Abstract
Den zebrafisk har blivit en mainstream ryggradsdjur modell som är relevant för många discipliner av vetenskaplig studie. Zebrafisk är särskilt väl lämpade för fram genetisk analys av utvecklingsprocesser på grund av sin yttre befruktning, embryonal storlek, snabba ontogeni och optisk klarhet - en konstellation av egenskaper som gör det möjligt att direkt observation av händelserna från gastrulation till organogenesen med ett grundläggande stereomikroskop. Vidare kan zebrafiskembryon överleva i flera dagar i den haploida tillstånd. Produktionen av haploida embryon in vitro är ett kraftfullt verktyg för mutationsanalys, eftersom den gör det möjligt att identifiera recessiva muterade alleler närvarande i första generationen (F1) kvinnliga bärare efter mutagenes i föräldra (P) generation. Detta tillvägagångssätt eliminerar nödvändigheten att höja flera generationer (F2, F3, etc.) som innefattar odling av mutant familjer, vilket sparar forskaren tid tillsammans med att minskabehoven av zebrafisk koloni utrymme, arbetskraft, och djurhållningskostnader. Även om zebrafisk har använts för att genomföra fram skärmar för de senaste decennierna har det skett en stadig ökning av transgena och genomredigeringsverktyg. Dessa verktyg erbjuder nu en uppsjö av sätt att skapa nyanserade analyser för nästa generations skärmar som kan användas för att ytterligare dissekera genreglerande nätverk som driver ryggradsdjur ontogenin. Här beskriver vi hur man förbereder haploida zebrafisk embryon. Detta protokoll kan implementeras för nya framtida haploida skärmar, t.ex. i förstärkare och suppressor skärmar, för att ta itu med de mekanismer för utvecklingen för ett brett antal processer och vävnader som bildas under tidiga embryonala stadier.
Introduction
De fundamentala processer som orkestrera ryggradsdjur utveckling är i stort sett bevarad 1. Ett kraftfullt sätt att identifiera gener med viktiga roller i utvecklingen är att isolera ärftliga mutationer som leder till fenotypiska brister i processen för intresset. Den zebrafisk, Danio rerio, är en liten sötvattens teleost arter som tillhör Cyprinidae fisk familj som har blivit en allmänt använd modell organism för ryggradsdjur utvecklingsgenetik under de senaste decennierna 2. Zebrafisk ägg befruktas externt, ger tillträde till zygoten från uppkomsten av befruktning 3. Vidare är det tidiga embryot optiskt transparent, vilket möjliggör visualisering av utveckling med ett enkelt stereomikroskop 3. Zebrafisk ontogeny är snabb, med processerna för klyvning, gastrulation och organogenesen av många strukturer, såsom hjärtat och njurarna, i stort sett genomförda under den första dagen av utveckling 3. Than tid från larvstadier till sexuell mognad tar 2-3 månader, och de vuxna är små ryggradsdjur ca 3-4 cm i längd, kan så många fiskar upprätthållas i minimalt utrymme 2. Dessutom, zebrafisk vuxna har hög fruktsamhet, med varje fisk kan producera flera hundra embryon per vecka 2. Dessa attribut har gjort att spårbarhet av zebrafisk för framåt och bakåt genetiska skärmar. Zebrafisk har en hög grad av bevarande i deras anatomi, cellbiologi och fysiologi med mer avancerade ryggradsdjur som däggdjur 2,4. I själva verket har nyligen sekvensanalys visade att zebrafisk genomet innehåller homologer till nästan 70% av mänskliga gener 5. Detta bevarande har möjlig forskare att använda zebrafisk som modell för många mänskliga sjukdomar, inklusive både embryonala och vuxna förhållanden 2,4. Sammantaget har dessa faktorer gjort zebrafisk ett utmärkt system för skärmar syftar till att identifiera gener som ärviktiga för normal ryggradsdjur ontogeni.
Ett antal storskaliga skärmar har genomförts i zebrafisk och har identifierat flera tusen mutationer i utvecklingsgener 6-8. Den zebrafisk vuxen man är mottaglig för mutagenes, och kromosomförändringar kan genereras med relativt hög frekvens med hjälp av kemisk mutagen etylnitrosourea (ENU) 6,7 eller retroviral insertionsmutationer 9. Hittills har över 9000 ärftliga mutationer skapats, och inkluderar gener som påverkar så gott som alla aspekter av embryogenes. Den zebrafisk samfundet har upprättat en central bank av dessa mutanter på Zebrafish International Resource Center (eller Zirc) 10, som har samlat cirka 5.000 muterade och transgena alleler från hela världen. Många av dessa mutationer har analyserats och klonats, vilket ger forskare över biologiska discipliner värdefull information som har använts för att retas isär numerous cellulära och fysiologiska vägar genom de insikter ursprung med zebrafisk experiment.
Även termins skärmar har identifierat ett imponerande antal viktiga gener, har mycket ännu att uppskattas om de genetiska regulatoriska nätverk som förmedlar en myriad av processer. Många skärmar som genomförts hittills har inte nått mättnad, och därmed framåt samt omvända genetiska skärmar har varit en hörnsten för att identifiera och analysera mekanismer för embryogenes. Även om det finns enorma insikter som kan utläsa från någon enskild zebrafisk mutant linje, har en viktig begränsande faktor inom området historiskt varit tidskrävande insats som krävs i positionell kloning. Därför har identiteten på många kemiskt inducerade mutationer förblev ett mysterium. Men med den senaste tillkomsten av hela genom sekvensering metoder som underlättar snabb kloning 11-14, är nu fe oerhört effektiv identifiering av genetiska mutationerasible.
Den prototypiska fram skärmen i zebrafisk är en diploid skärm som kan identifiera recessiva mutationer inom tre generationer 6,7 (fig 1, vänstra kolumnen). Denna teknik innebär att generera mutationer i mänskliga könsceller föräldra (P) hane, och sedan para denna hane med en vild typ hona. Var och en av den första generationen (F1) avkomma från denna parning kommer att härbärgera en eller flera unika mutationer på grund av de kromosomala bidragen av den muterade paternal genomet. F1 avkomman höjs och utparade med vilda typer för att skapa F2 familjer. I F2-familjen, kommer syskon antingen vildtyp eller heterozygota bärare, och är incrossed slumpmässigt generera F3 kopplingar som analyseras för fenotyp (er) av intresse. De F3 kopplingar av heterozygota bärare kommer att innehålla 25% vild typ, 50% heterozygot, och 25% homozygot mutant fiskar. Denna flera generationer screening schema är effektivt, men en stor nackdel med detta enILLVÄGAGÅNGSSÄTT omfattar den tid som krävs för att förbereda sig för skärmen: minst 1 år av enbart fiskhållningen är inblandad, eftersom varje generation kräver ca 3 månader för att bli könsmogna. Andra begränsningar av denna typ av diploida skärmen är arbetet, utrymme och kostnader för bostäder dessa generationer.
Den haploida skärmen är ett alternativ som kan användas för att identifiera och därefter isolera recessiva mutationer med användning av liknande mutagenesstrategierna 15 (fig 1, högra kolumnen). Produktionen av haploida zebrafiskembryon beskrevs först över 30 år sedan 16, och förmågan hos den normalt diploid zebrafisk utvecklas under flera dagar med en haploid kromosom ploiditet har utnyttjats för ett flertal genetiska studier, eftersom denna tid. Den största fördelen med den haploida skärmen är att metoden inte innebär att lyfta F2 familjer för att screena för recessiva muterade alleler. Istället är F1-generationen honor utvärderas förheterozygositet av recessiva mutationer i processen för intresse genom att granska deras F2 avkomma i en haploid tillstånd (Figur 1, höger kolumn). Sammantaget stegen för att upphandla haploida embryon är relativt enkelt (Figur 2). Efter beredning av nödvändiga lösningar för hantering spermier, är ägg från F1-generationens hondjur av manuell manipulation för att pressa (eller "squeeze") äggen från magen. När äggen erhålles, är de befruktade in vitro genom exponering för ultraviolett (UV)-inaktiv spermier. UV-inaktiverat spermie är oförmögna att bidra livsduglig DNA till ägg beroende på det faktum att den korta våglängd UV-tvärbinder paternal DNA. Men spermierna fortfarande kan utlösa ägg aktivitet och händelser i samband med zygotisk utveckling. När metabolisk aktivering, kommer ägget slutföra meios II, och fortsätta att utvecklas med endast den matern deponerade kopia av varje chromosomig. På grund av detta 1 N ploidi, är embryot omfattas av utvecklings konsekvenserna av en recessiv mutant allel, om den finns på en maternal kromosom. Varje F2 haploid koppling kommer alltså att innehålla 50% vildtyp och 50% muterade embryon om modern är en heterozygot bärare av ett helt penetrant recessiv allel. Denna fördelning av embryonala genotyper möjliggör relativt lätt när det gäller att utvärdera kopplingen för närvaron av mutantfenotypen (er) av intresse. Om en sådan fenotyp upptäcks F1-generationen kvinnliga grundare senare utparade till vildtyp manliga zebrafisk för att skapa och höja fler heterozygota bärare. Eftersom det inte är nödvändigt att ta upp flera generationer för att utföra på skärmen, kan forskaren spara mycket tid, arbete och akvarium utrymme, men fortfarande har makt att överblicka ett stort antal av genom baserat på antalet F1-hondjur undersökas. Således haploida skärmar är speciellt möjligt för små laboratorier eller projekt som initieras i absence av betydande finansiering.
Emellertid finns det flera begränsningar och nackdelar med användningen av haploider. Först haploida zebrafisk embryon lever endast några dagar, och oftast dör mellan 3 och 5 dagar efter befruktningen (DPF) 15. Haploid zebrafisk embryon kan skiljas från diploider baserade på flera egenskaper, främst bland dem är en kort och tjock kropp som ändå har det normala antalet somit segment 15,17. Som utvecklingen fortskrider, hjärnan uppvisar ökad celldöd och cirkulationen är dålig, vanligen i samband med blod sammanslagning med 2-3 dpf och ödem 15,17. Vidare haploider misslyckas med att blåsa upp en simblåsa 15,17. Oavsett dessa morfologiska skillnader, är de flesta stora organ och vävnader bildas, inklusive hjärta, öga, och notochord 15,17. Ett inslag noteras om haploida kopplingar är att de innehåller en rad olika fenotyper vad gäller sorter av defekta embryon & #8212; en funktion observeras över zebrafiskstammar. Därför bör man kontrollera om vävnaden (s) och tids sevärdhet visar någorlunda normal utveckling i det vilda typen haploida stammen och har därför potential att utvärderas för genetiska defekter i en skärm eller annan forskningsprojekt.
Trots dessa utmaningar har haploida skärmar genomförts framgångsrikt för att identifiera gener som behövs för tidiga utvecklingsprocesser i zebrafisk, och haploida protokoll har väl etablerade resurser i samhället i många år 15-19 år. På senare tid har processen att skapa haploida fiskembryon använts av forskare för att skapa haploid embryonala stamceller (ES) cellkulturer från medaka fisk 20,21. Efter framställning av medaka haploida embryon in vitro, var embryona för att härleda primära cellkulturer som passerades under ca 15 veckor, följt av ytterligare 5-8 veckor för att generera rena kloner av haploida celler medES-cellegenskaper 15-19 år. Den generation av fisk haploida ES cellinjer har bred framtidslöfte för analys av recessiva fenotyper i ryggradsdjur cellinjer, och representerar en ny metod för genetisk analys under de kommande åren. Sålunda har alstringen av haploida fiskembryon växande tillämpningar inom det biomedicinska forskningssamhället. Denna video artikeln ger en visuell demonstration av stegen med att producera haploida zebrafisk embryon in vitro med hjälp av UV-inaktiv sperma utifrån fastställda protokoll 15-19,22.
Protocol
OBS: De rutiner för att arbeta med zebrafisk embryon som beskrivs i detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Notre Dame. OBS: Även om följande protokoll ger en demonstration av spermier isolering som innebär eutanasi av män, spermier kan samla in från underlivet por i sövda levande manlig zebrafisk med hjälp av mild tryck i buken och en microcapillary för spermasamling 17,18. Klämma av levande män kräver flera hanar som ska användas för att samla in motsvarande mängd spermier som kan erhållas från en avlivas manliga 17,18. Men män som genomgått klämma förblir helt friska och kan användas för naturliga parningar eller efterföljande in vitro-förfaranden 17. Om möjligt bör utvalda rutiner minimera onödig fisk offer.
1. Beredning av lösningar och Zebrafish Parning Chambers
<ol>2. Dissektion av Testiklar
- Gör Hanks Stock Solution # 6 färsk genom tillsats av 0,35 g natriumvätekarbonat till 10 ml destillerat vatten. Blanda väl för att upplösa natriumvätekarbonat-pulver.
- Kombinera följande i ett rör på is, för att göra den buffrade Hanks Final arbetslösning för spermierna: 9,9 ml Hanks Premix I med 100 | il av stamlösningen # 6.
- Blanda väl, sedan alikvot 500 pl av Hank7, s Final fungerande lösning i ett mikrocentrifugrör och placera på is. OBS: Varje 500 | il alikvot användes för att bereda spermierna från testiklarna hos 4-5 manlig zebrafisk.
- Välj mellan 4-5 manliga zebrafisk för varje spermier skörd. OBS: Detta kommer att skörda tillräckligt med spermier som ska samlas in, bearbetas och lagras i en 1,5 ml mikrocentrifugrör, som kan användas för att gödsla ca 15 haploida kopplingar. Välj ytterligare grupper av män för att förbereda ytterligare rör beroende på omfattningen av experimentet. Om den valda manliga zebrafisk är små eller testiklarna dissektion är ofullständig, normalt kommer att behövas 5 hanar.
- Euthanize varje hane med ett nät för att försiktigt föra fisken i en skål innehållande 0,2% tricaine för cirka 5-6 minuter vid rumstemperatur. OBS: Var noga med att se till att den manliga är korrekt avlivas innan du påbörjar dissekering. Vanligtvis vänta flera (2-3) min efter gälarna på fisken stopp rörliga och fiskeninte längre är mottaglig för beröring.
- Plocka hanen upp försiktigt med en plastsked och försiktigt blot manliga torra vätska. Ta sedan bort huvudet av hanen med en vass sax och klipp ett snitt längs den ventrala mittlinjen. OBS: Borttagning av all överflödig vätska från fisken är viktigt att förhindra att utlösa aktivering av spermier.
- Ta bort tarmen och tillhörande tarm organ från bukhålan med fin pincett och plats i en biologiskt avfallsbehållare.
- Använd fin pincett för att ta bort testiklarna, som ligger längs ryggens kroppsväggen, sido till simblåsan, och har vit ogenomskinlig utseende när den visas med stereomikroskop. OBS: Att hålla testiklarna intakt kan bidra till att förhindra exponering av spermier till vattenbaserade kroppsvätskor och på så sätt förhindra för tidig aktivering.
- Placera testiklarna i spermielösningen på is och hålla röret på is som de andra testiklar dissekeras. Upprepa steg 2,6-2,9 tills alla male har dissekeras.
- Placera slaktkroppar och eventuella kvarvarande djurvävnader i en behållare för riskavfall för korrekt institutionellt omhändertagande.
3. UV Sperm Inaktive
- Homogeni testiklarna genom att försiktigt slipa mikrocentrifugrör med en steril mikrorör mortelstöt.
- Överför supernatanten till en liten petriskål eller urglas på is. OBS: Överför inte vävnad skräp tillsammans med den överstående lösningen. Detta kommer att skapa skuggor och äventyra UV-inaktivering av spermier.
- Skölj spermier rör med mellan 300-400 l av ytterligare Hanks Final arbetslösning (framställd i steg 2,2 och lagras på is), och lägga till denna supernatant tvätt till den lilla petriskål eller titta på glas i steg 3.2.
- Exponera skålen för UV från en bänk-lampa (254 nm) under totalt 2 minuter vid ett avstånd från lampan källa av approximativt 15 cm (38,1 cm). OBS: Var försiktig när du arbetar med en UV-lampa och bära ett ansiktsskydd ellerandra ögat personlig skyddsutrustning.
- Återgå skålen till ishink, sedan överföra UV inaktiv spermier till en fräsch mikrocentrifugrör och förvara provet på is. OBS: På denna punkt kommer det att finnas ca 800 l av UV-inaktiv sperma för haploid koppling befruktning. Sperman bör hållas på is under hela den tid tid på klämma honor. Sperma i kallt Hanks kan användas i upp till 6 timmar utan någon minskning av befruktning utfall. Intressant nog har andra forskare rapporterat att spermier i kall Hanks är lönsamt från flera timmar till flera dagar 18.
4. Egg Upphandling från vuxna Zebrafish Kvinna och provrörsbefruktning av Clutch
- Förbered tricaine bad för anestesi genom att kombinera 20 ml 0,2% tricaine lager med 80 ml av fisk vattensystem.
- Välj honan för insamling av ägg, med hjälp av ett nät för att placera henne försiktigt i skålen av tricaine.
- Vänta 2-3 min tills honan bedövas och inte längre reagerar på beröring. OBS: Om kvinnliga ryckningar eller framkallar andra rörelser, ge henne ytterligare tid för att ge efter för anestesi.
- Använd en plastsked att försiktigt lyfta den kvinnliga, dekantering av lösningen innan du lägger honan på en pappershandduk för att transportera bort överflödig vätska. OBS: Var noga med att inte lämna extra lösning på den kvinnliga, som vätska utlöser ägg aktivering före tillsatsen av spermier.
- Placera kvinna på hennes bild i en ren petriskål och visualisera hennes mage under stereomikroskop.
- Stroke honans mage försiktigt i cirka 10-20 sekunder med hjälp av en eller två fingrar från ena handen för att pressa ägg från hennes mage, under tiden stödja honans rygg genom att placera en eller två fingrar från den andra sidan strax bakom hennes rygg kroppen väggen. OBS: När du stryker honans buk, bör äggen komma ut väldigt lätt. Om äggen inte dyka with lindra det är inte tillrådligt att "skjuta hårdare" och ägg kraft från honan. Detta tyder på att äggen inte är närvarande och / eller inte är redo för befruktning, och fortsatte skjuta är förknippad med betydande risk för att skada den kvinnliga (t.ex. defla simblåsan eller orsakar andra dödliga inre skador). Om en kvinna kläms men ger ingen eller några ägg, tillbaka honan till djuranläggningen. Efter 1-2 veckors vila, koppla ihop hona med en hane för en naturlig parning för att rensa ut kvarvarande ägg skräp. Segregera honor som parar sig naturligt in i en tank i ytterligare 1-2 veckors vila innan du försöker en andra klämma. Alternativt kan kvinnor vara utvilad för 4 veckor, under vilken tid de kan sättas upp för naturliga parningar 15.
- Använd en fin sond eller liten spatel att ösa ägg ut från under den kvinnliga och / eller hennes mage yta.
- Lyft försiktigt honan och tillbaka henne till en lämpligt märkt isolering tank innehållande fisksystemet vatten. </ Li>
- Addera 50 pl av UV-inaktivspermielösningen till kopplingen av ägg och inkubera vid rumstemperatur i 30 sek under vilken tid, anbringa en märkning till skålen för att spåra den med numret som tilldelats den kvinnliga föräldern.
- Tillsätt 1 ml E3 till äggen och inkubera vid rumstemperatur i 1 min.
- Tillsätt tillräckligt med E3-lösning för att fylla skålen halvvägs, och placera embryona vid 28 ° C för efterföljande inkubation. OBSERVERA: Tillsatsen av penicillin / streptomycin (1% (v / v) pen-strep-lösning innehållande 5.000 enheter penicillin och 5 mg streptomycin per ml) 19 till E3 kan bistå i den allmänna hälsan av de haploida embryon.
5. Observation och hantering av Haploid embryon
- Efter 4-8 timmar, ta bort obefruktade embryon från skålen och tvätta resterande embryon genom att ersätta E3 embryo media med färska E3-lösning. OBS: obefruktade embryon visar en vit, ogenomskinlig utseende eller kan visa en genomskinlig enppearance med deformerade enda cell.
- Inkubera tills önskad tidspunkt av intresse, och sedan använda i önskad analysskärmen eller annan forskning applikation (er).
Representative Results
Produktionen av haploida embryon kan genomföras för att identifiera recessiva mutationer i F2-generationen när haploider erhållits från mogna zebrafisk honor som är avkomma till muta föräldrar (Figur 1). Detta sparar tid och utrymme jämfört med den traditionella diploida skärmen, där forskare behöver höja F2 familjer vars diploid avkomma utvärderas sedan för fenotyper av intresse (Figur 1).
De viktigaste stegen i det protokoll som beskrivs i steg 1-5 ovan för att erhålla zebrafisk haploida embryon genom provrörsbefruktning är schematiseras som ett flödesschema (figur 2). Dessa steg innebär beredning av lösningar och grundning av honor med exponering för manliga hormoner i parningstankar (dag 1), följt av spermier och ägg upphandling och in vitro-fertilisering (Dag 2), och slutligen uppfödning av haploider (Dag 3-5) (Figur 2). När combination med en genetisk skärm, en vanlig mutagenes förfarande i zebrafisk innefattar tidigare exponering av de manliga zebrafisk vildtyp vuxna för en mutagen (t ex till en kemisk mutagen som ENU, även om andra förfaranden, såsom retroviralt baserad mutagenes kan genomföras som också underlätta kloning av den kromosomala defekten), följt av avel med vildtyp honor för att skapa en muterad F1 generation. Sådana preparat kräva flera månaders arbete (ca 6 månader) utifrån de generationstider behövs för att bakre vilda slag, utföra mutagenes, och bak den efterföljande muta F1 15,17,22.
En annan viktig punkt för behandling i att anställa haploider för en skärm är valet av zebrafisk stam. Den AB * (AB stjärna) stam har blivit kända för att producera haploida embryon med bättre övergripande egenskaper och hälsa än andra stammar 15. Emellertid i det härledda Tübingen stam uppfödda i vår laborahistoria, har vi nyligen observerat embryologiska funktioner som har aktiverats framgångsrika skärmar för missbildningar av njursystemet (G. Gerlach och R. Wingert, opublicerad). Vuxna zebrafisk Tübingen stam hanar mutageniserades genom en serie av tre ENU behandlingar, och sedan korsade till vildtyp Tübingen honor för att generera en F1-generationen för screening. F1-honor pressades att få ägg och dessa F2 ägg befruktas med UV-inaktiv sperma. Jämfört med diploida kopplingar erhållna genom naturliga parning av vildtyp Tübingen föräldrar (figur 3A), embryon i dessa haploida Tübingen töjnings kopplingar visas en kortare, kompakt trunk karakteristisk för den haploida tillstånd (fig. 3B, C). Vidare haploida kopplingar består typiskt av embryo syskon, som uppvisar en rad brister, som vi observerade också (Figurerna 3B, C), som är känd att variera inom stammar, såsom diskuteras vidare nedan 15,17. Tidigare studier har etablerat en kanonisk betygsserie, vilket motsvarar lönegraderna A till D, för att kategorisera de olika haploida fenotyp defekter 15,17, och dessutom haploider har också tagits upp i termer av de adjektiv bra, intermediär och dålig kvalitet 22. Grade A haploider motsvarande högkvalitativa haploider, är den mest normala i utseende, med en kort och kompakt kropp, men totalt sett visar en morfologisk utseende liknar diploider 15,17,22 (jämför diploida syskon (d) till haploid klass A (märkt A) syskon, figur 3B). Haploid klass A embryon utvecklas också blygsam perikardiell ödem, som är ett typiskt inslag i haploid zebrafisk utveckling 15,17,22 (Figur 3B). I jämförelse med klass A haploider, mellan-eller sk klass B haploida embryon (märkt B, Figurer 3B, C) kännetecknas av utveckling av en förkortad ytterligare eller vikt / twisted stammen, även om funktionerna i ett huvud och svans är klart urskiljbara 15,17,22. Slutligen grad C eller dålig kvalitet haploider (även nämns i några referenser som C / D) 15,17,22 är ytterst bristfällig och visa en oorganiserad massa av celler i samband med med en äggula boll (märkt C, figur 3C). Även bland samma stam, haploida kopplingar varierar i fördelningen av A-, B-, och C-fenotyper som man ska följa. Till exempel den haploida koppling från en Tübingen hona visade bättre utveckling totalt sett, med mestadels A-och B-klass haploid avkomma (Figur 3B) jämfört med haploider erhållits från en andra Tübingen hona, vars koppling bestod av många betyget C haploid avkomma samt A och B haploida fenotyper (figur 3C). Liknande stam variabilitet haploida embryo kvaliteter har tidigare observerats i AB och AB * stam fisk samt 15.
Trots dessa morphological skillnader, organogenesen av många strukturer fortsätter relativt normalt i haploida embryot. Även om de har en kortare kropp bålen, utveckling av organ såsom ögon och hjärta är relativt lik den för vildtyp diploida embryon, och celltyper såsom pigmentceller (melanoforer och xanthophores) kan också utvärderas 15. Dessutom har vi dokumenterat nyligen att pronephros eller embryonal njure, är utvecklad av en dag efter befruktning i vildtyp haploid, i likhet med vild typ diploider. Som bevis på detta visas pronephros celltyp mönstring den prototypiska mönster av segment (Figur 4). Vidare är fenotypen av recessiva mutationer som förändrar pronephros utveckling, såsom lib mutation som minskar retinsyra produktion, visar ett liknande mönster i den haploida tillstånd jämfört med det diploida tillståndet (fig 4) 23,24. Denna observation är i överensstämmelse med andra recestande mutationer som leder till liknande fenotyper i både haploida och diploida skick, även om detta inte alltid fallet med alla mutationer och bör hållas i åtanke om att utvärdera denna typ av skärm strategi 15.
Ett antal vävnader och organ är vanligtvis onormalt i haploider. Exempelvis haploider visar defekter i omlopp, som vanligen uppvisar blod sammanslagning, vilket kan göra deras förmåga att studera vissa aspekter av vaskulogenes begränsade 15. Dessutom har det konstaterats att haploider kan ha oregelbundenheter i örat utveckling, så att de kan utvärderas för mutationer som förhindrar öron vesikler bildning helt, men inte för mutationer som påverkar subtila processer med morfogenes av denna struktur 15. Som ett annat exempel på detta, är hjärnan morfogenes onormalt i haploider, och därmed haploida skärmar för att identifiera nödvändiga hjärnutvecklingsvägar är begränsade 15. Trots dessa begränsningar, vår aNALYS av njurutvecklingen i haploida tillstånd (Figur 4) lägger detta organ till listan med "screen" embryonala strukturer. Detta fynd understryker att en haploid skärm metod kan användas för att dissekera de genetiska komponenterna i njurstamfader mönstring och lägger tonvikten på känslan att geniala skärm metoder kan kringgå begränsningarna i haploid embryo ontogeni att avslöja värdefulla nya muterade modeller för att studera ryggradsdjur utveckling 15.
Figur 1. Schematisk av diploida och haploida strategier skärm i zebrafisk modellen. Efter mutagenes av föräldragenerationen, kan F1-generationen höjas och användas antingen för att generera F2 muterade familjer som används för att screena F3 generationen i en diploid tillstånd (vänster ) eller direkt skärmened i en haploid strategi (höger). I en haploid skärm, är de könsmogna F1 generation kvinnor som används för att samla in haploida F2 kopplingar för genetisk analys. Kvinnliga heterozygota bärare identifieras om ungefär hälften av F2 haploider visar en mutant fenotyp (röda embryon) jämfört med vild typ haploida syskon (gula embryon).
Figur 2. Haploid embryoproduktionsflödesschema. De viktigaste stegen i provrörsbefruktning för att producera haploida embryon schematiseras som uppgifter utförs på dag 1 (rosa rutor) för att förbereda spermier lösningar och prime vuxna zebrafisk honor, uppgifter som utförs på dag 2 (orange lådor ) för att samla in och UV inaktivt spermier, för att samla ägg, för att befrukta äggen med UV-inaktiv spermier att generera haploider, och sedan för att återuppliva den kvinnliga mor, och finally arbetsuppgifter utförs på efterföljande dagar 3-5 (gul ruta) när kopplingarna inkuberas till önskad tid (er) för observation och analys.
Figur 3. Jämförelse av diploida och haploida Tübingen stam zebrafisk embryon. A) Diploida vild embryon typ producerades av naturliga lek och sedan odlades fram till ungefär 30 HPF. B, C) Haploid embryon vild typ som produceras av provrörsbefruktning av kopplingar som erhållits från F1-generationen muterade honor med UV-inaktiv spermier, och odlades fram cirka 30 HPF. Haploider uppvisade en rad avvikelser i utvecklingen jämfört med diploida vild typ embryon (svarta pilspetsar, d för att indikera diploid). Relativt vanliga haploider hade en kortare, mer lager kropp analog med betygssystemet aven En haploid 15 (röda pilspetsar, märkt A), medan haploider med grova avvikelser uppvisade ett kraftigt stympade kroppsaxeln (lila pilspetsar, märkt B) vilket motsvarar betyget B, och slutligen klass C (blå pilspetsar, märkt C) baserat på publicerade beskrivningar 15. Alla embryon fotograferades live på en 2,5 X förstoring.
Figur 4. Develop mönstring av celltyper som utgör pronephros embryonjur organ i haploid Tübingen stammen zebrafisk. Haploid vilda typer visas ett normalt mönster av celltyper i den embryonjurstrukturen (övre raden). Den embryonala njur består av ett par av segmenterade funktionella enheter som kallas nephrons. Den segmenterade mönster av separata celltyper som är närvarande i nefroner kan visualiseras räknat på hela mount
Discussion
Haploid screening är en användbar teknik för att upptäcka viktiga gener nödvändiga för tidiga utvecklingsstadier. Vidare, odling av haploida celler från medaka fisken har använts för att isolera ES-liknande cellinjer som har ett stort antal forskningsansökningar och potential, visar att haploida celler kan ge en värdefull framtida mötesplats för andra typer av ryggradsdjur genetiska studier 20,21. Detta protokoll ger en demonstration av de som arbetar med att utföra produktionen av haploida zebrafisk embryon genom befruktning in vitro med UV-inaktiv sperma metoder. Denna metod kan användas för att utföra framåt haploida skärmar med muta F1 fisk, vilket kan göras med hjälp av vild typ, transgena eller muterade stammar för förstärkare / suppressor screening.
Trots screening tiden med en haploid strategi är vida förkortas jämfört med diploida screening, kommer det ändå att ta flera månader att slutföra. Som vi descrisäng tidigare, det finns många fördelar som finns genom att utföra en skärm med hjälp av en haploid schema, som alla kan hjälpa till att göra nya bidrag till den aktuella kunskapen om valfritt antal utvecklingsmässiga händelser. Den haploida skärm metod är mer effektiv för identifiering av recessiva muterade alleler än diploida-baserade skärmar på grund av minskningen av tid, rum och antalet fiskar som behövs. Men det finns flera fallgropar att en haploid skärm. En haploid skärm kan bara identifiera mutanter i gener som är aktiva inom de första dagarna av utveckling, eftersom embryot bara kan överleva under en begränsad tid med en haploidgenom. Gener som uttrycks senare i utvecklingen skulle behöva identifieras med en annan metod, t.ex. en diploid skärm. Dessutom har vissa organ inte utvecklas ordentligt i en haploid organism. Det kan finnas anatomiska avvikelser, eller en fördröjd tid för utveckling, som kan orsaka mutationen missas av den haploida screeningteknik. Jagn Dessutom har vissa stammar av fisk inte utvecklas lika bra i en haploid tillstånd 15. Haploider kan kategoriseras av en betygs rad goda, intermediära och lång embryonala funktioner, med A-embryon är den mest normala, B att utse embryon med defekter i axeln men ett klart huvud och svans, och C / D för att utse embryon med oigenkännliga egenskaper (massorna av celler ovanpå äggula bollar) 15,17. Proportionerna av embryon inom dessa kategorier varierar från zebrafisk stam, med ökat antal bättre kvalitet haploider vanligare i synnerhet genetisk bakgrund 15,17. Tack vare dessa faktorer, är det nödvändigt att finna en lämplig stam av zebrafisk att utföra mutagenes och efterföljande korsningar. I vår senaste erfarenhet, producerade den vilda typen Tübingen stammen livskraftiga haploider för screening (som visas i figur 3 och 4) men historiskt zebrafisk forskare har utnyttjat AB eller AB * stammarna för haploid experimsentation 15.
Förutom dessa ovan nämnda utmaningar kommer inte alla grundmålade vuxen zebrafisk honor producera en koppling på att utföra klämtekniken. Till exempel i arbetet med ENU-muterade Tübingen stam honor, ungefär hälften av alla kvinnor producerade en koppling på klämma, och någon bråkdel av dessa (vanligen 10-30%) var dålig embryo kvalitet eller kunde inte gödslas. Således, för att utföra en haploid skärm man måste planera för att ta upp minst dubbelt så många fiskar som behövs för att screena det önskade antalet av genom (varje hona representerar en genomet screenas). Oberoende av detta övervägande, fördelarna med haploida metod för screening för att täcka ett stort antal genomet utan en massiv djuranläggning är faktiskt ganska betydande om analysen är mottaglig för den haploida tillstånd. Dock bör det också påpekas att ytterligare studier av mutationen (er) som anges i den haploida kopplingen är helt beroende av ett framgångsrikt höja enn utparning från den kvinnliga grundare. Som med alla skärmar, "hits" från början identifierades under urvalsförfarandet måste åter identifieras i diploida tillstånd.
Trots de fallgropar med att använda den haploida skärmen, har det visat sig vara mycket framgångsrik i att identifiera mutanter, som har analyserats på djupet med insiktsfulla vinster till det vetenskapliga området 15. Haploid skärmar kan genomföras för att undersöka andra dåligt kända processer av ryggradsdjur utveckling. Använda haploider för förstärkare och suppressor-skärmar är ett sätt att få mer insikt i verksamheten och reglerande nätverk av en gen av intresse. Den haploida screeningsteknik kan också användas för att identifiera förstärkare och suppressorer av mutanter som redan har isolerats genom metoder såsom kemisk eller insertionsmutationer eller omvänd genetik ansatser som markberedning, eller TALENS. I korthet kan den tidigare isolerade mutanten mutageniseras med ENU och screenas för förstärkare eller suppressors i den ursprungliga mutanta fenotypen. Mutanten måste kunna nå vuxenstadier, så det är nödvändigt att ha en heterozygot djur eller en svag homozygot mutant fisk för att utföra denna skärm, men nya framsteg inom transgenes har tillåtit forskare att kjol detta problem. Att lära sig att manipulera vägar i utvecklingen kan leda till många spännande möjligheter, inklusive möjligheten av störande vägar för behandling av sjukdomstillstånd.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering till RAW från följande: NIH bidrag K01 DK083512, DP2 OD008470, och R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Startat Scholar Award # 5-FY12-75; starta upp medel från University of Notre Dame College of Science och Institutionen för Biological Sciences; och en generös gåva till University of Notre Dame från Elizabeth och Michael Gallagher på uppdrag av Gallagher Family främja stamcellsforskning. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar de stavar av Institutionen för Biological Sciences för deras stöd, och Centrum för Zebrafish forskning på Notre Dame för deras enastående engagemang i vård och omsorg om våra zebrafisk koloni. Vi tackar GF Gerlach för att ta fotografier som i Figur 4. Slutligen vill vi tacka alla medlemmar i vår forskningslabb för sina kommentarer, diskussioner och obetydhts om detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
References
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al.
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genetics. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , Humana Press. (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
