Abstract
דג הזברה הפכה מודל חוליות הזרם המרכזי שהוא רלוונטי לתחומים רבים של מחקר מדעי. דג הזברה מתאים במיוחד גם לניתוח גנטי קדימה של תהליכים התפתחותיים עקב ההפריה שלהם החיצונית, גודל עוברי, ontogeny המהיר, ובהירות אופטית - מערך של תכונות המאפשרות תצפית הישירה של אירועים החל gastrulation לorganogenesis עם סטראו בסיסי. יתר על כן, עוברי דג הזברה יכולים לשרוד במשך כמה ימים במדינה הפלואידים. הייצור של עוברי הפלואידים במבחנה הוא כלי רב עוצמה לניתוח מוטאציות, כפי שהיא מאפשרת זיהוי של אללים מוטציה רצסיבית הנמצא בדור הראשון (F1) נושאות נשיות הבאות mutagenesis בדור ההורים (P). גישה זו מבטלת את הצורך להעלות את מספר דורות (F2, F3 וכו ') הכולל רבייה של משפחות שעברו מוטציה, ובכך לחסוך הזמן חוקר יחד עם הפחתההצרכים למרחב דג הזברה מושבה, עבודה ועלויות גידול. למרות שהדג זברה שימשה לנהל קדימה מסכי בעשורים האחרונים, חלה הרחבה מתמדת של כלים לעריכה מהונדסים וגנום. כלים אלה עכשיו מציעים שפע של דרכים ליצירת מבחני ניואנסים למסכי דור הבאים שיכול לשמש כדי לנתח עוד יותר את רשתות הרגולציה גנים המניעים את חוליות ontogeny. כאן, אנו מתארים כיצד להכין עוברי דג הזברה הפלואידים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם למסכי רומן עתיד הפלואידים, כמו במסכים משפר ומדכאים, כדי לטפל במנגנונים של פיתוח למספר רחב של תהליכים ורקמות היוצרים בשלבים עובריים מוקדמים.
Introduction
התהליכים הבסיסיים שלתזמר פיתוח חוליות הם נשמרים באופן כללי 1. דרך רבת עוצמה לזיהוי גנים עם תפקידים חיוניים בפיתוח היא לבודד מוטציות תורשתיות הגורמים לפגמים פנוטיפי בתהליך של עניין. דג הזברה, Danio rerio, הוא בעלי חוליות קטנים של מים מתוקים השייך למשפחת דגי Cyprinidae שהפכה לאורגניזם מודל בשימוש נרחב לגנטיקה התפתחותית חוליות בעשורים האחרונים 2. ביצי דג הזברה הם מופרה חיצוניים, המאפשרים גישה להזיגוטה מהתחלתה של הפריה 3. יתר על כן, העובר המוקדם הוא שקוף אופטי, המאפשר הדמיה של פיתוח עם סטראו פשוט 3. ontogeny דג הזברה הוא מהיר, עם התהליכים של מחשוף, gastrulation, וorganogenesis של מבנים רבים, כגון לב וכליות, השלימו במידה רבה על היום הראשון של פיתוח 3. Tהוא הזמן משלבי זחל לבגרות מינית לוקח 2-3 חודשים, והמבוגרים הם בעלי חוליות קטנות כ 3-4 סנטימטר באורך, יכול להישמר כל כך הרבה דגים בשטח מינימאלי 2. בנוסף, יש לי מבוגרים דג הזברה פוריות גבוהה, עם כל דגים מסוגלים לייצר כמה מאה עוברים בשבוע 2. תכונות אלו הפכו את העקיבות של דג הזברה לקדימה לאחור מסכי גנטיים. דג הזברה יש רמה גבוהה של שימור באנטומיה שלהם, ביולוגיה של תא, ופיזיולוגיה עם יותר מינים של בעלי חוליות מתקדמים כמו יונקים 2,4. למעשה, ניתוח הרצף האחרון הוכיח כי הגנום דג הזברה מכיל homologs לכמעט 70% מהגנים אנושיים 5. שימור זו אפשר לחוקרים להשתמש בדג זברה כמודל למחלות בבני אדם רבים, ובם שתי עובריים ו2,4 תנאים מבוגרים. יחדיו, גורמים אלה הפכו את דג הזברה מערכת מצוינת למסכים שמטרתה זיהוי גנים החיוני לontogeny חוליות נורמלי.
מספר המסכים בקנה מידה הגדול שבוצע בדג זברה וזיהה כמה אלף מוטציות בגנים התפתחותיים 6-8. זכר בוגר דג הזברה הוא נוח לmutagenesis, ויכולים להיות שנוצרו שינויים כרומוזומליים בתדירות גבוהה יחסית באמצעות ethylnitrosourea mutagen הכימי (ENU) 6,7 או mutagenesis insertional רטרווירלי 9. נכון להיום, למעלה מ 9,000 מוטציות תורשתיות נוצרו, והם כוללים גנים המשפיעים כמעט על כל ההיבטים של עובר. קהילת דג הזברה הקימה בנק מרכזי של מוטציות אלה במרכז דג הזברה הבינלאומי המשאבים (או Zirc) 10, שנאסף כ -5,000 אללים מוטנטים ומהונדסים מכל רחבי העולם. רבים ממוטציות אלו כבר נותחו ומשובטים, לתת לחוקרים על פני תחומים ביולוגיים מידע בעל ערך שבו נעשה שימוש להקניט בנפרד נומרומסלולי הסלולר והפיסיולוגיים דרך תובנות שמקורן בניסויי דג הזברה.
למרות שמסכים קדימה זיהו מספר מרשים של גנים חשובים, הרבה עדיין לא זוכים להערכה על רשתות רגולציה הגנטיות אשר מתווכות מספר עצום של תהליכים. מסכים רבים שנעשה עד כה לא הגיע לרוויה, ולכן קדימה, כמו גם מסכי גנטיים הפוך נשארו אבן פינה לזהות ולנתח את מנגנונים של עובר. אמנם יש תובנות עצומות שניתן לדלות מכל קו מוטציה דג הזברה אחת, גורם מרכזי המגביל בתחום כבר היסטורי מאמץ הזמן רב המעורב בשיבוט positional. מסיבה זו, את זהותו של מוטציות כימית שגרמו רבות נותרה בגדר תעלומה. עם זאת, עם כניסתו האחרונה של גישות רצף הגנום כולו המאפשרות שיבוט מהיר 11-14, זיהוי יעיל מאוד של מוטציות גנטיות הוא עכשיו פהasible.
המסך קדימה הטיפוסי בדג הזברה הוא מסך דיפלואידי שיכול לזהות מוטציות רצסיבי בתוך שלושה דורות 6,7 (איור 1, עזב את הטור). טכניקה זו כרוכה מוטציות יצירה בתאי הנבט של זכר ההורים (P), ולאחר מכן הזדווגות הזכר הזה עם נקבה מסוג בר. כל אחד מצאצאי הדור הראשון (F1) מהזדווגות זו תהיה נמל מוטציות ייחודיות אחד או יותר בשל תרומות כרומוזומליות של הגנום האבהי שעבר מוטציה. צאצאי F1 גדלים וoutcrossed עם סוגים פראיים ליצור משפחות F2. במשפחת F2, אחים יהיו גם סוג בר או נשאים הטרוזיגוטיים, והם incrossed באופן אקראי כדי ליצור ציפורני F3 שהם ניתחו לפנוטיפ (ים) של עניין. ציפורני F3 של נשאים הטרוזיגוטיים תכיל 25% סוג בר, הטרוזיגוטיים 50%, ו25% דגים מוטנטים הומוזיגוטים. סכימת הקרנה רבת דורית זו היא יעילה, עם זאת חסרון עיקרי אחד לזהpproach כולל את הזמן הדרוש כדי להתכונן למסך: לפחות 1 שנה של גידול דגים לבד מעורבת, שכן כל דור ודור דורש כ 3 חודשים כדי להגיע לבגרות מינית. מגבלות אחרות של סוג זה של מסך דיפלואידי הן העבודה, מרחב, ועלות דיור דורות הבאים.
מסך הפלואידים הוא חלופה אחת שיכול לשמש לזיהוי ולאחר מכן לבודד מוטציות רצסיביות באמצעות אסטרטגיות mutagenesis דומות 15 (איור 1, עמודה ימנית). הייצור של עוברי דג הזברה הפלואידים תואר לראשונה לפני למעלה משנתי 30 16, ואת יכולתו של דג הזברה בדרך כלל דיפלואידי לפתח במשך כמה ימים עם ploidy כרומוזומליות הפלואידים נוצלה עבור מחקרים גנטיים רבים שכן זה זמן. היתרון העיקרי של מסך הפלואידים הוא ששיטה זו אינה כרוכה בגיוס משפחות F2 כדי למסך עבור אללים מוטציה רצסיבית. במקום זאת, נקבות דור F1 מוערכות עבורheterozygosity של מוטציות רצסיבית בתהליך של עניין על ידי בחינת צאצאי F2 במצב הפלואידים (איור 1, עמודה ימנית). בסך הכל, הצעדים כדי להשיג עוברי הפלואידים הם יחסית פשוטים (איור 2). לאחר ההכנה של הפתרונות הנחוצים לטיפול בזרע, ביצים מתקבלות מנקבות דור F1 על ידי מניפולציה ידנית כדי extrude (או "לסחוט") את הביצים מהבטן. ברגע שהביצים מתקבלות, הם מופרה במבחנה על ידי חשיפה לקרינת אולטרה סגולית זרע (UV) מומת. הזרע המומת UV אינו מסוגלים לתרום DNA קיימא לביצה בשל העובדה שUV באורך הגל הקצר Crosslinks DNA האבהי. עם זאת, הזרע עדיין מסוגל לעורר פעילות ביצה ואירועים הקשורים בהתפתחות zygotic. עם ההפעלה מטבולית, הביצה תשלים מיוזה השנייה, ולהמשיך לפתח עם העותק הופקד אימהי רק אחד מכל chromosoשלי. בגלל ploidy 1N זה, העובר הוא בכפוף לתוצאות התפתחותיות של אלל מוטנטי רצסיבי, אם הוא קיים בכרומוזום אימהי. לכן כל מצמד הפלואידים F2 יכיל wildtype 50% ועוברי מוטציה 50% אם האם נשאית הטרוזיגוטיים של אלל רצסיבי penetrant באופן מלא. התפלגות זו של גנוטיפים עובריים מאפשרת בקלות יחסית במונחים של הערכת המצמד לנוכחותו של פנוטיפ מוטנטי (ים) של עניין. אם הפנוטיפ שיאתר כזו, המייסד הנשי דור F1 הוא outcrossed המשך לדג זברת זכר סוג בר ליצור ולגייס יותר נשאים הטרוזיגוטיים. בגלל זה הוא לא הכרחי להעלות מספר דורות כדי לבצע את המסך, החוקר יכול לחסוך זמן ניכר, עבודה, ובמרחב באקווריום, אבל עדיין יש לו את הכוח לסקור מספר משמעותי של הגנום המבוסס על מספר נקבות F1 נבדק. לפיכך, מסכי הפלואידים הם ריאלי במיוחד עבור מעבדות קטנות או פרויקטים שיזמו בabsencדואר של מימון משמעותי.
עם זאת, ישנן מספר מגבלות וחסרונות לשימוש בhaploids. ראשית, עוברי דג הזברה הפלואידים חיים רק כמה ימים, ובדרך כלל למות בין 3 ל 5 ימים לאחר הפריה (DPF) 15. ניתן להבחין בין עוברי דג הזברה הפלואידים מdiploids מבוסס על כמה מאפיינים, ובראשם להיות גוף נמוך ומוצק שיש מספר הנורמלי של מגזרי somite 15,17 בכל זאת. כמו פיתוח מתקדם, מיצגי המוח מוגברים מוות של תאים וזרימת הדם לקוי, מזוהים בדרך כלל עם איגום דם על ידי 2-3 DPF ובצקת 15,17. יתר על כן, haploids מצליח לנפח 15,17 שלפוחית השחייה. ללא קשר להבדלים מורפולוגיים אלה, רוב האיברים ורקמות גדולים נוצרים, כולל הלב, עיניים, ו15,17 notochord. תכונה אחת שצוין על ציפורני הפלואידים הוא שהם מכילים מגוון של פנוטיפים במונחים של סוגים שונים של עוברים & # פגומים8212; תכונה שנצפתה על פני זני דג הזברה. לפיכך, יש לוודא אם הרקמה (ים) ונקודת העניין בזמן להראות התפתחות תקינה באופן סביר במתח הפלואידים הסוג בר, ולכן יש לו את הפוטנציאל להיות מוערך על פגמים גנטיים במסך או פרויקט מחקר אחר.
למרות אתגרים אלו, מסכי הפלואידים יושמו בהצלחה לזיהוי גנים הנדרשים לתהליכי התפתחות מוקדמים בדג הזברה, ופרוטוקולים הפלואידים כבר מבוססים היטב משאבים בקהילה במשך שנים רבות 15-19. לאחרונה, התהליך של יצירת עוברי דגים הפלואידים נוצל בעבר על ידי חוקרים כדי ליצור גזע עוברי הפלואידים (ES) בתרביות תאים מדגי medaka 20,21. לאחר הייצור של עוברי הפלואידים medaka חוץ גופייה, העוברים המשמשים לחישוב תרביות תאים ראשוניים שpassaged ל-15 שבועות ואחריו עוד 5-8 שבועות כדי ליצור שיבוטים טהורים של תאים הפלואידים עםמאפייני תא ES 15-19. הדור של שורות תאי דגים הפלואידים ES טומן בחובו הבטחת עתיד רחבה לניתוח פנוטיפים רצסיבי בשושלות תאים בעלי חוליות, ומייצג גישה חדשה לניתוח גנטי בשנים הקרובות. כך, הדור של עוברי דגים הפלואידים יש גובר יישומים בקהילת המחקר ביו. מאמר וידאו זה מספק הדגמה ויזואלית של השלבים כרוכים ביצירת עוברי דג הזברה הפלואידים במבחנה באמצעות זרע מומת UV המבוסס על פרוטוקולים הוקמו 15-19,22.
Protocol
הערה: הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת נוטרדאם. הערה: אף על פי הפרוטוקול הבא מספק הדגמה של בידוד זרע שכרוך בהמתת חסד של זכרים, זרע ניתן לאסוף מנקבובי באיברי המין של הרדים חיים דג הזברה זכר באמצעות לחץ בטן עדין וmicrocapillary לאיסוף זרע 17,18. סחיטה של זכרים חיים דורשת כמה גברים כדי לשמש על מנת לאסוף כמות שווה הערך של זרע שניתן להשיג מאחד 17,18 זכר מורדמים. עם זאת, גברים שעברו סחיטה להישאר בריאים למדי ויכולים לשמש להזדווגויות טבעיות או נהלים שבלאחר מכן מבחנה 17. במידת האפשר, נהלים שנבחרו צריכים למזער הקרבת דגים מיותרת.
1. הכנת הפתרונות ולשכות מזווגים דג הזברה
<ol>2. Dissection של אשכים
- הפוך טרי # 6 מלאי הפתרון של האנק ידי הוספת 0.35 גרם של סודיום ביקרבונט ל10 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבבים היטב לפזר אבקת הסודה לשתייה.
- לשלב הבא בצינור על קרח על מנת להפוך את הפתרון עובד הסופי של האנק שנאגרו לזרע: 9.9 מיליליטר של הנקס Premix אני עם של פתרון מניות 100 μl # 6.
- מערבבים היטב, ולאחר מכן aliquot 500 μl של האנקפתרון של גמר עבודה לתוך צינור microcentrifuge ומניחים על קרח; 7. הערה: כל aliquot μl 500 ישמש כדי להכין את הזרע מהאשכים של 4-5 דג הזברה ממין זכר.
- בחר בין 4-5 דג הזברה זכר לכל קציר זרע. הערה: זה למסוק מספיק זרע שנאסף, מעובד ומאוחסן בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge אחד, אשר יכול להיות מנוצל כדי להפרות כ 15 ציפורניים הפלואידים. בחר מחזורים נוספים של זכרים על מנת להכין את צינורות נוספים תלוי בהיקף של הניסוי. אם דג הזברה הזכר שנבחר הוא קטנים או נתיחת האשכים אינן שלמה, בדרך כלל 5 זכרים יהיו צורך.
- להרדים כל זכר באמצעות רשת להעביר בעדינות את הדגים לצלחת המכילה tricaine 0.2% למשך כ 5-6 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: היזהר, כדי להבטיח שהזכר כבר מורדמים כראוי לפני תחילת הניתוח. בדרך כלל, להמתין מספר דקות (2-3) אחרי הזימים של מפסיק לנוע דגים והדגיםכבר לא מגיב למגע.
- לבחור את הגברי בעדינות עם כפית פלסטיק ולמחוק את הזכר היבש של נוזל בזהירות. בשלב בא, להסיר את ראשו של הגבר עם זוג מספריים חד ולאחר מכן לחתוך חתך לאורך קו האמצע הגחון. הערה: להסרת של כל הנוזל העודף מהדגים היא חיונית כדי למנוע מפעילה הפעלה של הזרע.
- הסר את הבטן ואיברי הבטן קשורה מחלל הבטן באמצעות מלקחיים ומקום טובים למכל Biohazard לסילוק.
- שימוש במלקחיים בסדר להסיר את האשכים, אשר ממוקמים לאורך קיר גוף הגבי, לרוחב לשלפוחית השחייה, ויש לו מראה לבן אטום, כאשר מתחת לסטראו. הערה: שמירה על האשכים שלמים יכולה לעזור כדי למנוע חשיפה של הזרע לנוזלי גוף על בסיס מים ובכך למנוע הפעלה מוקדמת.
- מניחים את האשכים לתוך תמיסת הזרע בקרח ולשמור את הצינור על קרח כאשכים אחרים הם גזורים. חזור על שלבים 2.6-2.9 עד שכל מ 'Ales כבר גזור.
- מניחים את הפגרים וכל רקמות בבעלי חיים שנותרו למכל Biohazard להשלכה מוסדית מתאימה.
3. UV זרע איון
- Homogenize האשכים בעדינות על ידי טחינת צינור microcentrifuge עם העלי microtube סטרילי.
- מעביר את supernatant לצלחת פטרי קטן או זכוכית שעון על קרח. הערה: אל תעביר פסולת רקמות יחד עם פתרון supernatant. הפעולה זו תיצור צללים ולהתפשר איון UV של זרע.
- יש לשטוף את צינור הזרע עם בין 300-400 μl של הפתרון של האנק נוסף גמר עבודה (מוכן בשלב 2.2 ומאוחסן על קרח), ולהוסיף לשטוף supernatant זה לצלחת פטרי הקטנה או לצפות בזכוכית בשלב 3.2.
- לחשוף את הצלחת לUV ממנורת ספסל (254 ננומטר) עבור סכום כולל של 2 דקות במרחק ממקור המנורה של כ 15 ב( 38.1 סנטימטר). הערה: השתמש בזהירות בעת עבודה עם מנורת UV וללבוש מגן פנים אוציוד אחר עין מגן אישי.
- להחזיר את הצלחת לדלי הקרח, ואז להעביר את הזרע המומת UV לצינור microcentrifuge טרי ולאחסן את המדגם על קרח. הערה: בשלב זה לא יהיה כ 800 μl של זרע UV מומת להפריה מצמד הפלואידים. הזרע צריך להיות כל הזמן על קרח לאורך כל משך הזמן המושקע בלוחץ נקבות. זרע בהאנק של קר יכול לשמש לתקופה של עד 6 שעות ללא הפחתה כלשהי בתוצאות הפריה. מעניין לציין, כי חוקרים אחרים דיווחו כי הזרע בהאנק של קר הוא בת קיימא מכמה שעות עד כמה ימים 18.
4. רכש ביצה ממבוגרי דג הזברה נקבה והפריה חוץ גופית של המצמד
- הכן אמבטיה tricaine להרדמה על ידי שילוב של 20 מיליליטר של 0.2% מניית tricaine עם 80 מיליליטר של מים במערכת דגים.
- בחר את הנקבה לאיסוף ביצים, תוך שימוש ברשת כדי למקם אותה בעדינות בצלחת של TRicaine.
- חכה 2-3 דקות עד שהנקבה היא מורדמת וכבר לא מגיב למגע. הערה: אם הפרכוסים או נקבה מעוררות תנועות אחרות, לתת זמן הנוסף להיכנע להרדמה.
- השתמש בכפית פלסטיק בעדינות להרים את הנקבה, decanting הפתרון לפני הצבת הנשים על גבי מגבת נייר לפתיל משם את נוזלים עודפים. הערה: היזהר שלא לעזוב את פתרון נוסף על הנקבה, כנוזל יפעיל הפעלת ביצה לפני התוספת של זרע.
- הנח את הנקבה בשקופית שלה בצלחת פטרי נקייה ולדמיין את בטנה מתחת לסטראו.
- מלטף את הבטן של הנקבה בעדינות במשך כ 10-20 שניות באמצעות אצבע אחת או שתיים מהיד אחת כדי לסחוט את הביצים מהבטן שלה, בינתיים תמיכה בגב של הנקבה על ידי מיקום אצבע אחת או שתיים מצד השני, ממש מאחורי קיר הגוף הגבי שלה. הערה: לאחר שמלטף את הבטן של הנקבה, את הביצים צריכה לצאת בקלות רבה. אם ביצים לא תצא שנינותשעות להקל זה לא מומלץ ל'לדחוף חזק יותר 'וביצים בכוח מהמין הנקבה. זה מצביע על כך הביצים אינן נוכחים ו / או לא מוכנות להפריה, והמשיך לדחוף קשור לסיכון ניכר של פגיעה בנשים (למשל, ניכוי שלפוחית השחייה או גרימת חבלה פנימית קטלנית אחרת). אם נקבה היא לחצה אבל מספקת ביצים אף אחד או כמה, להחזיר את הנקבה למתקן של בעלי החיים. לאחר 1-2 שבועות של מנוחה, זוג הנקבה עם זכר להזדווגות טבעית כדי לנקות את פסולת ביצה שיורית. להפריד נקבות, כי בן הזוג באופן טבעי למכל לעוד 1-2 שבועות של מנוחה לפני שאתה מנסה לסחוט שני. לחלופין, יכולות להיות נחות נקבות במשך 4 שבועות, שבמהלכם ניתן להגדיר להזדווגויות טבעיות 15.
- השתמש בדיקה קנס או מרית קטנה כדי לגרוף את ביצים מתחת לנקבה ו / או משטחה בבטן.
- רם בעדינות את הנקבה ותחזיר אותה למכל בידוד שכותרתו כראוי מכיל מים מערכת דגים. </ Li>
- הוסף 50 μl של פתרון זרע UV מומת למקבץ ביצים, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 שניות שבמהלך זמן, להדביק תווית מתאימה לצלחת לעקוב אחריו עם המספר שהוקצה להורה הנקבי.
- הוסף 1 מיליליטר של E3 לביצים, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך דקות 1.
- הוספת פתרון E3 מספיק כדי למלא את הצלחת באמצע הדרך, ולמקם את העוברים ב28 מעלות צלזיוס במשך דגירה לאחר מכן. הערה: התוספת של פניצילין / סטרפטומיצין (1% (v / v) פתרון העט סטרפטוקוקוס המכיל פניצילין 5,000 יחידות ו -5 סטרפטומיצין מ"ג לכל מיליליטר) 19 לE3 יכול לסייע בבריאות כללית של העוברים הפלואידים.
5. תצפית וטיפול בעוברי הפלואידים
- אחרי 4-8 שעות, להסיר עובר מופרה מהצלחת ולשטוף את העוברים שנותרו על ידי החלפת כלי תקשורת עובר E3 עם פתרון E3 טרי. הערה: עוברים מופרה יציגו מראה לבן, אטום או יכולים להציג שקוףppearance עם תא בודד מעוות.
- דגירה עד נקודת העניין בזמן רצוי, ולאחר מכן לנצל בassay המסך הרצוי או יישום אחר במחקר (ים).
Representative Results
הייצור של עוברי הפלואידים ניתן ליישם כדי לזהות מוטציות רצסיבי בדור F2 כאשר haploids מתקבלים מנקבות דג הזברה בוגרות, כי הם הצאצאים של הורי mutagenized (איור 1). זה חוסך זמן ומרחב בהשוואה למסך דיפלואידי המסורתי, שבו חוקרים צריכים להעלות משפחות F2 שדיפלואידי צאצאים לאחר מכן העריכו לפנוטיפים של עניין (איור 1).
השלבים העיקריים בפרוטוקול מתואר בשלבי 1-5 לעיל לקבלת עוברי הפלואידים דג הזברה באמצעות הפריה חוץ גופית הם schematized כתרשים זרימה (איור 2). צעדים אלו, כרוכים בהכנה של פתרונות ויחולו נשים על ידי חשיפה להורמונים זכריים בטנקי הזדווגות (יום 1), ואחריו זרע וביצית ורכש בהפריה חוץ גופית (יום 2), ולבסוף גידול של haploids (ימי 3-5) (איור 2). כאשר combined עם מסך גנטי, הליך mutagenesis נפוץ בדג הזברה כולל חשיפה קודמת של המבוגרים סוג בר דג הזברה הזכר לmutagen (למשל, לmutagen כימי כמו ENU, למרות שהליכים אחרים, כגון mutagenesis רטרווירלי מבוסס יכולים להיות מיושמים שגם להקל על שיבוט של פגם כרומוזומלי), ואחרי רבייה עם נקבות סוג בר ליצור דור F1 mutagenized. היערכות כזו דורשת מספר חודשים של עבודה (כ 6 חודשים) המבוססת על זמני הדור נזקקו לסוגים האחוריים פראיים, לבצע mutagenesis, ומאחור F1 15,17,22 mutagenized שלאחר מכן.
נקודה חשובה נוספת לשיקול בהעסקת haploids למסך היא הבחירה של זן דג הזברה. זן AB * (כוכבית א.ב.) הפך ידוע להפקת עוברים הפלואידים עם מאפיינים טובים יותר כולל ובריאות יותר מאשר זנים אחרים 15. עם זאת, בזן טובינגן נגזר גידל בlaboraטורים, יש לנו לאחרונה נצפו תכונות עובריות שאפשרו מסכי מוצלחים עבור חריגות התפתחותית של מערכת הכליות (ג'גרלך ור 'Wingert, לא פורסם). זכרים מתח למבוגרים דג הזברה טובינגן היו mutagenized על ידי סדרה של שלושה טיפולי ENU, ולאחר מכן עברו לנקבות טובינגן סוג בר לייצר דור F1 להקרנה. נקבות F1 נדחקו כדי להשיג ביצים וביצי F2 אלה הופרו בזרע UV מומת. בהשוואה לציפורני דיפלואידי מתקבלות על ידי הזדווגויות טבעיות של הורים מסוג בר טובינגן (איור 3 א), עובר בציפורני מתח אלה הפלואידים טובינגן מוצג אופייני קצר יותר, מוצק תא מטען של המדינה הפלואידים (3B דמויות, C). יתר על כן, ציפורניים הפלואידים בדרך כלל מורכבת של אחים עובר המציגים מגוון רחב של פגמים, שבו צפה, כמו גם (3B דמויות, C), אשר ידוע להשתנות בתוך זנים, כפי שנדון בהמשך 15,17. מחקרים קודמים קבעו שורה לדירוג הקנונים, המקביל לכיתות א 'עד ד', לסווג את מגוון רחב של פגמים פנוטיפ הפלואידים 15,17, ובנוסף haploids יש גם מכונה במונחים של התארים באיכות טובה, בינונית וגרועה 22. haploids כיתה, המקביל ל haploids באיכות גבוהה, הם הכי נורמלי במראה, עם גוף קצר ומוצק אבל בסך הכל מראה מראה מורפולוגיים דומה לdiploids 15,17,22 (השווה אחים דיפלואידי (ד) לכיתה הפלואידים (שכותרתו א) אחים, איור 3 ב). עוברי כיתה הפלואידים גם לפתח בצקת קרום הלב צנועה, אשר היא תכונה אופיינית של פיתוח דג הזברה הפלואידים 15,17,22 (איור 3 ב). בהשוואה לhaploids כיתה, עוברי הפלואידים כיתה ב 'ביניים או מה שנקרא (ב שכותרתו, דמויות 3B, C) נבדל ביניהם בפיתוח של עוד קיצר או מפותל / twisתא מטען טד, אם כי תכונות של ראש וזנב הם באופן ברור 15,17,22 להבחין. לבסוף, haploids C כיתה או באיכות ירודה (גם מופיע בכמה הפניות כמו C / D) 15,17,22 מאוד פגומים ולהציג המוני מאורגנת של תאים בהתאחדות עם חלמון כדור (C שכותרת, איור 3 ג). גם בקרב אותו הזן, מצמדים הפלואידים להשתנות בחלוקת פנוטיפים A, B, ו-C שאחד לא רואה. למשל, המצמד הפלואידים מנקבה אחת טובינגן מוצג התפתחות טובה יותר בסך הכל, עם בעיקר וצאצאים הפלואידים רמת B (איור 3 ב) בהשוואה לhaploids מתקבל מנשי טובינגן שנייה, המצמד שכן היה מורכב מצאצאים הפלואידים C כיתה רבים ופנוטיפים B הפלואידים (איור 3 ג). השתנות זן דומות של ציוני עובר הפלואידים כבר נצפו בעבר בדגי זן AB ו AB * כמו גם 15.
למרות מור אלההבדלי phological, organogenesis של מבנים רבים ממשיך יחסית בדרך כלל בעובר הפלואידים. אמנם יש להם תא מטען, פיתוח גוף קצר יותר של איברים כמו העיניים ולב הוא יחסית דומה לזה של עוברי דיפלואידי סוג בר, והוא יכול גם להעריך סוגי תאים כמו תאי פיגמנט (melanophores וxanthophores) 15. בנוסף, יש לנו תיעדנו לאחרונה כי הכליה ראשית, או בכליות עוברית, שפותחה על ידי ביום 1 לאחר הפריה בהפלואידים הסוג בר, בדומה לdiploids סוג בר. כראיה לכך, דפוסים סוג תא כליה ראשית מציג את הדפוס הטיפוסי של מגזרים (איור 4). יתר על כן, את הפנוטיפ של מוטציות רצסיבי שמשנות את התפתחות כליה ראשית, כמו המוטציה lib שמפחיתה את ייצור חומצה רטינואית, הראה דפוס דומה במדינה הפלואידים בהשוואה למצב דיפלואידי (איור 4) 23,24. תצפית זו עולה בקנה אחד עם זה של reces האחרsive מוטציות המובילות לפנוטיפים דומים בשני תנאי הפלואידים ודיפלואידי, אם כי זה לא תמיד מקרה עם כל המוטציות וצריך לזכור אם הערכת סוג זה של אסטרטגית מסך 15.
מספר הרקמות והאיברים הם בדרך כלל לא נורמלים בhaploids. לדוגמא, haploids להציג פגמים במחזור, בדרך כלל מציגים איגום דם, מה שעשוי להפוך את היכולת שלהם ללמוד כמה היבטים של vasculogenesis מוגבלת 15. בנוסף, זה כבר ציין כי haploids יכול להיות אי סדרים בהתפתחות אוזן, כזה שהם יכולים להיות מוערכים על מוטציות המונעות היווצרות שלפוחית otic לגמרי, אבל לא למוטציות המשפיעות על תהליכים עדינים מעורבים עם המורפוגנזה של מבנה זה 15. כדוגמא נוספת לזה, המורפוגנזה המוח היא חריגה בhaploids, ולכן מסכים הפלואידים לזהות מסלולי התפתחות המוח הנדרשים מוגבל 15. למרות מגבלות אלה, שלנוnalysis של התפתחות כליה במדינה הפלואידים (איור 4) מוסיף איבר זה לרשימה של מבנים עובריים 'screenable'. ממצא זה מדגיש כי המתודולוגיה מסך הפלואידים יכולה לשמש גם כדי לנתח את המרכיבים הגנטיים של דפוסים אב כליות ומוסיפה דגש לסנטימנט שגישות מסך גאוני יכולות לעקוף את המגבלות של ontogeny עובר הפלואידים לחשוף דגמי מוטציה חדשים יקרים ללמוד פיתוח חוליות 15.
איור 1. סכמטי של אסטרטגיות מסך דיפלואידי והפלואידים במודל דג הזברה. בעקבות mutagenesis של דור ההורים, דור F1 יכול להיות מורם ומשמש גם ליצירת משפחות המוטציה F2 המשמשים מסך דור F3 במצב דיפלואידי (משמאל ) או ישירות מסךאד באסטרטגיה הפלואידים (מימין). במסך הפלואידים, נקבות דור F1 לבגרות מינית הם משמשים לאיסוף ציפורני F2 הפלואידים לניתוח גנטי. נשאים הטרוזיגוטיים נקבה מזוהים אם כמחצית מhaploids F2 להציג פנוטיפ מוטנטי (עוברים אדומים) בהשוואה לאחי הסוג בר הפלואידים (עוברים צהובים).
תרשים זרימת איור 2. הפלואידים עובר ייצור. השלבים העיקריים של הפריה במבחנה כדי לייצר עוברי הפלואידים הם schematized כמשימות שבוצעו ביום 1 (תיבות הוורודות) כדי להכין פתרונות זרע ומבוגר ראש נקבות, משימות שבוצעו על דג הזברה 2 (קופסות כתומות היום ) לאסוף וזרע להשבית UV, לאסוף ביצים, כדי להפרות את הביצים עם זרע UV מומת ליצור haploids, ולאחר מכן להחיות את הנקבה האם, וfinallמשימות y בוצעו בימים שלאחר מכן 3-5 (תיבה צהובה) כאשר הציפורניים מודגרת לנקודה הרצויה בזמן (ות) עבור התבוננות וניתוח.
איור 3. השוואה של עוברי דג הזברה זן דיפלואידי והפלואידים טובינגן. א) עובר סוג בר דיפלואידי יוצרו על ידי השרצה טבעית ולאחר מכן הודגרו עד כ 30 hpf. B, עובר סוג בר C) הפלואידים יוצרו על ידי הפריה חוץ גופית של ציפורניים המתקבלות מנקבות mutagenized דור F1 עם זרע מומת UV, וטופחו עד כ 30 hpf. Haploids הציג מגוון רחב של הפרעות בהתפתחות בהשוואה לעוברי דיפלואידי סוג בר (ראשי חץ שחורים, ד כדי לציין דיפלואידי). היה לי haploids הנורמלי יחסית קיצרתי, הגוף של המניה יותר דומה לתכנית לדירוג של15 הפלואידים (ראשי חץ אדומים, שכותרתו), ואילו haploids עם מומים גולמי הציג ציר קשה קטוע גוף (ראשי חץ סגולים, ב 'שכותרתו) מקביל לכיתה של ב', ולבסוף C כיתה (ראשי חץ כחולים, C שכותרתו) המבוסס על תיאורים שפורסמו 15. כל העוברים צולמו בשידור חי בהגדלת 2.5x.
איור 4. דפוסים התפתחותית של סוגי תאים המרכיבים את האיברים כליות עובריים הכליה ראשית בדג זברת מתח טובינגן הפלואידים. סוגים הפלואידים פראיים מוצג דפוס נורמלי של סוגי תאים במבנה העוברי הכליות (שורה העליונה). הכליה העוברית מורכבת של זוג יחידות תפקודיות מפולחות הידועה בשם nephrons. הדפוס המפולח של סוגי תאים בדידים הווה בnephrons ניתן דמיינו מבוסס על ההר השלם
Discussion
הקרנת הפלואידים היא טכניקה שימושית כדי לגלות גנים חיוניים הנדרשים לשלבים התפתחות מוקדמים. יתר על כן, culturing של תאים הפלואידים מדגי medaka נעשה שימוש כדי לבודד את שורות תאים כמו ES שיש מחקר יישומים רבים ופוטנציאל, הוכחת כי תאים הפלואידים עשויים לספק מקום בעתיד בעל ערך עבור סוגים אחרים של מחקרים גנטיים חוליות 20,21. פרוטוקול זה מספק הדגמה של השיטות מעורבות עם ביצוע הייצור של עוברי דג הזברה הפלואידים באמצעות הפריה חוץ גופית עם זרע UV מומת. מתודולוגיה זו ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי קדימה הפלואידים עם דגי F1 mutagenized, אשר יכול להתבצע באמצעות סוג בר, מהונדס או זנים מוטנטים להקרנה משפר / מדכאת.
למרות זמן ההקרנה משתמש באסטרטגית הפלואידים הוא במידה רבה מתקצר בהשוואה להקרנת דיפלואידי, זה בכל זאת לקחת כמה חודשים כדי להשלים. כפי שאנו descriהמיטה בעבר, יש יתרונות רבים שקיימות על ידי ביצוע מסך באמצעות סכימה הפלואידים, כל מה שיכול לסייע בקבלת תרומות חדשניות לידע הנוכחי על כל מספר של אירועים התפתחותיים. המתודולוגיה מסך הפלואידים היא יעילה יותר לזיהוי אללים מוטציה רצסיבית ממסכים מבוססי דיפלואידי בשל ההפחתה של זמן, המרחב, ואת מספר הדגים שיש צורך. עם זאת, ישנם מספר החסרונות למסך הפלואידים. מסך הפלואידים יכול רק לזהות מוטציות בגנים הפועלים בתחומי הימים הראשונים של פיתוח, כעובר יכול לשרוד רק לזמן מוגבל עם הגנום הפלואידים. הגנים שבאים לידי ביטוי מאוחר יותר בפיתוח הייתם צריכים להיות מזוהים על ידי שיטה אחרת, כגון מסך דיפלואידי. כמו כן, כמה איברים לא מתפתחים כראוי באורגניזם הפלואידים. יתכנו מומים אנטומיים, או שעתי עיכוב של פיתוח, שעלול לגרום למוטציה להיות על ידי טכניקת ההקרנה הפלואידים שלא נענתה. אניבנוסף n, כמה זנים של דגים לא מתפתחים, כמו גם במצב הפלואידים 15. ניתן לסווג Haploids על ידי סדרה לדירוג של תכונות עובריים טובות, בינוניות וגרועות, עם עוברים להיות הכי הנורמלי, B לייעד עובר עם מומים בציר אבל ראש צלול וזנב, ו-C / D לייעד עובר עם הכר תכונות (המונים של תאים על גבי כדורי חלמון) 15,17. הפרופורציות של עוברים בתוך קטגוריות אלה משתנות בהתאם לזן דג הזברה, עם מספרים מוגברים של haploids איכות טובה יותר שכיח יותר ברקע גנטי מסוים 15,17. בשל גורמים אלה, יש צורך למצוא את מתח נכון של דג הזברה לבצע mutagenesis וצלבים שלאחר מכן. בניסיון האחרון שלנו, את מתח טובינגן סוג בר הפיק haploids קיימא לסינון (כפי שמוצג באיורים 3 ו 4) אם כי חוקרים היסטורי דג הזברה יש ניצלו את AB או AB * הזנים לexperim הפלואידיםentation 15.
בנוסף לאתגרים הנ"ל, לא כל נקבות דג הזברה מבוגר דרוכים תפיק מצמד על ביצוע טכניקת הסחיטה. לדוגמא, בעבודה עם נקבות זן טובינגן mutagenized-ENU, כמחצית מכל הנשים המיוצרת על מצמד לוחץ, ואיזה חלק מהם (בדרך כלל 10-30%) היה באיכות ירודה או עובר לא יכול להיות מופרה. לכן, כדי לבצע מסך הפלואידים אחד חייב לתכנן להעלות דגים לפחות פעמיים לפי צורך להקרין את המספר הרצוי של הגנום (כל נקבה מייצגת גנום אחד הוקרן). ללא קשר לשיקול זה, את היתרונות של שיטת הפלואידים של הקרנה כדי לכסות מספר גדול של גנומים ללא מתקן בעלי חיים מאסיבי הם אכן די משמעותיים אם assay הוא נוח למדינה הפלואידים. עם זאת, זה צריך להיות גם ציין כי המחקר נוסף של המוטציה (ים) שזוהה במצמד הפלואידים הוא סומך באופן מלא על גיוס בהצלחהoutcross n מהנשי המייסד. כמו בכל מסך, 'פוגע' בתחילה זוהה במהלך תהליך המיון חייב להיות מחדש שזוהה במצב דיפלואידי.
למרות החסרונות של שימוש במסך הפלואידים, זה הוכיח להיות מוצלח מאוד בזיהוי מוטציות, שכבר ניתחו לעומק עם רווחי תובנה התחום המדעי 15. יכולים להיות מיושמים במסכים הפלואידים כדי לחקור תהליכים הבינו היטב אחרים של התפתחות חוליות. שימוש haploids למסכים משפר ומדכאים הוא אחת דרכים להשיג תובנה רבה יותר על הפעילויות ורשת רגולציה של גן של עניין. גם טכניקת הקרנת הפלואידים יכולה לשמש כדי לזהות משפרי ומדכאים של מוטציות שכבר מבודדים על ידי שיטות כגון mutagenesis כימי או insertional או להפוך גנטיקה גישות כמו עיבוד הקרקע או TALENs. בקיצור, המוטציה מבודדת בעבר ניתן mutagenized עם ENU והוקרנה למשפרים או suppressors של פנוטיפ מוטנטי המקורי. המוטציה חייבת להיות מסוגל להגיע לשלבים בוגרים, ולכן יש צורך להיות בעלי חיים הטרוזיגוטיים או דגים מוטנטים הומוזיגוטים חלשים לבצע מסך זה, עם זאת ההתקדמות בtransgenesis אפשרה לחוקרים לעקוף את הבעיה הזו. ללמוד איך לתפעל מסלולים בפיתוח יכול להוביל להרבה אפשרויות מרגשים כולל האפשרות של מסלולים מביכים לטיפול במצבי מחלה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון לRAW מבין האפשרויות הבאות: מענקי NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מצעד הפרוטות בזיל אוקונור Starter Scholar פרס # 5-FY12-75; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעי ביולוגיה; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת הנוטר דאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם על המסירות יוצאת דופן שלהם בטיפול וברווחה של המושבה דג הזברה שלנו. אנו מודים GF גרלך ללקיחת התמונות הניתנות באיור 4. לבסוף, אנו מודים לכל החברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, הדיונים וinsigHTS על עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
References
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al.
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genetics. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , Humana Press. (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
