse A haploider, mellemliggende eller såkaldt klasse B-haploide embryoner (mærket B, 3B, C) er kendetegnet ved udvikling af en yderligere afkortet, eller bøjet / TwisTED kuffert, selvom funktioner i et hoved og hale er tydeligt skelnes 15,17,22. Endelig lønklasse C eller dårlig kvalitet haploider (også nævnt i nogle referencer som C / D) 15,17,22 er yderst mangelfuld og vise en uorganiseret masse af celler i sammenslutning af med en æggeblomme bold (mærket C, figur 3C). Selv blandt den samme stamme, haploide koblinger varierer i fordelingen af A, B, og C fænotyper, at man vil overholde. For eksempel er den haploide kobling fra en Tübingen kvinde viste en bedre udvikling generelt, med det meste kategori A og B haploide afkom (figur 3B), sammenlignet med haploider opnået fra en anden Tübingen kvinde, hvis kobling bestod af talrige lønklasse C haploide afkom samt A og B-haploide fænotyper (figur 3C). Lignende stamme variation af haploide embryo kvaliteter er tidligere blevet observeret i AB og AB * stamme fisk samt 15.
Trods disse morphological forskelle organogenese af mange strukturer forløber forholdsvis normalt i haploide foster. Selv om de har en kortere krop kuffert, udvikling af organer som øjne og hjerte er forholdsvis svarer til vildtype diploide embryoner og celletyper, såsom pigment celler (melanoforer og xanthophores) kan også evalueres 15.. Derudover har vi dokumenteret for nylig, at de pronephros eller embryonale nyre, er udviklet med 1 dag efter befrugtning i vildtype haploide, på samme måde som vildtype-diploider. Som bevis på dette, viser pronephros celletype mønster den prototypiske mønster af segmenter (figur 4). Endvidere fænotypen af recessive mutationer, der ændrer pronephros udvikling, såsom lib mutation, som reducerer retinsyre produktion, viser et lignende mønster i haploid tilstand i forhold til den diploide tilstand (figur 4) 23,24. Denne observation er i overensstemmelse med andre recessiontende mutationer, der fører til tilsvarende fænotyper i både det haploide og diploide tilstand, selv om dette ikke altid er tilfældet med alle mutationer og bør holdes for øje, hvis evaluere denne type skærm strategi 15.
En række væv og organer er typisk unormalt i haploider. For eksempel haploider vise defekter i omløb, almindeligvis udviser blodophobning, som kan gøre deres evne til at studere nogle aspekter af vasculogenesis begrænsede 15.. Desuden er det blevet bemærket, at haploider kan have uregelmæssigheder i øret udvikling, således at de kan evalueres for mutationer, der forhindrer otisk vesikeldannelse helt, men ikke for mutationer, der påvirker subtile processer med morfogenese af denne struktur 15. Som et andet eksempel på dette, hjerne morfogenese er unormalt i haploider og dermed haploide skærme til at identificere nødvendige hjerne udviklingsveje er begrænset 15.. På trods af disse begrænsninger, vores aNALYSE af nyre udvikling i det haploide tilstand (Figur 4) tilføjer dette organ til listen over 'screenbare' embryonale strukturer. Dette resultat understreger, at en haploidt skærm metode kan bruges til at dissekere de genetiske komponenter af renal stamfader mønster og tilføjer vægt på den følelse, at geniale skærm tilgange kan omgå begrænsningerne i haploidt embryo ontogeny at afdække værdifulde nye mutant modeller til at studere hvirveldyr udvikling 15..
Fig. 1. Skematisk af diploide og haploide screen strategier i zebrafisk model. Efter mutagenese af forældrenes generation kan F1 generation hæves og anvendes enten til at generere F2 mutant familier, der er anvendt til at screene F3 generation i en diploid tilstand (venstre ) eller direkte skærmed i en haploid strategi (til højre). I en haploid skærm, bliver kønsmodne F1 generation hunner bruges til at indsamle haploide F2 koblinger til genetisk analyse. Kvindelige heterozygote bærere identificeres hvis omtrent halvdelen af F2 haploider vise en mutantfænotypen (rød embryoner) sammenlignet med vildtype haploide søskende (gule embryoner).
Figur 2.. Haploide embryo produktion flow chart. De vigtigste trin i in vitro-befrugtning til at producere haploide embryoner skematiseret som udførte opgaver på dag 1 (lyserøde bokse) for at forberede sædceller løsninger og prime voksne zebrafisk hunner opgaver på dag 2 (orange bokse ) at indsamle og UV inaktivere sæd, at indsamle æg, at befrugte æggene med UV inaktiveret sædceller til at generere haploider, og derefter at genoplive den kvindelige mor og finally udførte opgaver på efterfølgende dage 3-5 (gul boks) når kløerne inkuberes til det ønskede tidspunkt (er) for observation og analyse.
Fig. 3. Sammenligning af diploide og haploide Tübingen stamme zebrafisk embryoner. A) Diploide vildtype embryoner blev produceret ved naturlig gydning og inkuberes derefter indtil cirka 30 HPF. B, blev C) Haploide vildtype embryoner produceret ved in vitro-befrugtning af koblinger opnået fra F1 generation mutageniserede hunner med UV-inaktiveret sperm, og inkuberes indtil cirka 30 HPF. Haploider udstillet en række abnormiteter i udvikling sammenlignet med diploide vildtype embryoner (sorte pilespidser, d for at angive diploid). Relativt normale haploider havde en forkortet, mere materiel krop analog til klassificering ordningen A haploide 15 (røde pilespidser, mærket A), mens haploider med grove abnormaliteter udstillet en alvorligt trunkerede kroppens akse (lilla pilespidser, mærket B) svarende til en lødighed på B, og endelig lønklasse C (blå pilespidser, mærket C) baseret på publicerede beskrivelser 15. Alle fostre blev fotograferet live på en 2.5x forstørrelse.
Figur 4.. Developmental mønstret af celletyper, der omfatter pronephros embryonyre organ i haploid Tübingen stamme zebrafisk. Haploide vilde typer vises et normalt mønster af celletyper i embryonale nyre struktur (øverste række). Den embryoniske nyre består af et par af segmenterede funktionelle enheder kendt som nefroner. Den segmenterede mønster af diskrete celletyper stede i nefroner kan visualiseres baseret på hele mount
Discussion
Haploide screening er en nyttig teknik til at opdage væsentlige gener nødvendige for tidlige udviklingsstadier. Endvidere har dyrkning af haploide celler fra Medaka fisk blevet brugt til at isolere ES-lignende cellelinier, der har mange forsknings-applikationer og muligheder, der viser, at haploide celler kan give en værdifuld fremtidig mødested for andre typer af hvirveldyr genetiske undersøgelser 20,21. Denne protokol giver en demonstration af de involverede med at udføre produktionen af haploide zebrafisk embryoner gennem in vitro-befrugtning med UV inaktiveret sperm metoder. Denne metode kan bruges til at udføre frem haploide skærme med mutageniserede F1 fisk, hvilket kan gøres ved hjælp af vildtype, transgene eller mutantstammer til forstærker / suppressor screening.
Selvom screeningen tid ved hjælp af en haploidt strategi langt er afkortet i forhold til diploide screening, vil det dog tage flere måneder at gennemføre. Som vi descriseng tidligere, der er mange fordele, der findes ved at udføre en skærm ved hjælp af en haploide skema, som alle kan støtte i at gøre nye bidrag til den aktuelle viden om en række udviklingsmæssige begivenheder. Det haploide skærm metoden er mere effektiv til identificering af recessive mutantalleler end diploide-baserede skærme på grund af reduktion af tid, plads og antallet af fisk, der er nødvendige. Der er imidlertid flere faldgruber en haploid skærm. En haploidt skærm kan kun identificere mutanter i gener, der er aktive inden for de første par dage af udvikling, da fosteret kun kan overleve i en begrænset periode med en haploidgenom. Gener, der udtrykkes senere i udviklingen skulle identificeres ved en anden metode, såsom en diploid skærm. Også, nogle organer ikke udvikle sig ordentligt i en haploid organisme. Der kan være anatomiske abnormiteter eller en forsinket tidspunkt i udviklingen, som kan forårsage mutationen at blive savnet af det haploide screening teknik. Jegn kommer, at nogle stammer af fisk ikke udvikle sig så godt i en haploid tilstand 15. Haploider kan kategoriseres efter en klassificering serie af gode, mellemliggende og fattige embryonale funktioner med embryoner er den mest normale, B til at udpege embryoner med defekter i aksen, men et klart hoved og hale, og C / D til at udpege embryoner med uigenkendelige funktioner (Masser af celler oven æggeblomme bolde) 15,17. Andelene af embryoner inden for disse kategorier varierer fra zebrafisk stamme, med øget antal af bedre kvalitet haploider mere fremherskende i bestemte genetiske baggrunde 15,17. På grund af disse faktorer, er det nødvendigt at finde en ordentlig stamme af zebrafisk at udføre mutagenese og efterfølgende kors. I vores seneste erfaringer vildtype Tübingen stammen producerede levedygtige haploider til screening (som vist i figur 3 og 4), selv om historisk zebrafisk forskere har udnyttet AB eller AB * stammer til haploidt experimtation 15.
Ud over disse førnævnte udfordringer vil ikke alle primede voksen zebrafisk hunner en kobling ved udførelse af klemme teknik. For eksempel i arbejdet med ENU-mutageniseret Tübingen strain hunner, omkring halvdelen af alle kvinder produceret en kobling ved at klemme, og nogle brøkdel af disse (typisk 10-30%) var dårlig embryo kvalitet eller ikke kunne blive befrugtet. Således at udføre en haploidt skærm skal man planlægger at rejse mindst dobbelt så mange fisk som nødvendigt at screene det ønskede antal genomer (hver hun repræsenterer et genom screenet). Uanset denne betragtning, at fordelene ved det haploide fremgangsmåde til screening til at dække store antal af genomer uden en massiv dyrefacilitet er faktisk ganske betydelig, hvis assayet er modtagelig for det haploide tilstand. Imidlertid bør det også bemærkes, at yderligere undersøgelse af mutationen (r) identificeres i det haploide kobling er helt afhængig af succes hæve enn udkryds fra den kvindelige grundlægger. Som med enhver skærm, 'hits' oprindelig identificeret under screeningen proces skal være re-identificeret i den diploide tilstand.
På trods af de faldgruber ved at bruge det haploide skærm, har det vist sig at være meget vellykket i at identificere mutanter, der er blevet analyseret i dybden med indsigtsfulde gevinster til det videnskabelige felt 15. Haploide skærme kan gennemføres for at undersøge andre dårligt forståede processer hvirveldyr udvikling. Brug haploider til forstærker og suppressor-skærme er en måde at få mere indsigt i de aktiviteter og regulerende netværk af et gen af interesse. Det haploide screening teknik kan også anvendes til at identificere enhancere og suppressorer af mutanter, der allerede er blevet isoleret ved fremgangsmåder, såsom kemisk eller insertionsmutagenese eller omvendt genetik tilgange som TILLING eller TALENS. Kort sagt kan det tidligere isolerede mutant mutageniseres med ENU og screenes for enhancere eller suppressors i den oprindelige mutant fænotype. Mutanten skal være i stand til at nå voksne stadier, så det er nødvendigt at have en heterozygot dyr eller en svag homozygot mutant fisk til at udføre denne skærm, men nylige fremskridt inden for gensplejsning har gjort det muligt for forskerne at skørtet dette problem. At lære at manipulere veje i udviklingen kan føre til mange spændende muligheder, herunder udsigten til forstyrrende veje til at behandle sygdomstilstande.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af finansiering til RAW fra følgende: NIH tilskud K01 DK083512, DP2 OD008470 og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award # 5-FY12-75; opstart midler fra University of Notre Dame College of Science og Biologisk Institut; og en generøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne af Gallagher Family at fremme stamcelleforskning. De finansieringskilderne havde nogen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet. Vi takker stabe af Biologisk Institut for deres støtte, og Center for zebrafisk Forskning på Notre Dame for deres enestående engagement i pleje og velfærd for vores zebrafisk koloni. Vi takker GF Gerlach for at tage fotografier, der er fastsat i fig. 4. Endelig vil vi takke alle medlemmer af vores forskningslaboratorium for deres kommentarer, diskussioner og ubetydeligehts om dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
References
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al.
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genetics. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , Humana Press. (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
