Abstract
제브라 피쉬는 과학적 연구의 많은 분야와 관련이 주류 척추의 모델이되고 있습니다. 낭 배기에서 기본적인 실체와 기관 형성에 이르기까지 이벤트의 직접 관찰을 가능하게 특성의 별자리 - 제브라 피쉬는 특히 잘 인해 외부 수정, 태아의 크기, 빠른 개체 발생, 광학 선명도에 발달 과정의 앞으로 유전자 분석에 적합합니다. 또한, 제브라 피쉬 배아는 반수체 상태로 몇 일 동안 살아남을 수 있습니다. 먼저 세대 부모 (P) 세대에서 돌연변이 유발을 다음 (F1) 여성 사업자에 존재하는 열성 돌연변이 대립 유전자의 식별을 가능으로 체외에서 반수체 배아의 생산은, 돌연변이 분석을위한 강력한 도구입니다. 이 방법은, 따라서 감소와 함께 연구자의 시간을 절약, 여러 세대의 돌연변이 가족의 번식을 포함한다 (등 F2, F3 등) 인상의 필요성을 제거제브라 피쉬의 식민지 공간, 노동, 및 사육 비용을 필요로한다. 제브라 피쉬가 지난 수십 년 스크린 순방향 수행하기 위해 사용되었지만, 형질 전환 및 게놈 편집 도구의 꾸준한 확장되고있다. 이 도구는 이제 더 이상 척추 동물의 개체 발생 드라이브 유전자 조절 네트워크를 해부하는 데 사용할 수있는 차세대 스크린의 미묘한 분석을 만들 수있는 방법의 과다를 제공합니다. 여기, 우리는 반수체 제브라 피쉬 배아를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 초기 배아 단계에서 형성 프로세스 및 조직의 넓은 번호를 개발의 메커니즘을 해결하기 위해, 이러한 증강과 억제 화면에서와 같이 새로운 미래 반수체 스크린에 구현 될 수있다.
Introduction
척추 동물의 개발을 조율 기본적인 프로세스는 크게 1 보존됩니다. 개발에 필수적인 역할과 유전자를 식별 할 수있는 강력한 방법은 그 과정에서 표현형 결함으로 이어질 유전성 돌연변이를 분리하는 것이다. 제브라 피쉬, 다니오 rerio는 지난 수십 년 2 이상의 척추 발달 유전학을위한 널리 사용되는 모델 생물이 된 Cyprinidae 물고기 가족에 속하는 작은 민물 경골 종입니다. Zebrafish의 계란은 수정 3의 시작에서 수정란에 대한 액세스를 허용, 외부에서 수정 된 있습니다. 또한, 초기 배아 간단한 실체 3과 발달의 시각화를 가능하게 광학적으로 투명하다. Zebrafish의 개체 발생은 분열, 낭 배기, 크게 개발 3의 첫 번째 날에 완료 등 심장과 신장 등 많은 구조의 기관 형성의 과정과, 빠른입니다. 티그는 성적 성숙에 애벌레 단계에서 시간이 2~3개월 소요되며, 성인의 길이는 약 3 ~ 4 cm의 많은 물고기가 최소한의 공간이 유지 될 수있는 작은 척추 동물이다. 또한, 제브라 피쉬의 성인은 일주일에 2 당 수백 개의 배아를 생산할 수있는 각 물고기, 높은 생산력이있다. 이러한 특성은 순방향 제브라 피쉬의 온순함을 렌더링 및 유전 화면을 반대했다. 제브라 피쉬는 해부학, 세포 생물학, 포유류 2,4와 같은 더 진보 된 척추 동물 종의 생리에 보존의 높은 수준을 가지고 있습니다. 사실, 최근의 서열 분석은 제브라 피쉬의 게놈은 인간 유전자 5의 거의 70 %에 상동이 포함되어 있음을 보여 주었다. 이 보존 배아와 성인 조건 2,4를 모두 포함하여 수많은 인간 질병 모델로 제브라 피쉬를 사용하는 연구원을 가능하게했다. 이와 함께, 이러한 요인은 유전자를 식별하기위한 스크린을위한 우수한 시스템은 제브라 피쉬 만든정상적인 척추 동물의 개체 발생에 필수적인.
대형 스크린의 수는 제브라 피쉬에서 실시 된 발달 유전자 6-8에서 수천 개의 돌연변이를 발견했습니다. 제브라 피쉬의 성인 남성은 돌연변이 유발 의무이며, 염색체 변화는 화학 물질의 돌연변이의 ethylnitrosourea (ENU) 6,7 또는 레트로 바이러스 insertional 돌연변이 유발 9를 사용하여 상대적으로 높은 주파수를 생성 할 수 있습니다. 현재까지 9,000 유전 돌연변이 생성 및 배아의 거의 모든 측면에 영향을 미치는 유전자를 포함하고 있습니다. 제브라 피쉬의 사회는 세계 각국에서 약 5,000 돌연변이와 유전자 변형 대립 유전자를 수집 한 Zebrafish의 국제 자원 센터 (또는 ZIRC) 10 일에이 돌연변이 체의 중앙 은행을 설립했다. 이러한 돌연변이의 대부분은 분석 및 생물 분야에 걸쳐 NUMERO 떨어져 애타게하는 데 사용 된 중요한 정보를 연구자를 제공, 복제 된제브라 피쉬의 실험으로 발생하는 통찰력을 통해 우리 세포의 생리 학적 경로.
앞으로 화면이 중요한 유전자의 인상적인 번호를 확인했지만, 많은 프로세스의 무수한을 중재 유전자 규제 네트워크에 대한 이해 될 아직. 지금까지 수행 많은 스크린은 포화에 도달하지 않은, 따라서 앞으로뿐만 아니라 역 유전 화면은 배아 발생의 메커니즘을 파악하고 분석 할 수있는 초석이 남아있다. 단일 zebrafish의 돌연변이 라인에서 수집 할 수있는 엄청난 통찰력이 있지만, 현장의 주요 제한 요소는 역사적으로 위치 복제에 필요한 시간이 소요되는 노력을하고있다. 이러한 이유로, 많은 화학적으로 유도 된 돌연변이의 신원은 신비에 남아있다. 그러나, 빠른 복제 11-14을 용이하게 전체 게놈 시퀀싱 방법의 최근 출현으로, 유전자 변이의 매우 효율적인 식별 이제 철입니다asible.
제브라 피쉬의 원형 앞으로 화면 (그림 1, 열을 왼쪽) 세 세대 6,7 내 열성 돌연변이를 식별 할 수있는 이배체 화면입니다. 이 기술은 부모 (P) 남성의 생식 세포에서 생성하는 돌연변이를 포함하고 야생 형 여성과 남성이 짝짓기. 이 짝짓기에서 첫 번째 세대 (F1) 자손의 각 변이 아버지의 게놈의 염색체 기여로 인해 하나 이상의 독특한 변이를 항구 것입니다. F1 자손가 발생하고 F2 가족을 만들 수있는 야생 유형 outcrossed됩니다. F2의 가족, 형제 자매는 야생형 또는 이형 사업자가 될 것이며, 그 표현형 (들)에 대한 분석 F3 클러치를 생성하기 위해 무작위로 incrossed됩니다. 이형 사업자의 F3 클러치는 25 % 야생형, 50 % 이형, 25 % 동형 접합 돌연변이 물고기를 포함합니다. 이 다중 세대 검사 스키마는하지만,이 하나의 주요 단점 효과적이다pproach 화면을 준비하기 위해 필요한 시간을 포함한다 : 각 세대는 성적 성숙에 도달 3 개월 주위에 필요로하기 때문에 혼자 물고기 사육의 적어도 1 년, 참여하고있다. 이배체 화면의 이러한 유형의 다른 제한은 작업 공간, 주거 비용이 세대입니다.
반수체 화면 유사한 돌연변이 전략 (15) (도 1, 오른쪽 칼럼)를 사용하여 열성 돌연변이를 확인하고이어서 분리하는 데 사용될 수있는 하나의 대안이다. 반수체 제브라 피쉬 배아의 생산은 처음 30 년 전 16 설명하고, 반수체 염색체 배수체와 함께 며칠 동안 개발하기 위해 일반적으로 이배체 제브라 피쉬의 능력이 시간 이후 수많은 유전자 연구에 활용되고 있습니다. 반수체 화면의 주요 이점은이 방법은 열성 돌연변이 대립 형질을 선별하기 위해 F2 가족을 높이는 포함하지 않습니다. 대신, F1 세대 암컷에 대해 평가된다반수체 상태에서 자신의 F2 자손 (그림 1, 오른쪽 열)을 검사하여 그 과정에서 열성 돌연변이의 이형. 전반적으로, 반수체 배아를 획득하는 단계 (그림 2) 상대적으로 간단합니다. 뱃속에서 (또는 "짜") 계란을 돌출하기 위해 정자의 처리에 필요한 솔루션의 준비를 한 후, 계란은 수동 조작에 의해 F1 세대의 여성에서 얻을 수 있습니다. 계란이 획득되면, 그들은 자외선 (UV) 불 활성화 정자에 노출에 의해 체외에서 수정 된 있습니다. UV 불 활성화 정자 인해 단파장 UV가 아버지 DNA를 가교 결합한다는 사실을 알 가능한 DNA에 기여하는 능력이다. 그러나, 정자는 난자 여전히 활동하고 접합체 개발과 관련된 이벤트를 트리거링 할 수있다. 신진 대사 활성화되면, 계란 세포의 감수 분열 II를 완료하고, 각 chromoso 만 한 모체 입금 사본을 개발하기 위해 진행됩니다나. 그것은 어머니의 염색체에 존재하는 경우이 때문에 1N의 배수체의 배아는 열성 돌연변이 대립 유전자의 개발 결과에 따라 달라질 수 있습니다. 어머니가 완전히 침투 열성 대립 유전자의 이형 캐리어 경우 따라서 각 F2 반수체 클러치는 50 % 야생형 50 % 돌연변이 배아를 포함합니다. 배아 유전자형이 분포는 그 돌연변이 표현형 (들)의 존재에 대한 클러치를 평가 측면에서 상대적으로 쉽게 할 수 있습니다. 이러한 표현형이 감지되면, F1 세대 여성 창업자는 이후 더 이형 캐리어를 만들고 인상 야생형 남성 제브라 피쉬에 outcrossed된다. 이 화면을 수행하기 위해 여러 세대를 올릴 필요가 없기 때문에, 연구원은 상당한 시간, 노동 및 수족관 공간을 절약하지만, 여전히 조사 F1 암컷의 수에 따라 게놈의 상당한 수를 조사하는 능력을 가지고있다. 따라서, 반수체 화면 absenc에서 시작 작은 실험실이나 프로젝트 특히 실현 가능상당한 자금의 전자.
그러나 haploids의 사용에 몇 가지 제한과 단점이 있습니다. 첫째, 반수체 제브라 피쉬 배아는 몇 일 동안 살고, 일반적으로 3에서 5 사이의 일 포스트 수정 (DPF) 15 다이. 반수체 제브라 피쉬 배아는 무엇보다도 그들이 그럼에도 불구하고 체절 세그먼트 15,17의 정상적인 번호가 짧은 땅딸막 한 몸되는 가운데, 여러 가지 특성에 따라 diploids 구별 될 수있다. 개발이 진행됨에 따라, 일반적으로 2 ~ 3 DPF 및 부종 15,17에 의해 혈액 풀링과 관련된 뇌의 전시는 세포 죽음을 증가하고 혈액 순환이 좋지 않습니다. 또한, haploids 수영 방광 15,17 팽창하지 못한다. 에 관계없이 이러한 형태 학적 차이, 대부분의 주요 장기와 조직은 심장, 눈, 및 척색 15, 17를 포함하여 형성된다. 하나의 기능은 반수체 클러치에 대한 언급은 결함 배아 & #의 다양성 측면에서 표현형의 범위를 포함하는 것입니다8212; 기능은 제브라 피쉬의 변종에 걸쳐 관찰했다. 조직 (들)와 그 시점은 야생형 반수체 변형에 합리적으로 정상적인 발달을 보여주는 경우에 따라서, 하나는 확인해야하기 때문에 화면 또는 다른 연구 프로젝트에 유전 적 결함에 대해 평가 될 가능성이있다.
이러한 문제에도 불구하고, 반수체 화면은 제브라 피쉬의 초기 개발 과정에 필요한 유전자를 확인하기 위해 성공적으로 구현되었으며, 반수체 프로토콜은 물론 몇 년 15-19를위한 지역 사회 자원을 설립되었습니다. 최근 반수체 물고기 배아를 생성하는 과정은 반수체 배아 줄기 송사리 (20, 21)에서 (ES) 세포 배양을 만드는 연구자들에 의해 사용되어왔다. 체외에서 송사리 반수체 배아의 생산 후, 배아는 반수체 세포의 순수한 클론과를 생성하는 또 다른 5~8주 다음에 약 15 주 동안 계대 배양 된 차 세포 배양을 유도하는 데 사용 된ES 세포의 특성 15-19. 물고기 반수체 ES 세포주의 생성은 척추 동물의 세포 계통에 열성 표현형 분석을위한 광범위한 미래의 약속을 보유하고, 앞으로 유전자 분석을위한 새로운 접근 방식을 나타냅니다. 따라서, 반수체 물고기 배아의 생성은 생물 의학 연구 커뮤니티에서 응용 프로그램을 성장하고있다. 이 비디오 문서 설립 프로토콜 15-19,22에 따라 UV-불 활성화 된 정자를 이용하여 체외에서 반수체 제브라 피쉬 배아의 생산과 관련된 단계의 시각적 데모를 제공합니다.
Protocol
참고 :이 프로토콜에 설명 된 제브라 피쉬 배아를 사용하기위한 절차는 노트르담 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 참고 : 다음과 같은 프로토콜이 남성의 안락사를 포함 정자 분리의 데모를 제공하지만, 정자의 성기 구멍에서 수집 할 수있는 부드러운 복부 압력과 정자 수집 (17, 18)에 대한 마이크로 모세관을 사용하여 남성 제브라 피쉬 생활 마취. 라이브 남성의 압입 한 안락사 수컷 17,18로부터 획득 될 수 정자의 동등한 양을 수집하기 위해 사용되는 여러 명의 남성을 필요로한다. 그러나 압박받은 남성은 매우 건강을 유지 및 자연 교배 또는 후속 체외 절차 17 사용할 수 있습니다. 가능하면, 선택 절차는 불필요한 물고기 희생을 최소화해야합니다.
1. 솔루션 및 Zebrafish의 결합 챔버의 준비
<올>고환의 2. 해부
- 증류수 10 ㎖에 탄산 수소 나트륨 0.35 g을 추가하여 행크의 스톡 용액 중 6 신선을 만든다. 중탄산 나트륨 분말을 용해 잘 섞는다.
- 정자의 버퍼 행크의 최종 작업 솔루션을 만들기 위해 얼음에 튜브에 다음을 결합 : 스톡 용액 100 μL와 행크스 프리믹스 I의 9.9 ML # 6.
- 잘 혼합 한 후 행크 500 μl를 나누어지는7, 얼음에 microcentrifuge 관과 장소에의 마지막 작업 솔루션을 제공합니다. 참고 : 각 500 μL 나누어지는 4 ~ 남성 제브라 피쉬의 고환에서 정자를 준비하는 데 사용됩니다.
- 각 정자 수확 4-5 남성 제브라 피쉬의 사이에 선택합니다. NOTE :이 수집, 처리, 및 약 15 반수체 클러치 거름하는 데에 이용 될 수있는 한 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 저장 될 수있는 충분한 정자를 수확한다. 실험의 규모에 따라 추가 튜브를 준비하기 위해 남성의 추가 동료를 선택합니다. 선택한 남성 제브라 피쉬가 작은 또는 고환 절제술이 불완전한 경우, 일반적으로 5 명의 남성이 필요합니다.
- 부드럽게 실온에서 약 5-6 분 동안 0.2 % tricaine 함유 접시에 물고기를 전송하는 망을 이용하여 각각의 남성을 안락사. 참고 : 남성이 사전에 절개를 시작으로 안락사되어 있는지 확인해야합니다. 일반적으로 물고기 정지 이동의 아가미와 물고기 후 몇 (2-3) 분을 기다립니다터치 반응이 더 이상 없습니다.
- 플라스틱 스푼으로 부드럽게 남성을 들고 조심스럽게 액체의 남성 건조 얼룩. 다음, 가위의 날카로운 쌍 남성의 머리를 제거하고 복부 정중선을 따라 절개를 잘라. 참고 : 물고기의 모든 물기 제거는 정자의 활성화를 트리거링을 방지하기 위해 필수적이다.
- 처분을 위해 생물 학적 용기에 미세 집게와 장소를 사용하여 복강의 창자와 관련된 창자 장기를 제거합니다.
- 실체 현미경을 볼 때 부레에 측면 등의 신체 벽을 따라 위치하는 고환을 제거하고, 흰색 불투명 한 외관을 가지고 미세 집게를 사용합니다. 참고 : 그대로 고환을 유지하는 수성 체액에 정자의 노출을 방지하는 데 도움이되므로 조기 활성화를 방지 할 수 있습니다.
- 얼음에 정자 솔루션으로 고환을 놓고 다른 고환이 해부로 얼음에 튜브를 유지. 반복은 모든 m까지 2.6-2.9 단계에일 해부되었다.
- 적절한 기관의 처분에 대한 생물 학적 용기에 시체와 나머지 동물 조직을 놓습니다.
3. UV 정자 불 활성화
- 부드럽게 멸균 마이크로 튜브 유봉과 microcentrifuge 관을 연마하여 고환을 균질화.
- 작은 페트리 접시 또는 얼음에 시계 접시에 뜨는을 전송합니다. 참고 : 상등액과 함께 조직 파편을 전송하지 마십시오. 이 그림자를 만들고 정자의 UV 불 활성화를 손상됩니다.
- 추가 행크의 최종 작업 솔루션 (2.2 단계에서 제조 및 얼음에 저장)의 300 ~ 400 사이의 μL와 정자 튜브를 씻어하고, 작은 페트리 접시에이 뜨는 세척을 추가하거나 단계 3.2 유리를 본다.
- 약 15 (38.1 cm)에서의 램프 소스로부터의 거리에 2 분의 총 벤치 램프 (254 NM)에서 UV하는 요리를 노출합니다. 참고 : UV 램프를 사용할 때주의를 사용하여 얼굴 방패를 착용다른 눈 개인 보호 장비.
- 다음 새로운 microcentrifuge 관에 UV 불 활성화 된 정자를 전송하고 얼음에 샘플을 저장, 얼음 통에 접시를 반환합니다. 참고 :이 시점에서 반수체 클러치 수정을위한 UV 불 활성화 정자의 약 800 μL가있을 것입니다. 정자는 여성을 쥐에 소요되는 시간의 전체 기간에 걸쳐 얼음에 보관해야합니다. 차가운 행크의 정자는 수정의 결과에 어떤 감소없이 최대 6 시간 동안 사용할 수 있습니다. 흥미롭게도, 다른 연구자는 차가운 행크의 정자가 몇 일 18 몇 시간에서 가능한 것을보고있다.
성인 Zebrafish의 여성과 클러치의 체외 수정에에서 4. 계란 조달
- 생선 시스템 물 80 ㎖로 0.2 % tricaine 주식의 20 ㎖를 결합하여 마취 tricaine 목욕을 준비합니다.
- TR의 접시에 부드럽게 그녀를 배치하는 그물을 사용, 달걀 컬렉션의 여성을 선택icaine.
- 여성이 마취 될 때까지 2 ~ 3 분 동안 대기하고 더 이상 터치 응답합니다. 참고 : 여성 경련 또는 다른 움직임을 유도하는 경우, 마취에 굴복하는 그녀의 추가 시간을 제공합니다.
- 부드럽게 초과 액체를 멀리 심지에 종이 타월에 여성을 배치하기 전에 솔루션을 이동시키고, 여성을 올리려면 플라스틱 숟가락을 사용합니다. 참고 : 유체가 정자의 추가 전에 계란 활성화를 트리거로, 여성에 대한 별도의 솔루션을 남기지 않도록주의하십시오.
- 깨끗한 배양 접시에있는 그녀의 슬라이드에 여성을 놓고 실체 현미경을 그녀의 배꼽을 시각화.
- 스트로크 사이에 그녀 등의 신체 벽 뒤에 다른 손에서 하나 또는 두 개의 손가락을 배치하여 여성의 등을 지원하고, 그녀의 복부에서 알을 짜내는 한 손으로에서 하나 또는 두 개의 손가락을 사용하여 약 10 ~ 20 초 동안 부드럽게 여성의 배. 주 : 여성의 복부를 쓰다듬어 후, 계란이 쉽게 나올 것이다. 계란 재치 등장하지 않는 경우H는 '세게 밀어'과 여성의 힘 계란하지 않는 것이 좋습니다 완화. 이 계란은 수정 준비가 현재 및 / 또는하지 아니라는 것을 표시하고, 계속 추진은 여성 (예를 들어, 수영 방광을 수축시키는 등 치명적인 내부 손상의 원인)을 해칠 상당한 위험과 관련이 있습니다. 여성이 짠하지만 아무도 또는 몇 계란을 제공하는 경우, 동물 시설에 여성을 반환합니다. 나머지 1 ~ 2 주 후, 잔여 계란 파편을 청소하는 자연 교배에 대한 남성과 여성의 쌍. 두 번째 스퀴즈를 시도하기 전에 휴식의 또 다른 1 ~ 2 주간 탱크로 자연스럽게 짝짓기 여성을 분리. 또한, 여성은 자연 교배 (15)에 대해 설정 될 수있는 시간 동안 사주를 위해 휴식을 할 수 있습니다.
- 여성 및 / 또는 그녀의 배꼽 표면 아래에서 계란을 특종 미세 프로브 또는 작은 주걱을 사용합니다.
- 부드럽게 여성을 들어 올려 물고기 시스템 물을 포함하는 적절하게 레이블이 분리 탱크에 그녀를 반환합니다. </ 리>
- 계란의 클러치에 UV 불 활성화 정자 솔루션의 50 μl를 추가하고있는 동안, 여성의 부모에 할당 된 번호로 추적하기 위해 요리에 대응하는 라벨을 부착 30 초 동안 실온에서 품어.
- 계란에 E3 1 ㎖를 추가하고 1 분 동안 실온에서 품어.
- 요리 중간을 채우기 위해 충분한 E3 솔루션을 추가하고 이후의 배양을 위해 28 ° C에서 배아를 놓습니다. 참고 : 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 % (V / V) 5,000 단위의 페니실린 및 ML 당 5 밀리그램의 스트렙토 마이신을 포함하는 펜 연쇄상 구균 솔루션) E3에 19 반수체 태아의 전반적인 건강에 도움을 줄 수의 추가.
5. 관측 및 반수체 배아의 취급
- 4-8 시간 후, 접시에서 미 수정 배아를 제거하고 신선한 E3 솔루션 E3 배아 매체를 대체하여 잔여 배아를 씻어. 참고 : 미 수정 배아는 흰색, 불투명 한 외관을 표시되거나 투명한를 표시 할 수 있습니다기형의 하나의 셀 ppearance.
- 그 원하는 시점까지 부화 한 다음 원하는 화면 분석 등 연구 응용 프로그램 (들)에 사용한다.
Representative Results
반수체 배아의 생산은 haploids가 돌연변이 부모의 자식 (그림 1)이다 성숙한 제브라 피쉬의 여성에서 얻을 때 F2 세대에서 열성 돌연변이를 확인하기 위해 구현 될 수있다. 이 연구원은 그 배체 자손 다음 그 표현형 (그림 1)을 평가하는 F2의 가족을 인상 할 필요가있는 전통적인 배체 화면에 비해 시간과 공간을 절약 할 수 있습니다.
프로토콜의 주요 단계는 체외 수정을 통해 반수체 제브라 피쉬 배아를 얻기 위해 위의 1-5 단계에서 설명한는 플로우 차트 (그림 2)로 도식화된다. 이 단계는 정자와 난자의 조달에 의해 체외 수정 (2 일)에 이어, 솔루션의 준비와 상대 탱크 (1 일)에 남성 호르몬에 노출 여성의 프라이밍을 포함하고, 마지막으로 haploids의 양육 (일 3-5) (그림 2). 때 COM유전 화면 bined 같은 레트로 바이러스 기반 돌연변이와 같은 또 다른 과정이 구현 될 수 있지만, 제브라 피쉬의 일반적인 돌연변이 유발 절차는 ENU 같은 화학적 돌연변이에 돌연변이 (예를 들어, 행 수컷 제브라 야생형 인원수 이전 노출을 포함하는도 ) 염색체 결함의 클로닝을 용이하게 돌연변이 된 F1 세대를 만들기 위해 야생형 암컷을 사육 하였다. 이러한 준비는 이후의 돌연변이 된 F1 15,17,22를 돌연변이 유발을 수행, 뒤 야생 유형에 필요한 생성 시간에 따라 작품의 몇 개월 (대략 6 개월)이 필요하며, 후면.
화면에 haploids을 채용에 고려해야 할 또 다른 중요한 점은 제브라 피쉬 변형의 선택입니다. AB * (AB 스타) 균주는 다른 균주 (15)보다 더 나은 전반적인 특성과 건강에 반수체 배아를 생산 잘 알려져있다. 그러나, 우리의 연구소 용에서 자란 파생 튀빙겐의 변형에토리, 우리는 최근 (출판되지 않은 G. Gerlach에서와 R. Wingert,) 신 시스템의 발달 이상에 성공적으로 화면을 활성화 학적 특징을 관찰했다. 성인 zebrafish의 튀빙겐 변형 남성은 세 ENU 치료의 일련의 돌연변이, 다음 심사 F1 세대를 생성하는 야생형 튀빙겐의 여성에 교차했다. F1 암컷은 알을 얻기 위해 압착하고, 이들 F2 계란은 UV 불 활성화 정자와 수정 된되었습니다. 야생형 튀빙겐 부모 (그림 3A)의 자연 교배하여 얻은 배체 클러치에 비해, 이러한 반수체 튀빙겐 변형 클러치의 배아는 반수체 상태의 짧은 땅딸막 한 몸통 특성 (그림 3B, C)를 표시. 또한, 반수체 클러치는 일반적으로 더 15,17 아래에 논의 된 바와 같이, 균주에 따라 다를 것으로 알려져있다 우리가 잘 관찰 결함의 범위, (그림 3B, C)를 표시 배아 형제 자매로 구성되어 있습니다. 이전 연구는 반수체 표현형 결함 15, 17의 범위를 분류하는, D를 통해 성적에 대응하는 표준 등급 시리즈를 설립하고, 추가로 haploids 또한 형용사 좋은, 중간 및 낮은 품질 (22)의 측면에서 언급되었다. A 등급 haploids는, 고품질 haploids에 해당하는 짧은 땅딸막 한 몸으로, 외관에서 가장 정상하지만, 전반적으로 반수체 학년 A (레이블에 배체 형제 (d)를 비교 (diploids 15,17,22 유사한 형태 학적 모습을 보여 A) 형제 자매, 그림 3B). 반수체 등급의 배아는 반수체 제브라 피쉬의 개발 15,17,22 (그림 3B)의 전형적인 특징이다 겸손 심낭 부종을 개발. 등급의 haploids, 중간 또는 소위 B 급 반수체 배아에 비해 (레이블 B, 3B, C 피규어) 더 단축 또는 꼬임 / twis의 개발에 의해 구별된다테드 트렁크, 머리와 꼬리의 기능을 명확히 구별 15,17,22 비록. 마지막으로, (또한 C / D와 같은 일부 참조에 나와있는) 등급 C 또는 불량 haploids는 15,17,22 매우 결함이 있으며, 노른자 볼 (레이블 C, 그림 3C)와 협회에서 세포의 조직을 파괴 질량을 표시합니다. 심지어 같은 변형 사이, 반수체 클러치 하나가 관찰됩니다 A, B 및 C의 표현형의 분포에 따라 다릅니다. 예를 들어, 하나의 튀빙겐 여성의 반수체 클러치는 그 클러치 수많은 학년 C 반수체 자손으로 구성뿐만 아니라 두 번째 튀빙겐 여성에서 얻은 haploids에 비해 대부분과 및 B 등급 반수체 자손 (그림 3B), 전체의 더 나은 발전을 표시 와 B 반수체 표현형 (그림 3C). 반수체 배아 등급의 유사 변형의 변화는 이전뿐만 아니라 15 AB와 AB * 변형 물고기에서 관찰되었다.
이러한 MOR에도 불구하고phological 차이가 많은 구조의 기관 형성은 반수체 배아에서 상대적으로 일반적으로 진행된다. 이들은 눈과 심장 야생형 배체 배아의 비교적 유사하고, 이러한 색소 세포 (melanophores 및 xanthophores)와 같은 세포 유형도 15을 평가할 수있다 같은 장기의 짧은 바디 트렁크, 개발이 있지만. 또한, 우리는 pronephros, 또는 배아 신장이 유사 야생형 diploids에, 야생형 반수체 1 일 포스트 수정에 의해 개발되어 최근 기록했다. 이 증거로, pronephros 세포 유형의 패턴은 세그먼트의 원형 패턴 (그림 4)를 표시합니다. 또한, 이러한 레티노 산의 생산을 감소 리브 돌연변이로 pronephros 개발, 변경 열성 돌연변이의 표현형은 이배체 상태에 비해 반수체 상태에서 비슷한 패턴 (그림 4) (23, 24)을 보여줍니다. 이 관찰은 다른 reces의 그것과 유지에이것은 항상 모든 돌연변이의 경우되지 않고 화면 전략 (15)의 유형을 평가하는 경우 염두에 보관해야하지만, 모두 반수체와 이배체 상태와 유사한 표현형으로 이어질 변이를 시브.
조직 및 기관의 수가 haploids 전형적 이상이다. 예를 들어, haploids는 혈관 생성의 일부 측면을 연구 할 수있는 능력 (15)를 제한 할 수 있습니다 일반적으로 혈액 풀링을 전시 순환의 결함을 표시. 또, haploids이 구조체 (15)의 형태 형성에 관여 미묘한 프로세스에 영향을 돌연변이되지 그들이 완전히 귀 소포 형성을 방지 돌연변이에 대해 평가 될 수 있도록, 귀 개발에 요철을 가질 수 있지만, 주목되었다. 이것의 또 다른 예로서, 뇌 형태 형성은 haploids 비정상이고, 따라서 필요한 뇌 발달 경로를 식별하는 반수성 스크린 15을 한정한다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리의반수체 상태에서 신장 개발 (그림 4)의 (분석)은 'screenable'배아 구조의 목록에이 기관을 추가합니다. 이 발견은 반수체 화면 방법론은 신장 전구 패턴의 유전 적 구성 요소를 해부하는 데 사용하고 독창적 인 스크린 방식은 척추 동물의 개발 (15)을 연구하는 귀중한 새로운 돌연변이 모델을 발견하는 반수체 배아 개체 발생의 제한을 회피 할 수있는 감정에 중점을 추가 할 수 있다는 것을 강조한다.
그림 1. 제브라 피쉬 모델 배체와 반수체 스크린 전략의 개략도. 부모 세대의 돌연변이 유발에 따라, F1 세대가 발생하여 사용하거나 배체 상태에서 F3 생성 화면 (왼쪽하는 데 사용되는 F2 돌연변이 가족을 생성 할 수 있습니다 ) 또는 직접 화면반수체 전략 (오른쪽)의 에드. 반수체 화면에서, 성적으로 성숙 F1 세대의 여성은 유전자 분석을위한 반수체 F2 클러치를 수집하는 데 사용됩니다. F2의 haploids의 약 절반은 야생형 반수체 형제 (노란색 배아)에 비해 돌연변이 표현형 (빨간색 배아)를 표시하는 경우 여성 이형 캐리어는 식별됩니다.
작업 정자 솔루션과 2 일 (오렌지 상자에서 수행 총리 성인 zebrafish의 여성, 작업을 준비하기 위해 1 일 (분홍색 상자)에서 수행으로 그림 2. 반수체 배아 생산 흐름도. 반수체 배아를 생산하는 체외 수정의 주요 단계를 도식화된다 )를 수집하고 자외선을 비활성화 정자, 난자를 수집하는 haploids를 생성하는 UV 불 활성화 정자와 난자를 비옥하고 여성의 어머니를 부활하고, finall에합니다Y 작업 이후의 일을 수행 3-5 클러치는 관찰과 분석을 원하는 시점 (들)에 배양 (노란색 상자).
그림 3. 배체와 반수체 튀빙겐 변형 제브라 피쉬 배아의 비교. A) 이배체 야생형 배아는 자연 산란에 의해 생산하고 약 30 HPF. B까지 배양 하였다, C) 반수체 야생형 배아는 UV 불 활성화 된 정자와 F1 세대 돌연변이 여성에서 얻은 클러치의 체외 수정에 의해 생성 때까지 배양 하였다 약 30 HPF. Haploids은 이배체 야생형 배아 (블랙 화살촉, 이배체를 나타내는 D)에 비해 개발에 이상의 범위를 나타내었다. 상대적으로 일반 haploids는 등급을 매기는 방식과 유사한 단축, 더 많은 스톡 몸을했다반수체 (15) 총 이상과 haploids은 B의 등급에 해당하는 심각하게 절단 된 신체 축 (보라색 화살촉, 라벨 B)를 전시하면서 (빨간색 화살촉, 레이블), 그리고 마지막으로 C 등급 (파란색 화살촉, 레이블 C)에 기반 출판에 대한 설명 15. 모든 배아는 2.5 배의 배율로 라이브 촬영했다.
반수체 튀빙겐 변형 제브라 피쉬의 pronephros 배아 신장 기관을 구성하는 세포 유형의 그림 4. 발달 패턴은. 반수체 야생 유형의 배아 신장의 구조 (맨 윗줄)의 세포 유형의 정상적인 패턴을 표시. 배아 신장은 네프론로 알려진 분할 기능 단위의 쌍으로 구성되어 있습니다. 네프론 존재 이산 세포 유형의 분할 패턴은 전체 마운트에 기반 시각화 될 수있다
Discussion
반수체 검사는 초기 개발 단계에 대한 필요한 필수적인 유전자를 발견 할 수있는 유용한 기술입니다. 또한, 송사리로부터 반수체 세포의 배양은 반수체 세포는 척추 동물 유전자 연구 (20, 21)의 다른 유형의 가치있는 미래의 장소를 제공 할 수 있다는 것을 보여주는 수많은 연구 어플리케이션과 잠재력을 가지고 ES 같은 세포주를 분리하는 데 사용되었다. 이 프로토콜은 UV 불 활성화 정자와 체외 수정을 통해 반수체 제브라 피쉬 배아의 생산을 수행과 관련된 방법의 데모를 제공합니다. 이 방법론은 야생형 형질 전환 또는 증강 / 억제 검사에 대한 돌연변이 균주를 사용하여 만들 수 있습니다 돌연변이 된 F1 물고기, 앞으로 반수체 화면을 수행 할 수 있습니다.
반수체 전략을 사용하여 검사 시간이 크게 배체 검사에 비해 단축되어 있지만, 그럼에도 불구하고 완료하는 데 몇 개월이 걸릴 것입니다. 우리는 descri으로이전에 침대, 발달 이벤트의 수에 대한 현재의 지식에 새로운 기여를 만드는 데 도움이 될 수 모두의 반수체 스키마를 사용하여 화면을 수행하여 존재하는 많은 혜택이 있습니다. 반수체 화면 방법론 인해 시간, 공간, 및 필요한 물고기의 수의 감소에 기반 이배체 화면보다 열성 돌연변이 대립 유전자 식별을 위해 더 효율적이다. 그러나, 반수체 화면에 몇 가지 함정이있다. 배아는 반수체 게놈으로 제한된 시간 동안 생존 수 반수체 화면에는, 발전의 처음 며칠 이내에 활성 유전자에 돌연변이를 확인할 수있다. 나중에 개발에서 발현되는 유전자는 이배체 화면 같은 다른 방법으로 식별 될 필요가있을 것이다. 또한, 일부 기관은 반수체 유기체에서 제대로 개발하지 않습니다. 돌연변이가 반수체 검사 기술에 의해 누락 될 수 있습니다 해부학 적 이상, 또는 개발의 지연 시간이있을 수 있습니다. 나는N 추가, 물고기의 일부 변종은 반수체 상태 (15)에뿐만 아니라 개발하지 않습니다. Haploids는 배아 축에 결함이 배아를 지정하는 가장 일반적인, B되는, 좋은 중간 가난한 배아 기능의 등급을 매기는 시리즈로 분류 될 수 있지만 분명 머리와 꼬리, 그리고 C / D가 인식 할 수없는과 배아를 지정하는 기능 (노른자 공 꼭대기 세포의 질량) 15, 17. 이러한 범주 내에서 배아의 비율은 특정 유전 적 배경 15,17에서 더 널리 더 나은 품질의 haploids의 증가 숫자, 제브라 피쉬의 변형에 따라 달라집니다. 이러한 요인으로 인해, 그것은 돌연변이 유발 및 후속 교차를 수행하는 제브라 피쉬의 적절한 변형을 찾을 필요가있다. 우리의 최근 경험에 의하면, 야생형 튀빙겐 균주를 선별 가능한 haploids 생산 (그림 3과 같이 4) 역사적으로 제브라 피쉬 연구진은 반수체 experim의 AB 또는 AB * 변종을 사용했다하더라도[슬라이드 쇼 15.
이러한 전술 한 문제점에 더하여, 모든 프라이머 성인 지브라 피쉬 암컷 압착 기법을 수행 할 때 클러치를 생성 할 것이다. 예를 들어, ENU-돌연변이 튀빙겐 스트레인 여성과 함께 일하는 모든 여성의 약 절반 압박시에 클러치를 생산하고, 이들 중 일부 비율 (일반적으로 30 %)가 가난한 배아의 질 않았거나 수정 된 할 수 없습니다. 따라서, 반수체 화면을 수행하는 하나의 게놈의 원하는 번호를 (각 여성이 하나의 게놈 검사를 나타냄) 화면을 필요에 따라 두 배 이상 많은 물고기를 높이기 위해 계획해야합니다. 분석은 반수체 상태로 의무가있는 경우에 관계없이이 고려, 대규모 동물 시설없이 게놈의 큰 숫자를 충당하기 위해 심사의 반수체 방법의 장점은 참으로 매우 중요합니다. 그러나, 그것은 또한 반수체 클러치에서 식별 돌연변이 (들)의 추가 연구가 성공적 기모에 완전히 의존하고 있음에 유의해야한다여성의 설립자 N의 교배. 모든 화면에서와 같이, 배체 상태를 다시 확인해야합니다 초기 심사 과정에서 확인 된 '히트'.
반수체 화면을 사용하는 함정에도 불구하고, 과학 분야 15 통찰력 이익과 깊이 분석 된 돌연변이 체를 식별하는 매우 성공적인 것으로 나타났습니다. 반수체 화면 척추 개발의 다른 불완전하게 이해 과정을 조사하기 위해 구현 될 수있다. 증강과 억제 화면에 haploids를 사용하여 활동과 관심의 유전자의 규제 네트워크에 더 많은 통찰력을 얻을 수있는 하나의 방법입니다. 반수체 스크리닝 기술은 또한 인핸서와 이미 화학적 또는 insertional 돌연변이 유발과 같은 방법에 의해 분리 또는 역 유전학 경운 또는 TALENs 같은 접근 된 돌연변이 체의 억제제를 식별하는 데 사용될 수있다. 즉, 이전에 고립 ENU 돌연변이로 돌연변이 될 수 있고 인핸서 또는 S 스크리닝원래 돌연변이 표현형의 uppressors. 돌연변이는 성숙한 단계에 도달 할 수 있어야한다, 그래서 그것은 그러나 형질 전환의 최근 발전은 연구자들이이 문제를 둘러싼 할 수있다,이 화면을 수행하기 위해 이형 동물이나 약한 동형 접합 돌연변이 물고기를해야 할 필요가있다. 개발 경로를 조작하는 방법을 배우는 것은 질병 상태를 치료하기가 혼란 경로의 전망 등 많은 흥미로운 가능성으로 이어질 수 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 다음에서 RAW로 자금에 의해 지원되었다 : NIH 보조금 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237; 천 바질 오코너 초보 학술 수상 # 5 - 2012 년 - 75 년 3 월; 과학 및 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작; 그리고 갤러거 가족 대신에 엘리자베스와 마이클 갤러거의 노트르담 대학에 관대 한 선물은 줄기 세포 연구를 육성한다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다. 우리는 그들의 지원을 위해 생명 과학학과의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호와 복지에 탁월한 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 우리는 그림 4에서 제공하는 사진을 촬영하기 위해 GF Gerlach에서 감사합니다. 마지막으로, 우리는 자신의 의견, 토론과 insig에 대한 우리의 연구 실험실의 모든 구성원을 감사이 작품에 대한 HTS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
References
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