Abstract
Zebra balığı çok sayıda bilimsel çalışma disiplinleri için uygun olan bir ana omurgalı modeli haline gelmiştir. Gastrulasyon bir temel stereomikroskopta organogeneziste değişen olayların doğrudan gözlemlenmesini sağlayacak özelliklerin bir takımyıldızı - Zebra balığı, özellikle de nedeniyle dış döllenme, embriyonik boyutu, hızlı ontojenliği ve optik netlik gelişimsel süreçleri ileri genetik analizi için uygundur. Ayrıca, Zebra balığı embriyolar haploid durumda birkaç gün yaşayabilir. Bu ilk nesil ebeveyn (P) nesil mutajenezini aşağıdaki (F1) dişi firmalar mevcut resesif mutant alellerin tanımlanmasını sağlayan in vitro haploid embriyo üretimi, mutasyon analizi için güçlü bir araçtır. Bu yaklaşım sayesinde azaltılması ile birlikte araştırmacı zaman tasarrufu, birden fazla nesli mutant ailelerin üreme içerir (vb F2, F3,) yükseltmek için gerekliliğini ortadan kaldırırZebra balığı koloni alanı, emek ve hayvancılık masrafları için ihtiyacı var. Zebra balığı, son birkaç on yıl için ekranlar ileri yapmak için kullanılmış olsa da, transjenik ve genom düzenleme araçları, sabit bir genişleme olmuştur. Bu araçlar artık daha omurgalı bireyoluş sürücü gen düzenleyici ağlarını incelemek için kullanılabilecek yeni nesil ekranlar için nüanslı deneyleri oluşturmak için yollar bir bolluk sunuyor. Burada, biz haploid zebra balığı embriyoları nasıl hazırlanacağını açıklar. Bu protokol, erken evrelerinde meydana süreçleri ve dokularının geniş bir sayıda geliştirme mekanizmalar için, bu gibi güçlendirici ve baskılayıcı ekranlar gibi yeni gelecek haploid ekranlar için uygulanabilir.
Introduction
Omurgalı gelişimini orkestra temel süreçleri geniş 1 korunmuştur. Gelişiminde önemli roller ile genleri tanımlamak için güçlü bir şekilde ilgi sürecinde fenotipik kusurlarına yol kalıtsal mutasyonlara izole etmektir. Zebra balığı, Br.rerio, son birkaç yılda üzerinde 2 omurgalı gelişim genetiği için yaygın olarak kullanılan bir model organizma olmuştur Cyprinidae balık familyasına ait küçük bir tatlı su teleost türdür. Zebrafish yumurta döllenme 3'ün başlangıcından zigot erişim temin eden, harici döllenir. Bundan başka, erken embriyo basit bir stereomikroskop 3 ile geliştirilmesi görselleştirme sağlayan, optik olarak transparandır. Zebra balığı ontogeny bölünme, gastrulasyon, ve büyük ölçüde gelişme 3'ün ilk gün içinde tamamlanan bu kalp ve böbrek gibi pek çok yapı, bir organogenezisin süreçleri ile, hızlıdır. To eşeysel olgunluğa larva aşamadan zaman 2-3 ay sürer, ve yetişkinler uzunluğu yaklaşık 3-4 cm, çok balık minimum alanda 2 korunabilir küçük omurgalı. Buna ek olarak, zebra balığı yetişkin 2. Haftada birkaç yüz embriyo üretmek mümkün, her balık, yüksek doğurganlığın var. Bu nitelikler ileriye için Zebra balığı, izlenebilir hale ve genetik ekranları ters gelmiştir. Zebra balığı onların anatomi, hücre biyolojisi, memeliler ve 2,4 gibi daha gelişmiş omurgalı türlerin ile fizyolojisi koruma yüksek derecede sahip. Aslında, son sekans analizi zebra balığı genomu insan genlerinin 5, yaklaşık% 70 homologlarını içerdiğini göstermiştir. Bu koruma, embriyonik ve yetişkin koşullar dahil olmak üzere çok sayıda 2,4 insan hastalıkları için bir model olarak zebrafish kullanmak için araştırmacılar sağladı. Birlikte ele alındığında, bu faktörler olan genlerin belirlenmesi amaçlı ekranlar için mükemmel bir sistem Zebrafish yaptıkNormal omurgalı ontojenliği için gereklidir.
Büyük ölçekli ekranlar bir dizi Zebrafish yürütülmüş ve gelişim gen 6-8 birkaç bin mutasyonlar belirledik. Zebra balığı yetişkin erkek mutagenez için uygun olduğunu, ve kromozomal değişiklikleri kimyasal mutagen etilnitrosou.rea (TRK) 6,7 ya da retroviral sokma mutagenezi 9 kullanarak nispeten yüksek bir frekans ile oluşturulabilir. Bugüne kadar, 9000'den fazla kalıtsal mutasyonlar yarattı ve embriyojenezin hemen hemen tüm yönlerini etkileyecek genleri içerir olmuştur. Zebra balığı topluluk dünya çapında yaklaşık 5.000 mutant ve transgenik alleller topladığı Zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi (veya Zirc) 10 de bu mutantların bir merkezi bankası kurmuştur. Bu mutasyonların çoğu analiz ve biyolojik disiplinlerde numero ayrı alay için kullanılmıştır değerli bilgiler araştırmacılar vererek klonlanmıştırZebra balığı deneyler ile kaynaklanan anlayışlar aracılığıyla bize hücresel ve fizyolojik yollar.
Ileri ekranlar önemli genlerin etkileyici bir dizi belirledik rağmen, çok süreçlerin sayısız aracılık genetik düzenleyici ağları hakkında takdir henüz. Bugüne kadar yapılmış birçok ekranlar doygunluğa ulaşamamış ve bu nedenle ileri yanı sıra, ters genetik ekranlar embriyojenezin mekanizmaları tanımlamak ve analiz etmek için bir taşı kalmıştır. Tek bir zebra balığı mutant hattı panoda büyük bir anlayış olsa da, bu alanda önemli bir sınırlayıcı faktör tarihsel konumsal klonlanması ile ilgili zaman alıcı bir çaba olmuştur. Bu nedenle, birçok kimyasal yolla mutasyon kimliği bir sır olarak kalmıştır. Bununla birlikte, hızlı bir klonlamayı kolaylaştırmak 11-14 tam genom dizileme yaklaşımların son gelişiyle birlikte, genetik mutasyonlann etkili bir şekilde gerçekleştirilmesi tanımlanması şimdi Feasible.
Zebra balığı prototip ileri ekran (Şekil 1, sol sütun), üç kuşaktır 6,7 olan çekinik mutasyonları tespit edebilir bir diploid ekran. Bu teknik, parental (P) erkek germ hücrelerinde üreten mutasyonlar içerir, ve daha sonra bir vahşi tip dişi ile erkek çiftleşme. Bu çiftleşme ilk nesil (F1) döl her mutasyona uğramış baba genomun kromozomal katkılarından dolayı bir veya daha fazla benzersiz mutasyon liman olacaktır. F1 ve F2 döl kaldırdı aileleri oluşturmak için vahşi türleri ile çaprazlanırlar. F2 ailede, kardeşler vahşi tip veya heterozigot taşıyıcı ya olacak, ve ilgi fenotip (ler) için analiz edilir F3 kavramaları oluşturmak için rastgele incrossed edilir. Heterozigot taşıyıcıların F3 kavramaları% 25 vahşi tipli,% 50 heterozigoz ve homozigoz mutant% 25 balık içerir. Bu çok nesiller tarama şema Ancak, bu kadar önemli bir dezavantajı etkilidirpproach ekran için hazırlamak için gerekli zamanı içerir: Her nesil cinsel olgunluğa ulaşmak için 3 ay etrafında gerektirir beri yalnız balık yetiştiriciliğinde en az 1 yıl, yer almaktadır. Diploid ekranın bu tip diğer sınırlamalar çalışma, uzay, ve konut maliyeti bu kuşak vardır.
Haploid ekran benzer bir mütajenez stratejiler 15 (Şekil 1, sağ kolon) ile çekinik mutasyonları tespit etmek ve daha sonra izole etmek için kullanılabilecek bir alternatiftir. Haploid Zebra balığı embriyolarının üretimi ilk 30 yıl önce 16 tarif edildi ve bir haploid kromozom ploidleşmede ile birkaç gün geliştirmek için normal diploid zebrafish yeteneği bu yana çok sayıda genetik çalışmalar için kullanılmıştır. Haploid Ekranın büyük yarar bu yöntem resesif mutant alleller için taranması amacıyla F2 aileleri yükselterek dahil olmamasıdır. Bunun yerine, üretim F1 dişiler için değerlendirilirbir haploid bir durumda kendi F2 yavruları (Şekil 1, sağ kolon) incelenerek ilgi sürecinde çekinik mutasyonları heterozigozite. Genel olarak, haploid embriyo alımı için adımlar (Şekil 2) nispeten basittir. Karnından (veya "sıkmak"), yumurta ekstrüde etmek amacıyla sperm kullanım için gerekli çözümler hazırlanmasından sonra, yumurtalar manuel manipülasyonla F1 üretimi dişilerden elde edilir. Yumurta elde edildikten sonra, bunlar ultraviyole (UV) maruz inaktive sperm ile in vitro olarak fertilize edilmiştir. UV inaktive sperm nedeniyle kısa dalga boylu UV baba DNA çapraz bağlar gerçeğine yumurta canlı DNA katkıda aciz. Bununla birlikte, yine de sperm ve yumurta aktivitesi zigotik gelişimi ile bağlantılı olayları tetikleme yeteneğine sahiptir. Metabolik aktivasyon üzerine, yumurta mayoz II tamamlamak ve her kro sadece bir anne tarafından tevdi kopya ile geliştirmeye devam edecekben. Bir maternal kromozom üzerinde mevcut ise, bu nedenle 1 N ploidi, embriyo, bir resesif mutant alelinin gelişimsel sonuçlara bağlıdır. Anne tam Penetrant resesif alel bir heterozigot taşıyıcı olup olmadığını Böylece her F2 haploid debriyaj% 50 yabani-tip ve% 50 mutant embriyolar içerecektir. Embriyonik genotip Bu dağılım ilgi mutant fenotipi (ler) in varlığı için kavrama değerlendirilmesi açısından göreceli kolaylığı sağlar. Böyle bir fenotip tespit edilirse, F1 nesil dişi kurucusu sonradan daha heterozigot taşıyıcı oluşturmak ve yükseltmek için vahşi tip erkek zebrabalıkları ile çaprazlanırlar edilir. Bu ekran gerçekleştirmek için birden fazla nesiller yetiştirmek için gerekli değildir, çünkü araştırmacı önemli zaman, emek, ve akvaryum yer kazanmak, ama yine de incelenir F1 kadın sayısına göre genomları önemli sayıda anket gücüne sahip olabilir. Böylece, haploid ekranlar absenc başlatılan küçük laboratuvarlar veya projeler için özellikle uygun olanönemli finansman e.
Bununla birlikte, haploidlerin kullanımına çeşitli sınırlamalar ve dezavantajları vardır. Birincisi, haploid zebra balığı embriyolarının sadece birkaç gün boyunca canlı ve genellikle 3 ila 5 gün sonrası fertilizasyon (DPF) 15 ölmektedir. Haploid Zebra balığı Embriyolar her şeyden onları yine somite kesimleri 15,17 normal sayıda kısa ve tıknaz vücut olmanın yanı sıra, çeşitli özelliklerine göre diploidlerin ayırt edilebilir. Geliştirme ilerledikçe, genellikle 2-3 dpf'e ve ödem 15,17 ile kan göllenmesi ile ilişkili beyin sergiler hücre ölümünü artmış ve dolaşım kötüdür. Ayrıca, haploids bir yüzme kesesi 15,17 şişirmek için başarısız. Ne olursa olsun bu morfolojik farklılıklar, en büyük organ ve dokular kalp, göz ve Notokordun 15,17 dahil oluşur. Bir özelliği haploid bağlamalar hakkında kaydetti onlar kusurlu embriyo & # çeşitleri açısından fenotipleri bir dizi içeren olduğunu8212; özelliği zebra balığı suşları arasında görülmektedir. Doku (lar) ve ilgi duyulan zaman noktası haploid vahşi tip suş içerisinde uygun, normal gelişim göstermektedir Bu nedenle, eğer bir kontrol gerekir ve bu nedenle, bir ekran veya diğer araştırma projesine genetik kusurlar için değerlendirilmesi gereken potansiyeline sahiptir.
Bu zorluklara rağmen, haploid ekranlar zebrabalıkları erken gelişim süreçleri için gerekli olan genleri tanımlamak için başarıyla uygulanmıştır ve haploid protokoller de yıllardır 15-19 toplumda kaynaklar kurulmuştur. Daha yakın zamanlarda, balık haploid embriyolar üretme süreci haploid embriyonik kök Medaka balık 20,21 dan (ES) hücre kültürleri oluşturmak için araştırmacılar tarafından kullanılmıştır. In vitro Medaka haploid embriyo üretimi sonra, embriyolar haploid hücre klonları ile saf üretmek için başka bir 5-8 hafta, ardından yaklaşık 15 hafta boyunca geçirildi birincil hücre kültürleri elde etmek için kullanıldıES hücre özellikleri 15-19. Balık haploid ES hücre hatlarının nesil omurgalı hücre soyları resesif fenotipleri analiz etmek için geniş gelecekte umut vaat, ve önümüzdeki yıllarda genetik analiz için yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir. Böylece, haploid balık embriyoların nesil biyomedikal araştırma topluluğunun uygulamaları büyüyen vardır. Bu makalede, bir video standart prosedürlere 15-19,22 göre UV ile etkisizleştirilmiş sperm ile in vitro olarak haploid zebra balığı embriyo üretilmesi ile ilgili adımlar görsel gösterimini sağlar.
Protocol
NOT: Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. NOT: Aşağıdaki protokol erkeklerin ötenazi içerir sperm izolasyon bir gösteri sağlasa, sperm ve genital gözeneğinden toplama edilebilir hafif karın basıncını ve sperm toplama 17,18 için microcapillary kullanarak erkek Zebra balığı yaşayan anestezi. Canlı erkeklerin Sıkma bir ötenazi erkek 17,18 elde edilebilir sperm eşdeğer miktarını toplamak için kullanılmak üzere birçok erkek gerektirir. Ancak, sıkma geçirmiş erkeklerin oldukça sağlıklı kalmasını ve doğal çiftleşmelerin veya sonraki in vitro prosedürler 17 için kullanılabilir. Mümkün olduğunda, seçilmiş işlemler gereksiz balık kurban aza indirmek gerekir.
1.. Çözümleri ve Zebra balığı Çiftleşme Chambers hazırlanması
<ol>Testislerin 2. Diseksiyon
- Damıtılmış su, 10 ml sodyum bikarbonat, 0.35 g eklenerek Hank Stok Çözeltisi 6. taze olun. , Sodyum bikarbonat tozu eritmek için iyice karıştırın.
- Sperm için tamponlu Hank çözeltisi, son çalışma yapmak için buz üzerinde bir tüp içinde, aşağıdaki birleştirin: stok çözeltisinden 100 ul olan, Hanks ile karışımlar I'in 9,9 ml 6..
- İyice karıştırın, ardından Hank 500 ul kısım7, buz üzerinde, bir mikrosantrifüj tüpü ve yerine s Final çalışma çözeltisi. NOT: Her 500 ul kısım 4-5 erkek zebrafish testislerden sperm hazırlamak için kullanılacaktır.
- Her sperm hasat için 4-5 erkek zebrabalıkları arasında seçin. NOT: Bu toplandığı, işlendiği ve yaklaşık 15 haploid kavramaları döllemek için kullanılabilir, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde depolanabilir kadar sperm hasat olacaktır. Deneyin ölçeğine bağlı olarak ek tüpler hazırlamak için erkeklerin ilave kohort seçin. Seçilen erkek Zebrafish küçük ya da testislerin diseksiyonu eksik ise, genellikle 5 erkek ihtiyaç olacaktır.
- Yavaşça, oda sıcaklığında yaklaşık 5-6 dakika boyunca% 0.2 tricaine ihtiva eden bir çanak içine aktarmak için bir balık ağı kullanarak her bir erkek Euthanize. NOT: erkek önce düzgün diseksiyon başlamadan ötenazi olmuştur sağlamak için dikkatli olun. Tipik olarak, balık durdurmak hareketli solungaçları ve balık sonra birkaç (2-3) dakika bekleyindokunmaya duyarlı artık.
- Plastik bir kaşıkla hafifçe erkek Pick up ve dikkatlice sıvı erkek kuru kurulayın. Sonra, keskin bir makas çifti ile erkek baş kaldırmak ve daha sonra ventral orta hat boyunca bir kesi kesti. NOT: balık tüm fazla sıvının uzaklaştırılması sperm aktivasyonunu tetikleyen önlemek için gereklidir.
- Bertarafı için biyolojik tehlike kap içine ince forseps ve yer kullanarak karın boşluğundan gut ve ilişkili bağırsak organları çıkarın.
- Stereomicroscope altında bakıldığında kesesi lateral dorsal vücut duvarı boyunca yer testisler, kaldırmak ve bir beyaz opak bir görünüme sahip ince forseps kullanın. NOT: sağlam testislerin tutulması su bazlı vücut sıvılarına sperm maruz kalmasını önlemek için yardım ve böylece erken aktivasyonunu önleyebilir.
- Buz üzerinde sperm çözüm içine testisler yerleştirin ve diğer testisler disseke gibi buz üzerinde tüp tutmak. Tümünü tekrarla m kadar 2,6-2,9 adımlarıales disseke edilmiştir.
- Uygun kurumsal bertarafı için biyolojik tehlike kap içine karkas ve kalan hayvan dokuları yerleştirin.
3.. UV Sperm İnaktivasyon
- Yavaşça steril bir mikrotüp havan tokmağı ile mikrosantrifüj tüpü öğütülmesi ile homojenize testisler.
- Küçük bir petri veya buz üzerinde izle cam süpernatant aktarın. Not: süpernatan çözeltisi ile birlikte doku çöküntüsü transferi etme. Bu gölgeler oluşturmak ve sperm UV inaktivasyonuna uzlaşma olacak.
- Ek Hank Nihai çözeltinin (Aşama 2.2 'de hazırlanmış ve buz üzerinde saklanır) 300-400 arasında ul sperm tüp durulayın ve küçük bir Petri kabı için bu yüzer yıkama ekleyip Aşama 3.2' de cam izleyin.
- Yaklaşık 15 (38.1 cm) bir ışık kaynağının bir mesafede 2 dakikalık bir toplam bir tezgah lambası (254 nm) UV çanak Açığa. NOT: UV lambası ile çalışırken dikkatli kullanın ve bir yüz maskesi ya da giymekdiğer göz kişisel koruyucu ekipmanlar.
- Sonra taze mikrosantrifüj tüp UV inaktive sperm aktarmak ve buz örneği saklamak, buz kovası için çanak dönün. NOT: Bu noktada haploid debriyaj döllenme için UV inaktive sperm yaklaşık 800 ul olacak. Sperm kadın sıkma harcanan tüm süresi boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. Soğuk Hank sperm döllenme sonuç herhangi bir azalma olmadan 6 saat boyunca kullanılabilir. İlginçtir, diğer araştırmacılar soğuk Hank sperm birkaç gün 18 birkaç saat canlı olduğunu bildirmişlerdir.
Yetişkin Zebra Kadın ve Debriyaj In Vitro Fertilizasyon 4. Yumurta Alımı
- Balık sistem 80 ml su ile% 0.2 tricaine stoklar 20 ml birleştirerek anestezi tricaine banyo hazırlayın.
- Tr çanak nazikçe onu yerleştirmek için bir ağ kullanarak, yumurta toplanması için kadın seçinicaine.
- Kadın anestezi kadar 2-3 dakika bekleyin ve artık dokunmaya tepki verir. NOT: dişi seyirmesi ya da diğer hareketleri ortaya çıkarır ise, anestezi yenik ona ek süre verin.
- Nazikçe aşırı sıvıyı fitil için bir kağıt havlu üzerine kadın yerleştirmeden önce çözüm decanting, kadın kaldırmak için plastik bir kaşık kullanın. NOT: sıvı sperm eklenmesinden önce yumurta aktivasyonunu tetikleyecek gibi, kadın ekstra çözüm bırakmamaya dikkatli olun.
- Temiz bir Petri kabındaki onu slaytta kadın yerleştirin ve stereomicroscope altında karnına görselleştirmek.
- İnme arada sadece onun dorsal vücut duvarı arkasında, diğer taraftan bir veya iki parmak konumlandırarak dişinin sırtını destekleyen, karında yumurta sıkmak için bir yandan bir veya iki parmağınızı kullanarak yaklaşık 10-20 saniye boyunca nazikçe dişinin göbek. NOT: dişinin karın okşayarak üzerine, yumurta çok kolay çıkması gerekir. Yumurta zekâ ortaya yoksah o sert itmek 've dişi kuvvet yumurta tavsiye edilmez kolaylığı. Bu yumurta döllenme için hazır mevcut ve / veya olmadığını gösterir ve devam itme kadın (örneğin, yüzmek mesane söndürülürken veya diğer ölümcül iç yaralanmaya sebebiyet) zarar önemli riski ile ilişkilidir. Bir dişi sıkılmış ama hiçbiri veya birkaç yumurta içerir ise, hayvan tesisine kadın dönün. Dinlenme 1-2 hafta sonra, artık yumurta enkaz temizlemek için doğal çiftleşme için bir erkek ile kadın eşleştirmek. İkinci sıkmak denemeden önce kalan bir başka 1-2 hafta boyunca bir tanka doğal dostum kadın tutunuz. Alternatif olarak, dişiler doğal çiftleşmelerin 15 için ayarlanmış olabilir, bu süre zarfında 4 hafta boyunca dinlenmiş olabilir.
- Kadın ve / veya onun göbek yüzeyinin altında yumurta oymak için ince bir sonda veya küçük spatula kullanın.
- Yavaşça kadın kaldırın ve balık sistem su içeren etiketli uygun bir izolasyon tankına ona dönmek. </ Li>
- Yumurta debriyaja UV inaktif sperm çözeltisi 50 ul, ve bu süre esnasında, dişi ebeveyn atanmış sayı ile izlemek için çanak karşılık gelen bir etiketi yapıştırın 30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Yumurta E3 1 ml ilave edilir ve 1 dakika süre ile oda sıcaklığında inkübe edin.
- Çanak yarıda doldurmak için yeterli E3 solüsyonu ekleyin ve daha sonraki kuluçka için 28 ° C 'de embriyolar yerleştirin. Not: penisilin / streptomisin (% 1 (v / v) 5.000 birim penisilin ve ml başına 5 mg streptomisin içeren pen-strep çözeltisi) E3 19 haploid embriyoların genel sağlık yardımcı olabilir ilavesi.
5.. Gözlem ve Haploit Embriyolar taşınması
- 4-8 saat sonra, çanak döllenmemiş embriyolar kaldırmak ve taze E3 çözeltisi ile E3 embriyo ortamını değiştirerek kalan embriyolar yıkayın. NOT: döllenmemiş embriyolar beyaz, opak bir görünüm görüntüler veya şeffaf a görüntüleyebilirsinizşekilsiz bir tek hücre ile ppearance.
- Ilgi duyulan arzu edilen bir zaman noktasında kadar inkübe edin ve daha sonra arzu edilen ekran deneyi ya da başka bir araştırma uygulama (lar) olarak kullanmaktadır.
Representative Results
Haploid embriyoların üretimi haploids mutajenize ebeveynlerin yavrular (Şekil 1) olgun zebra balığı kadınlarda elde edilen F2 nesil çekinik mutasyonları tanımlamak için uygulanabilir. Bu araştırmacılar kimin diploid yavrularıyla ilgi fenotipleri (Şekil 1) için değerlendirilir F2 aileleri yükseltmek için gereken hangi geleneksel diploid ekranına kıyasla zaman ve yer kazandırır.
Protokolünde önemli adımlar in vitro fertilizasyon yoluyla Zebrafish haploid embriyoların elde edilmesi için yukarıda Adımlar 1-5 anlatılan bir akış şeması (Şekil 2) olarak şematize edilmiştir. Bu adımlar, sperm ve yumurta alımı ve in vitro fertilizasyon (Gün 2) takip, çözümler hazırlama ve çiftleşme tankları (Gün 1) erkek hormonlarının maruz kadınların hazırlanmasını içerir, ve nihayet haploidlerin yetiştirme (Gün 3-5) (Şekil 2). Ne zaman comGenetik bir ekran ile birleştirilebilir gibi retroviral bazlı mutajenez gibi diğer işlemler, uygulanabilir, ancak, Zebrafish ortak bir mutajenez yöntemi, TRK gibi bir kimyasal mutajene bir mutajen (örn., erkek için, zebra balığı, yabani tip yetişkin önceki maruz içeren, aynı zamanda ) kromozomal defekt klonlama kolaylaştırmak, mutasyona uğramış bir F1 nesil oluşturmak için vahşi tip kadın ile üreme izledi. Bu tür preparatlar sonraki Mutajenize F1 15,17,22 mutagenesisini gerçekleştirmek, arka yabani türleri için gerekli üretim süreleri esas işin birkaç ay (yaklaşık 6 ay) gerektirir, ve arka.
Bir ekran için haploidler istihdam göz için bir başka önemli nokta zebrabalıkları gerginlik seçimdir. AB * (AB yıldız) suşu diğer cinslerden 15 daha iyi genel özellikleri ve sağlık ile haploid embriyo üretmek için iyi bilinen haline gelmiştir. Ancak, bizim laborant yetiştirilen türetilmiş Tübingen suşuTory, son zamanlarda (yayınlanmamış G. Gerlach ve R. Wingert) böbrek sistemi gelişimsel anomalisi başarılı ekranlar etkin olması embriyolojik özellikleri gözlemledik. Yetişkin erkek zebra balığı Tübingen streyn üç TRK bir dizi tedavi ile mutajenize ve daha sonra tarama için bir F1 nesli üretmek için vahşi tip Tübingen dişilere çaprazlandı. F1 dişiler yumurta elde etmek sıkılmış ve bu F2 yumurtalar UV inaktive sperm ile döllenmiş edildi. Vahşi tip Tübingen anne (Şekil 3A) doğal çiftleşmesinden elde edilen diploit kavramaları ile karşılaştırıldığında, bu haploid Tübingen gerginlik pençesine embriyolar haploid devletin kısa, tıknaz gövde özelliği (Şekil 3B, C) görüntülenir. Bundan başka, haploid kavramalar tipik olarak ayrıca 15,17, aşağıda ele alındığı gibi, suşları içinde değişebilir bilinmektedir biz de görülen kusurlar, bir dizi (Şekil 3B, C), ekran embriyo kardeş oluşur. Önceki çalışmalar haploid fenotip kusurların 15,17 aralığını kategorize etmek, D aracılığıyla sınıflarda A'ya karşılık, kurallı bir derecelendirme dizi kurduk, ve ayrıca haploids da sıfatlar iyi, orta ve kötü kalite 22 cinsinden ifade edilmiştir. Grade A haploids, yüksek kaliteli haploidlerin karşılık, kısa ve tıknaz bir gövde ile, görünüşte çok normal ama genel haploid sınıf A (etiketli diploid kardeşler (d) karşılaştırma (diploidlerin 15,17,22 benzer bir morfolojik görünüm göstermektedir A) kardeşler, Şekil 3B). Haploid dereceli bir embriyoları da haploid Zebrafish geliştirme 15,17,22 (Şekil 3B) tipik bir özelliğidir mütevazı perikard ödem, geliştirmek. Grade A haploidlerin, orta ya da sözde dereceli B haploid embriyolar ile kıyaslandığında (B etiketli, 3B, C Rakamlar) daha kısaltılmış veya bükülmüş / Yalancı geliştirilmesi ile ayırt edilirted gövde, baş ve kuyruk özellikleri açıkça ayırt 15,17,22 olsa. Son olarak, (aynı zamanda C / D olarak bazı referanslar listelenmiştir) C derece veya kalitesiz haploids 15,17,22 derece kusurlu ve bir yumurta sarısı topu (etiketli C Şekil 3C) ile dernek hücrelerin düzensiz bir kitle görüntüler. Hatta aynı gerilme arasında, kavramalar haploid bir gözlemlemek A, B, ve C fenotipleri dağılımında değişir. Örneğin, bir Tübingen dişi haploit debriyaj olan debriyaj çok sayıda sınıf C haploid yavru oluşuyordu yanı sıra ikinci bir Tübingen kadın, elde haploidlerin kıyasla çoğunlukla A ve B sınıfı haploid yavrular (Şekil 3B), genel olarak iyi bir gelişme görüntülenen ve B haploid fenotipleri (Şekil 3C). Haploid embriyo kaliteleri benzer bir soy değişkenliği daha önce de 15 AB ve AB * gerginlik balık gözlenmiştir.
Bu mor rağmenphological farklılıkları, çok sayıda yapıların organogenez haploid embriyo nispeten normal olarak devam eder. Bu gözler ve kalp vahşi tip diploid embriyo edilene nispeten benzer olan ve bu pigment hücreleri (melanophores ve ksantoforların) gibi hücre tipleri de 15 değerlendirilebilir gibi organların bir kısa gövde gövde, bir gelişme olmasına rağmen. Ayrıca, pronephros ya da embriyonik böbrek, benzer şekilde, yabani tip diploid için, vahşi tip haploid 1 gün sonra döllenme tarafından geliştirilmiştir son zamanlarda ortaya çıkarmıştır. Bu delil olarak, pronephros hücre tipi desenleme kesimleri prototip modelini (Şekil 4) görüntüler. Bundan başka, bu tür retinoik asit üretimini azaltır lib mutasyonu gibi pronephros geliştirme, değiştirme resesif mutasyonların fenotip, diploid duruma göre haploid halde benzer bir yol (Şekil 4) 23,24 gösterir. Bu gözlem, diğer Reces o ile tutmak olduğunuBu her zaman tüm mutasyonlar ile durum böyle değil ve ekran stratejisinin 15 bu tür değerlendirirken akılda tutulmalıdır olsa, hem haploid ve diploid durumda benzer fenotiplere yol mutasyonlar ucuzdur.
Doku ve organların bir dizi haploidlerin tipik olarak anormaldir. Örneğin, haploids vaskülojenezin bazı yönlerini incelemek için onların yeteneği 15 sınırlı yapabilir sık kan havuzu sergileyen dolaşımında kusurları, görüntüler. Buna ek olarak, bu yapının 15 haploids morfogenez ile ilgili ince işlemleri etkileyen mutasyonlar için değil de tamamen kulak vezikül oluşumunu önlemek mutasyon için değerlendirilebilir, öyle ki kulak gelişimi düzensizlikler olabilir, ancak not edilmiştir. Bu nedenle başka bir örnek olarak, beyin morfolojisi haploidlerin anormal olduğunu ve bu nedenle gerekli beyin gelişimi yolları tespit etmek haploid ekranlar 15 sınırlıdır. Bu kısıtlamalara rağmen, bizim birhaploid durumda böbrek geliştirme (Şekil 4) nalysis 'taranabilir' embriyonik yapıların listesine bu organı ekler. Bu bulgu haployid ekran metodoloji böbrek progenitör desenlendirmenin genetik bileşenlerini incelemek için kullanılan ve ustaca ekran yaklaşımlar omurgalı gelişimini 15 incelemek için değerli yeni mutant modelleri ortaya çıkarmak için haploid embriyo ontogenezimizin sınırlamaları aşmak olduğunu duyguları vurgu katıyor olabilir vurgulamaktadır.
Şekil 1. Zebra balığı modelinde diploid ve haploid ekran stratejileri şematik. Parental jenerasyon mutajenezi takiben, F1 üretimi yükseltilmiş ve ikinci ya da bir diploid halde F3 nesil ekran (sol için kullanılan F2 mutant aileleri oluşturmak için alınabilir ) veya doğrudan ekranhaploid strateji (sağ) ed. Bir haploid ekranında, cinsel olgun F1 nesil kadın genetik analiz için haploid F2 kavramaları toplamak için kullanılır. F2 haploidlerin yaklaşık yarısı haploid vahşi tipli kardeşlerine (sarı embriyo) göre bir mutant fenotipi (kırmızı embriyo) görüntüler durumunda kadın heterozigoz taşıyıcı tespit edilir.
Görevleri sperm çözümleri ve 2. Gün (turuncu kutu üzerinde gerçekleştirilen asal yetişkin zebrabalıkları kadın, görevleri hazırlamak Günü 1 (pembe kutular) üzerinde yapılan Şekil 2. Haploit embriyo üretim akış şeması. Haploid embriyo üretmek için in vitro fertilizasyon önemli adımlar şematize edilmiştir ) toplamak ve UV etkisizleştirilmiş sperm, yumurta toplamak için haploidler oluşturmak için UV inaktive sperm ile yumurta döllemek için, ve sonra kadın annesini canlandırmak ve finall içiny görevler sonraki gün gerçekleştirilen 3-5 kavramalar gözlem ve analiz için istenen zaman noktası (ler) için inkübe edilir (sarı kutu).
Şekil 3. Diploid ve haploid Tübingen gerginlik Zebra balığı embriyolarının karşılaştırılması. A) Diploid vahşi tip doğal embriyolar yumurtlama tarafından üretilen ve daha sonra yaklaşık 30 HPF. Oda kadar inkübe edildi, C) Haploid vahşi tip embriyolar UV ile etkisizleştirilmiş sperm ile F1 üretimi mutasyona kadınlarda elde edilen kavramaların in vitro fertilizasyon tarafından üretilen ve kadar kuluçkalanmıştır yaklaşık 30 HPF. Haploids diploid yabani tip embriyoların (siyah ok uçları, diploid belirtmek için d) ile karşılaştırıldığında gelişiminde anormallikler bir dizi sergiledi. Nispeten normal haploids bir sınıflandırma şemasına benzer bir kısaltılmış, daha stok vücudu vardıA haploid 15 brüt anormallikler haploids B notu tekabül eden bir ciddi kesik gövde ekseni (mor ok başları, etiketli B) sergiledi ise, (kırmızı ok başları, A etiketli), ve nihayet evre C (mavi ok başları, etiketli C) dayalı yayınlanan açıklamaları 15. Tüm embriyolar, bir 2.5X büyütmede canlı fotoğraflandı.
Haploid Tübingen soy zebrabalıkları pronephros embriyonik böbrek organı içeren hücre tiplerinin Şekil 4,. Gelişim model verme. Haploid vahşi tür embriyonik böbrek yapısı (üst sıra) içinde hücre tipleri, normal bir desen görüntülenir. Embriyonik böbrek nefron olarak bilinen bölümlere fonksiyonel birimlerin bir çift oluşur. Nefron içinde mevcut farklı hücre tipleri segmente model bütün montaj göre görselleştirilebilir
Discussion
Haploid tarama erken gelişim aşamaları için gerekli temel genleri keşfetmek için yararlı bir tekniktir. Bundan başka, Medaka balık haploid hücrelerin kültürlenmesi haploid omurgalı hücrelerinin genetik çalışmalar 20,21 diğer türleri için değerli bir gelecek mekan sağlayabilir olduğunu gösteren çok sayıda araştırma uygulamaları ve potansiyele sahip ES-benzeri hücre hatları izole etmek için kullanılmıştır. Bu protokol UV inaktive sperm ile tüp bebek yoluyla haploid Zebra balığı embriyolarının üretimini gerçekleştirerek ile ilgili yöntemler bir kanıtıdır. Bu yöntem, vahşi tipli, transgenik ya da güçlendirici / bastırıcı taranması için mutant suşları kullanılarak yapılabilir mutasyona uğramış F1 balık, ileri haploid ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilir.
Bir haploid strateji kullanarak tarama zamanı çok diploid tarama göre kısaltılmış olsa da, yine de tamamlanması birkaç ay sürer. Biz de tarifDaha önce yatak, gelişimsel olayların herhangi bir sayı hakkında güncel bilgilere yeni katkılarda yapımında yardımcı olabilir her hangi bir haploid şemasını kullanarak bir ekran gerçekleştirerek mevcut pek çok faydaları vardır. Haploid ekran yöntemi uygun zamanda, boşluk ve gerekli olan balık sayısının azalmasına diploid tabanlı ekranlar daha resesif mutant alel tanımlanması için daha etkilidir. Ancak, haploid ekrana çeşitli tuzaklar vardır. Embriyo tek bir haploid genom ile sınırlı bir süre için yaşayabilir gibi bir haploid ekran sadece gelişiminin ilk birkaç gün içinde aktif olan genlerin mutantlar tespit edebilirsiniz. Daha sonra gelişme olarak ifade edilmiştir genler bir diploid ekran gibi farklı bir yöntem ile tespit edilmesi gerekir. Ayrıca, bazı organların bir haploid organizma düzgün gelişmez. Mutasyon haploit tarama tekniği ile kaçırılmaması neden olabilir anatomik anormallikler, ya da gelişim gecikmiş bir zaman olabilir. Benn Ayrıca, bazı balık türleri, bir haploid durumda 15 de gelişmez. Haploids Bir embriyolar ekseninde kusurları ile embriyolar belirlemek için en normal, B olmak, iyi, orta ve kötü embriyonik özelliklerin bir derecelendirme dizi kategorize edilebilir, ancak net bir kafa ve kuyruk, ve C / D tanınmaz ile embriyolar belirtmek için özellikleri (sarısı topları üstüne hücreleri kitleler) 15,17. Bu kategoriler içinde embriyo oranları belirli genetik geçmişleri 15,17 daha yaygın daha kaliteli haploidlerin sayısının artması ile, zebra balığı zorlanma göre değişir. Bu faktörler nedeniyle, bu mutagenez ve daha sonra haç gerçekleştirmek için zebrabalıkları uygun bir gerginlik bulmak için gereklidir. Bizim son deneyim, vahşi tip Tübingen suş taranması için geçerli haploidler üretilmiş (Şekil 3 ve 4'te gösterildiği gibi) tarihsel Zebra balığı araştırmacılar haploid experim için AB veya AB * suşları kullanılmıştır olsaentation 15.
Bu yukarıda sözü edilen sorunlara ek olarak, tüm prime yetişkin dişiler zebrabalıkları sıkıştırıcı teknik performans üzerine bir kavrama üretecektir. Örneğin, TRK-mutagenized Tübingen gerginlik kadın ile çalışan, tüm kadınların yaklaşık yarısı sıkma üzerine bir debriyaj üretilen ve bunlardan bazıları fraksiyonu (genellikle% 10-30) kötü embriyo kalitesi vardı veya döllenmiş olamazdı. Böylece, bir haploid ekran gerçekleştirmek için bir Genomların istenilen sayıda (her kadın bir genom ekranlı temsil) elenmesi gereken en az iki katı kadar balık yükseltmek için planlamanız gerekir. Tahlil haploid durumuna müsait olursa olsun bu göz bölgesinin büyük bir hayvan imkan vermeden genomlarının sayıda karşılamak için tarama haploid yönteminin avantajları gerçekten oldukça önemlidir. Bununla birlikte, aynı zamanda kavrama haploid tanımlanan mutasyon (lar) ın daha da başarılı bir şekilde çalışma yükselterek tam olarak bağımlı olduğu unutulmamalıdırdişi kurucusu n outcross. Herhangi bir ekranda olduğu gibi, diploid devlet yeniden tespit edilmelidir başlangıçta tarama sürecinde tespit 'vurur'.
Haploid ekranını kullanarak tuzaklar rağmen, bilim alanında 15 anlayışlı kazançlar ile derinlemesine analiz edilmiştir mutantlar, tanımlamada çok başarılı olduğu gösterilmiştir. Haploid ekranlar omurgalı gelişme diğer anlaşılamamıştır süreçlerini araştırmak için uygulanabilir. Arttırıcı ve baskılayıcı ekranlar için haploidler kullanma faaliyetleri ve ilgi bir genin düzenleyici ağın içine daha fazla fikir edinmek için bir yoldur. Haploid tarama tekniği de artırıcılar ve zaten, kimyasal ya da sokma mutajenez gibi yöntemlerle izole edilebilir veya genetik geri işlenmesinde veya TALENS gibi yaklaşımlar edilmiş mutantlar bastırıcıları belirlemek için kullanılabilir. Kısaca, daha önce izole edilmiş mutant TRK ile mutasyona uğratılmış olabilir ve arttırıcılar ya da S için taranmıştırOrijinal mutant fenotipinin uppressors. Mutant yetişkin aşamalarında ulaşmak gerekir, bu yüzden ancak transgenesis son gelişmeler araştırmacılar bu sorunu aşmamızı sağladı, bu ekranı gerçekleştirmek için bir heterozigot hayvan ya da zayıf bir homozigot mutant balık olması gerekir. Geliştirme yolları işlemek için nasıl Öğrenme hastalık durumlarını tedavi etmek perturbe yollarının ihtimali de dahil olmak üzere pek çok heyecan verici olasılıklara yol açabilir.
Acknowledgments
Bu çalışma aşağıdaki gelen RAW için fon tarafından desteklenmiştir: NIH hibe K01 DK083512, DP2'deki OD008470 ve R01 DK100237; Dimes Basil O'Connor Başlatan Scholar Ödülü # 5-FY12-75 Mart; Bilim ve Biyolojik Bilimler Bölümü Notre Dame College Üniversitesi'nden fonları kurmak; ve Gallagher Ailesi adına Elizabeth ve Michael Gallagher Notre Dame Üniversitesi cömert bir hediye kök hücre araştırmaları teşvik etmek. Maliyeciler çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz onların destek için Biyolojik Bilimler Bölümü kurmayları teşekkür ederiz ve bizim Zebra balığı koloni bakımı ve refahı onların üstün özveri için Notre Dame Zebra Araştırma Merkezi. Biz Şekil 4'te sunulan fotoğraf çekmek için GF Gerlach ederiz. Nihayet, biz onların yorumlar, tartışmalar ve INSIG için araştırma laboratuarında tüm üyelere teşekkürBu çalışma ile ilgili HTS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
References
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genetics. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , Humana Press. (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
