Abstract
Sebrafisk har blitt en mainstream virveldyr modell som er relevant for mange disipliner av vitenskapelige studier. Sebrafisk er spesielt godt egnet for videre genetisk analyse av utviklingsprosesser på grunn av deres ytre befruktning, embryonale størrelse, rask ontogeni, og optisk klarhet - en konstellasjon av egenskaper som gjør at den direkte observasjon av hendelser som strekker seg fra gastrulation til organogenesen med en grunnleggende stereomikroskop. Videre kan sebrafisk embryoer overleve i flere dager i det haploide tilstand. Produksjonen av haploide embryoer in vitro er et kraftig verktøy for mutasjonsanalyse, som det muliggjør identifisering av recessive mutant alleler stede i første generasjon (F1) kvinnelige bærere følgende mutagenese i foreldre (P) generasjon. Denne fremgangsmåten eliminerer nødvendigheten av å skaffe flere generasjoner (F2, F3, etc.) som innebærer avl av mutant-familier, og dermed sparer forskeren gang sammen med reduksjonsbehovene for sebrafisk koloni plass, arbeidskraft, og røkting og kostnader. Selv om sebrafisk har blitt brukt til å drive frem skjermer for de siste tiårene, har det vært en jevn utvidelse av transgene og genom redigeringsverktøy. Disse verktøyene tilbyr nå en mengde måter å lage nyanserte analyser for neste generasjon skjermer som kan brukes til å ytterligere dissekere genet regulatoriske nettverk som driver virveldyr ontogeni. Her beskriver vi hvordan du kan forberede haploide sebrafisk embryo. Denne protokollen kan implementeres for nye fremtidige haploide skjermer, slik som i Enhancer og suppressor skjermer, for å ta opp de mekanismene for utvikling for en bred rekke prosesser og vev som dannes under tidlige embryonale stadier.
Introduction
De fundamentale prosesser som orkestrere virveldyr utvikling er grovt bevart en. En effektiv måte å identifisere gener med viktige roller i utviklingen er å isolere arve mutasjoner som fører til fenotypiske defekter i prosessen med interesse. Sebrafisk, Danio rerio, er en liten ferskvann teleost arter som tilhører cyprinidae fisk familien som har blitt en mye brukt modell organisme for virveldyr utviklings genetikk i løpet av de siste tiårene to. Sebrafisk egg er befruktet eksternt, tillater adgang til zygote fra utbruddet av befruktning tre. Videre er det tidlig embryo optisk transparent, slik at visualisering av utvikling med en enkel stereomikroskop 3. Sebrafisk ontogeni er rask, med prosesser av cleavage, gastrulation, og organogenesen av mange strukturer, slik som hjerte og nyre, i stor grad fullført i løpet av første dagen av utviklingen tre. Than tid fra larvestadiet til seksuell modenhet tar 2-3 måneder, og de voksne er små virveldyr ca 3-4 cm i lengde, kan så mange fisk opprettholdes på minimal plass to. I tillegg, sebrafisk voksne har høy fruktbarhet, hvor hver fisk i stand til å produsere flere hundre embryoer pr uke 2. Disse egenskapene har gjort det tractability av sebrafisk for forover og bakover genetiske skjermer. Sebrafisk har en høy grad av bevaring i sin anatomi, cellebiologi, og fysiologi med mer avanserte arter virveldyr som pattedyr 2,4. Faktisk har nylig sekvensanalyse viste at den sebrafisk genom inneholder homologer til nesten 70% av humane gener 5. Dette bevaring har aktivert forskerne å bruke sebrafisk som modell for mange menneskelige sykdommer, inkludert både embryonale og adulte forhold 2,4. Til sammen har disse faktorene gjorde sebrafisk et utmerket system for skjermer for å identifisere gener som erviktig for normal virveldyr ontogenetiske.
En rekke store skjermer har blitt utført i sebrafisk og har identifisert flere tusen mutasjoner i utviklings gener 6-8. Sebrafisk voksen hann er mottagelig for mutagenese, og kromosom endringer kan genereres med relativt høy frekvens ved hjelp av kjemisk mutagen ethylnitrosourea (ENU) 6,7 eller retroviral innsettingen mutagenese ni. Hittil har over 9000 arvelige mutasjoner blitt opprettet, og inkluderer gener som påvirker praktisk talt alle aspekter av embryogenesis. Sebrafisk samfunnet har etablert en sentralisert bank av disse mutanter på sebrafisk International Resource Center (eller zi) 10, som har samlet ca 5000 mutant og transgene alleler fra hele verden. Mange av disse mutasjonene er blitt analysert og klonet, gir forskere på tvers av biologiske disipliner verdifull informasjon som har blitt brukt til å erte hverandre numerooss cellulære og fysiologiske trasé gjennom innsikt stammer med sebrafisk eksperimenter.
Selv om termin skjermer har identifisert en imponerende rekke viktige gener, har mye ennå å bli verdsatt om de genetiske regulatoriske nettverk som formidler et mylder av prosesser. Mange skjermer gjennomført så langt har ikke nådd et metningspunkt, og dermed fremover samt revers genetiske skjermer har vært en hjørnestein for å identifisere og analysere mekanismene for embryogenesis. Mens det er enorm innsikt som kan være hentet fra en enkelt sebrafisk mutant linje, har en viktig begrensende faktor i feltet historisk vært tidkrevende arbeid involvert i posisjonell kloning. Av denne grunn har identiteten til mange kjemisk indusert mutasjoner forble et mysterium. Men, med den nylige ankomsten av hele genomsekvensering tilnærminger som letter rask kloning 11-14, er utrolig effektiv identifikasjon av genetiske mutasjoner nå feasible.
Den prototypiske frem skjermen i sebrafisk er en diploid skjerm som kan identifisere recessive mutasjoner innen tre generasjoner 6,7 (Figur 1, venstre kolonne). Denne teknikken innebærer genererer mutasjoner i kjønnsceller av foreldre (P) mann, og deretter parre denne hanne med en vill type kvinne. Hver av den første generasjon (F1) avkom fra denne paring vil huse et eller flere unike mutasjoner på grunn av de kromosomale bidragene fra de muterte fars genomet. F1-avkom er hevet og outcrossed med vill typer å skape F2 familier. I F2 familien, vil søsken være enten villtype eller heterozygote bærere, og er incrossed tilfeldig å generere F3 clutcher som er analysert for fenotype (r) av interesse. F3 klørne til heterozygote bærere vil inneholde 25% vill type, 50% heterozygote, og 25% homozygot mutant fisk. Denne multi-generasjons screening skjema er effektiv, men en stor ulempe til dette enpproach inkluderer tiden det tar å forberede seg på skjermen: minst ett år av fisk driften alene er involvert, siden hver generasjon krever rundt tre måneder å nå seksuell modenhet. Andre begrensninger av denne typen diploid skjermen er arbeidet, plass, og kostnadene for boliger disse generasjonene.
Den haploid skjermen er en alternativ som kan benyttes til å identifisere og deretter isolere recessive mutasjoner ved hjelp av lignende strategier mutagenese 15 (fig. 1, høyre kolonne). Produksjonen av haploide sebrafisk embryoer ble først beskrevet over 30 år siden 16, og evnen av den ordinære diploid sebrafisk til å utvikle flere dager med en haploid kromosomal ploiditet har vært benyttet for en rekke genetiske studier siden denne tid. Den store fordelen med den haploide skjermen er at denne metoden ikke innebærer å heve F2 familier for å screene for recessive mutante alleler. I stedet blir de F1 generasjon kvinner evaluert forheterozygositet av recessive mutasjoner i prosessen av interesse ved å undersøke deres F2-avkom på en haploid tilstand (fig. 1, høyre kolonne). Samlet, fremgangsmåten for å skaffe haploide embryoer er relativt grei (figur 2). Etter fremstilling av de nødvendige løsninger for spermier håndtering, blir eggene oppnådd fra F1 genererings hunner ved manuell manipulering, slik som å ekstrudere (eller "presse") eggene fra magen. Når eggene er oppnådd, blir de befruktet in vitro ved eksponering for ultrafiolett (UV) inaktivert sperm. Den UV-inaktivert spermier er ute av stand til å bidra levedyktig DNA til egg på grunn av det faktum at den korte bølgelengde UV-kryssbinder fars DNA. Men sædcellene er fortsatt i stand til å utløse egg aktivitet og hendelser assosiert med Zygotic utvikling. Ved metabolsk aktivering, vil egget full meiose II, og fortsette å utvikle seg med bare den ene mordyret deponert kopi av hver chromosomeg. På grunn av dette 1N ploidy, er fosteret utsatt for den utviklingsmessige konsekvensene av en recessiv mutant allel, hvis det er til stede på et mødre kromosom. Dermed hver F2 haploid clutch vil inneholde 50% villtype og 50% mutante embryoer dersom mor er en heterozygot bærer av et fullt penetrant recessivt allel. Denne fordeling av embryonale genotyper muliggjør relativ letthet når det gjelder å vurdere en clutch for nærvær av mutant fenotype (r) av interesse. Hvis det oppdages en slik fenotype, er F1-generasjonen kvinnelige gründer senere outcrossed til villtype male sebrafisk til å opprette og heve flere heterozygote bærere. Fordi det ikke er nødvendig å heve flere generasjoner til å utføre skjermen, kan forskeren spare mye tid, arbeid og akvarium plass, men fortsatt har makt til å kartlegge et betydelig antall genomer basert på antall F1 hunner undersøkt. Dermed haploide skjermer er spesielt gjennomførbart for små laboratorier eller prosjekter initiert i fravære av betydelige midler.
Det er imidlertid flere begrensninger og ulemper til bruk av haploids. Først haploide sebrafisk embryo lever for bare noen dager, og vanligvis dør mellom tre og fem dager etter befruktning (DPF) 15. Haploide sebrafisk embryo kan skilles fra diploider basert på flere egenskaper, fremst blant dem er en kort og tettvokst kropp som likevel har normalt antall somitt segmenter 15,17. Som utviklingen skrider frem, hjernen utstillinger økt celledød og sirkulasjon er dårlig, vanligvis assosiert med blod pooling av 2-3 dpf og ødem 15,17. Videre haploids ikke klarer å pumpe opp et svømmeblæren 15,17. Uavhengig av disse morfologiske forskjeller, er de fleste store organer og vev dannet, inkludert hjerte, øye og ryggstreng 15,17. En funksjon bemerket om haploide clutcher er at de inneholder en rekke fenotyper i form av varianter av defekte embryoer og #8212; en funksjon observert over sebrafisk stammer. Derfor bør man kontrollere hvis vevet (s) og tiden severdig vise rimelig normal utvikling i villtype haploid belastning og derfor har potensial til å bli vurdert for genetiske defekter i en skjerm eller et annet forskningsprosjekt.
Til tross for disse utfordringene, har haploide skjermer blitt gjennomført med hell for å identifisere gener som er nødvendige for tidlig utviklingsprosesser i sebrafisk, og haploide protokoller har blitt godt etablert ressurser i samfunnet i mange år 15-19. Flere nylig, har prosessen med å generere haploide fiske embryoer blitt brukt av forskere for å skape haploid embryonale stamceller (ES) cellekulturer fra medaka fisk 20,21. Etter fremstilling av medaka haploide embryoer in vitro, ble embryoene som brukes til å utlede primære cellekulturer som ble passaged i omtrent 15 uker, etterfulgt av ytterligere 5-8 uker for å generere rene kloner av haploide celler medES celleegenskaper 15-19. Den generasjonen av fisk haploide ES cellelinjer innehar bred tidig løftet for å analysere recessive fenotyper i virveldyr celle linjene, og representerer en ny tilnærming for genetiske analyser i de kommende årene. Dermed har den generasjonen av haploide fiskeembryoer voksende applikasjoner i biomedisinsk forskning samfunnet. Denne videoen artikkelen gir en visuell demonstrasjon av trinnene involvert med å produsere haploide sebrafisk embryo in vitro ved hjelp av UV-inaktivert sperm basert på etablerte protokoller 15-19,22.
Protocol
MERK: Prosedyrene for å jobbe med sebrafisk embryo som er beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Notre Dame. MERK: Selv om følgende protokoll gir en demonstrasjon av sperm isolasjon som innebærer aktiv dødshjelp av hanner, sperm kan samle fra genital pore av bedøvet levende male sebrafisk ved hjelp av milde buktrykket og en microcapillary for sperm samling 17,18. Klemme av levende hanner krever flere menn som skal brukes for å samle den tilsvarende mengde av sædceller som kan fås fra en avlives hann 17,18. Men menn som har gjennomgått klemme fortsatt ganske sunt og kan brukes til naturlige parringer eller påfølgende in vitro prosedyrer 17. Når det er mulig, bør utvalgte prosedyrer minimere unødvendig fisk offer.
En. Utarbeidelse av løsninger og sebrafisk Mating Chambers
<ol>2. Disseksjon av Testikler
- Lag Hanks lageroppløsning nr. 6 ved tilsetning av friskt 0,35 g natriumbikarbonat til 10 ml destillert vann. Bland godt for å oppløse natrium-bikarbonat pulver.
- Kombiner de følgende i et rør på is for å gjøre bufret Hanks endelige arbeidsoppløsningen for spermier: 9,9 ml av Hanks Premiks I med 100 ul av stamløsning # 6.
- Bland godt, så delmengde 500 mL av Hank7, s endelige arbeidsoppløsningen inn i et mikrosentrifugerør og plasser på is. MERK: Hver 500 pl prøve vil bli brukt til å forberede sædceller fra testiklene til 4-5 mannlige sebrafisk.
- Velg mellom 4-5 male sebrafisk for hver sperm innhøsting. MERK: Dette vil høste nok sæd til å bli samlet inn, behandlet og lagret i en 1,5 ml mikro tube, som kan benyttes til å befrukte ca 15 haploide clutcher. Velg flere årskull av menn for å forberede flere rør, avhengig av omfanget av eksperimentet. Hvis den valgte mannlige sebrafisk er små eller testiklene disseksjon er ufullstendig, vanligvis fem menn vil være nødvendig.
- Avlive hver male ved hjelp av et nett for å forsiktig overføre fisken inn i en skål inneholdende 0,2% Tricaine i ca 5-6 minutter ved romtemperatur. MERK: Vær forsiktig med å sikre at hannen har blitt skikkelig avlives før start av disseksjon. Vanligvis vente flere (2-3) min etter gjellene på fisken stopper flytting og fiskener ikke lenger mottakelig for berøring.
- Plukk den mannlige opp forsiktig med en plastskje og forsiktig klatt mannlige tørr væske. Deretter fjerne hodet av den mannlige med en skarp saks og deretter klippe et snitt langs ventral midtlinjen. MERK: Fjerning av all overflødig væske fra fisken er avgjørende for å hindre utløser aktivering av sperm.
- Fjern tarmen og tilhørende gut organer fra bukhulen ved hjelp av fine tang og sted inn i en biologisk avfallsbeholder.
- Bruk fin pinsett for å fjerne prøvene, som er plassert langs ryggkroppsveggen, sideveis til svømmeblæren, og har en hvit ugjennomsiktig utseende sett under stereomikroskop. MERK: Holde testiklene intakt kan bidra til å hindre eksponering av sperm til vannbaserte kroppsvæsker, og dermed hindre for tidlig aktivering.
- Plasser testiklene inn i sperm oppløsningen på is og holde røret på is som de andre prøvene blir dissekert. Gjenta trinn 02.06 til 02.09 før alle males har blitt dissekert.
- Plasser skrottene og eventuelle gjenværende dyr vev inn i en biologisk beholder og institusjonelle disposisjon.
Tre. UV Sperm Inaktive
- Homogen testiklene ved å forsiktig slipe mikrosentrifuge tube med en steril micro stampe.
- Overfør supernatanten til en liten petriskål eller urglass på is. MERK: Du må ikke overføre vev rusk sammen med den overliggende oppløsning. Dette vil skape skygger og kompromittere UV inaktivering av sædceller.
- Skyll sperm tube med mellom 300-400 mL av ytterligere Hank Final fungerende løsning (utarbeidet i trinn 2.2 og lagret på is), og legge dette supernatant vask til den lille petriskål eller se glass i trinn 3.2.
- Eksponer fatet til UV fra en benk-lampe (254 nm) for totalt 2 min ved en avstand fra lampekilde på omtrent 15 cm (38,1 cm). MERK: Vær forsiktig når du arbeider med en UV-lampe og bære en ansiktsmaske ellerandre øyet personlig verneutstyr.
- Tilbake fatet til isen bøtte, deretter overføre UV inaktivert sperm til en frisk mikrosentrifuge tube og lagre prøven på is. MERK: På dette punktet vil det være ca 800 mL av UV inaktivert sperm for haploid clutch befruktning. Sædcellene bør holdes på is gjennom hele varigheten av tid brukt på å klemme hunner. Sperm i kald Hanks kan anvendes i opp til 6 timer, uten noen reduksjon i fertilisering utfall. Interessant nok har andre forskere rapportert at spermier i kald Hanks er levedyktig fra flere timer til flere dager 18.
4. Egg anskaffelser fra Adult sebrafisk Kvinne og in vitro-fertilisering av Clutch
- Forbered Tricaine bad for anestesi ved å kombinere 20 ml 0,2% Tricaine lager med 80 ml av fisk system vann.
- Velg den kvinnelige for egg samling, ved hjelp av et nett for å plassere henne forsiktig i formen av tricaine.
- Vent i 2-3 min før den kvinnelige er bedøvet og ikke lenger reagerer på berøring. MERK: Hvis de kvinnelige rykninger eller utløser andre bevegelser, gi henne ekstra tid til å bukke under for anestesi.
- Bruk en plastskje til å forsiktig løfte den kvinnelige, dekantering løsningen før du legger den kvinnelige på et papirhåndkle for å transportere bort overflødig væske. MERK: Vær forsiktig med å forlate ekstra løsning på den kvinnelige, som væske vil utløse egg aktivering før tillegg av sperm.
- Plasser kvinne på hennes side i en ren petriskål og visualisere magen hennes under stereomikroskop.
- Stroke kvinnens mage forsiktig i ca 10-20 sek med en eller to fingre på den ene hånden til å presse egg fra hennes underliv, i mellomtiden støtter kvinnens tilbake ved å plassere en eller to fingre fra den andre siden like bak hennes rygg kroppsveggen. MERK: Ved å stryke den kvinnelige underliv, bør eggene kommer ut veldig lett. Hvis eggene ikke dukke opp viddh lette det er ikke tilrådelig å "presse hardere 'og tvinge egg fra hunnen. Dette indikerer at egg ikke er til stede, og / eller ikke er klar for befruktning, og fortsatte å presse er forbundet med betydelig risiko for å skade den kvinnelige (f.eks deflasvømmeblæren eller forårsaker andre dødelige indre skader). Hvis en kvinne er presset, men gir ingen eller få egg, returnere den kvinnelige til dyret anlegget. Etter 1-2 uker med hvile, pare hunnen med en mann for en naturlig parring å rense ut rest egg rusk. Segregere kvinner som parre naturlig inn i en tank i ytterligere 1-2 uker med hvile før du prøver en ny klem. Alternativt, kan kvinner være uthvilt for fire uker, hvor tid de kan settes opp for naturlige parr 15.
- Bruk en fin sonde eller liten slikkepott til å øse egg ut fra under den kvinnelige og / eller hennes magen overflaten.
- Løft forsiktig kvinnelige og returnere henne til en hensiktsmessig merket isolert tank som inneholder fisk system vann. </ Li>
- Tilsett 50 pl av UV-inaktivert sperm løsning på clutch av egg, og inkuber ved romtemperatur i 30 sekunder i løpet av hvilken tid, påføre en tilsvarende etikett til fatet for å spore den med nummeret som er tilordnet den kvinnelige forelder.
- Tilsett 1 ml av E3 til eggene, og inkuber ved værelsetemperatur i 1 min.
- Legg tilstrekkelig E3 løsning for å fylle formen midtveis, og plassere embryoene ved 28 ° C for påfølgende inkubasjon. MERK: Tilsetning av penicillin / streptomycin (1% (v / v) pen-strep-løsning inneholdende 5000 enheter penicillin og 5 mg streptomycin pr ml) 19 til E3 kan hjelpe til med generell helse av de haploide embryoer.
5. Observasjon og behandling av Haploid embryo
- Etter 4-8 timer, fjerne ubefruktede embryoer fra fatet og vaske de resterende embryoer ved å erstatte E3 embryo media med fersk E3 løsning. MERK: ubefruktet embryo vil vise en hvit, ugjennomsiktig utseende eller kan vise en gjennomsiktig enppearance med en misdannet enkelt celle.
- Inkuber til ønsket tid punkt av interesse, og deretter utnytte i ønsket skjermen analysen eller annen forskning søknaden (e).
Representative Results
Produksjonen av haploide embryoer kan iverksettes for å identifisere recessive mutasjoner i F2 generasjonen når de haploids er hentet fra modne sebrafisk hunner som er avkom av mutageniserte foreldre (figur 1). Dette sparer tid og sted i forhold til den tradisjonelle diploid skjerm, der forskere trenger å heve F2 familier som diploid avkom blir deretter evaluert for fenotyper av interesse (figur 1).
De viktigste trinnene i protokollen beskrevet i trinn 1-5 ovenfor for å skaffe sebrafisk haploide embryoer gjennom in vitro fertilisering er skjematisert som et flytdiagram (Figur 2). Disse trinnene innebærer utarbeidelse av løsninger og grunning av kvinner ved eksponering for mannlige hormoner i parrings tanker (dag 1), etterfulgt av sperm og egg innkjøp og in vitro fertilisering (Dag 2), og til slutt stell av haploids (Days 3-5) (Figur 2). Når comkombinert med en genetisk skjerm, en felles mutagenese-prosedyre i sebrafisk omfatter tidligere eksponering av de mannlige sebrafisk villtype voksne for et mutagen (f.eks, i et kjemisk mutagen som ENU, selv om andre fremgangsmåter, for eksempel retroviral basert mutagenese kan implementeres som også lette kloning av det kromosomale defekt), etterfulgt av avl med vill-type hunner for å lage en mutageniserte F1 generasjon. Slike preparater kreve flere måneder med arbeid (ca 6 måneder) basert på generering tider nødvendig å oppdra vill typer, utføre mutagenese, og bak den påfølgende mutageniserte F1 15,17,22.
Et annet viktig punkt for vurdering i å bruke haploids for en skjerm er valget av sebrafisk belastning. Den AB * (AB star) belastningen har blitt godt kjent for å produsere haploide embryoer med bedre samlet egenskaper og helse enn andre stammer 15. Men i avledet Tübingen belastning avlet i vår laboraTory, har vi nylig observert embryologiske funksjoner som har aktivert vellykkede skjermer for anomalier i nyre systemet (G. Gerlach og R. Wingert, upublisert) utviklings. Voksen sebrafisk Tübingen belastningsskader hanner ble mutagenisert av en serie på tre ENU behandlinger, og deretter krysset med villtype Tübingen kvinner til å generere en F1-generasjonen for screening. F1 hunner ble presset til å hente ut egg og disse F2 egg ble befruktet med UV inaktivert sperm. Sammenlignet med diploide clutcher fremstilt av naturlige parringer av villtype Tübingen foreldre (figur 3A), embryoer i disse haploide Tübingen strekk klørne vist en kortere, tettvokst stammen karakteristisk for den haploid tilstand (figurene 3B og C). Videre haploide clutcher typisk bestå av embryo søsken som viser en rekke mangler, som vi har observert, så vel (figurene 3B, C), som er kjent til å variere innenfor stammer, som diskutert nærmere nedenfor 15,17. Tidligere studier har etablert en kanonisk gradering serien, tilsvarende karakterer fra A til D, for å kategorisere utvalget av haploide fenotype defekter 15,17, og i tillegg haploids har også blitt referert til i form av adjektivene god, middels og dårlig kvalitet 22. Grade A haploids, tilsvarende høy kvalitet haploids, som er mest vanlig i utseende, med en kort og tettvokst kroppen, men samlet viser en morfologisk utseende som ligner på diploider 15,17,22 (sammenlign diploide søsken (d) til haploid klasse A (merket A) søsken, Figur 3B). Haploide klasse A embryoer også utvikle beskjeden perikardial ødem, som er et typisk trekk ved haploid sebrafisk utvikling 15,17,22 (Figur 3B). I forhold til klasse A haploids, middels eller såkalt klasse B haploide embryoer (merket B, 3B, C) er preget av utviklingen av en ytterligere forkortet eller bøyd / twisted bagasjerommet, selv om funksjonene i et hode og hale skiller seg klart 15,17,22. Endelig karakter C eller dårlig kvalitet haploids (også nevnt i noen referanser som C / D) 15,17,22 er ekstremt defekte og vise en uorganisert masse av celler i foreningen av med en eggeplomme ball (merket C, Figur 3C). Selv blant den samme stammen, haploide clutcher variere i fordelingen av A, B, og C fenotyper som man vil observere. For eksempel er haploide clutch fra en Tübingen hunn vises bedre utvikling samlet, med stort sett A og B klasse haploid avkom (figur 3B), sammenlignet med haploids oppnådd fra et andre Tübingen hunn, hvis clutchen besto av tallrike karakter C haploid avkom samt A og B haploide fenotyper (Figur 3C). Lignende belastning variasjon av haploide embryo karakterer har tidligere blitt observert i AB og AB * belastning fisk samt 15.
Til tross for disse morphological forskjeller, organogenesen av mange strukturer fortsetter relativt normalt i haploid embryo. Selv om de har en kortere kropp bagasjerommet, utvikling av organer som øyne og hjerte er relativt lik som vill type diploide embryoer, og celletyper som for eksempel pigmentceller (Melanophores og xanthophores) kan også bli evaluert 15. I tillegg har vi nylig dokumentert at pronephros eller embryonale nyre, blir utviklet med 1 dag etter befruktning i vill type haploid, på samme måte som villtype diploider. Som bevis på dette, viser pronephros celletype mønster prototypiske mønster av segmentene (figur 4). Videre fenotypen av recessive mutasjoner som endrer pronephros utvikling, som for eksempel lib mutasjon som minsker retinsyre produksjon, viser et tilsvarende mønster i det haploide tilstand i forhold til den diploide tilstand (fig. 4) 23,24. Denne observasjonen er i tråd med det andre tilbakeslagstille på mutasjoner som fører til lignende fenotyper i både haploid og diploid tilstand, men dette er ikke alltid tilfelle med alle mutasjoner og bør holdes i bakhodet hvis evaluere denne type skjerm strategi 15.
En rekke vev og organer er vanligvis unormale i haploids. For eksempel, haploids vise defekter i sirkulasjon, ofte stiller blod pooling, som kan gjøre deres evne til å studere noen aspekter av vaskulogenese begrenset 15. I tillegg har det vært registrert at haploids kan ha uregelmessigheter i øret utvikling, slik at de kan bli vurdert for mutasjoner som hindrer otisk vesikkeldannelse helt, men ikke for mutasjoner som påvirker subtile prosesser involvert med morphogenesis av denne strukturen 15. Som et annet eksempel på dette, er hjernen morfogenese unormal i haploids, og dermed haploide skjermer for å identifisere nødvendige hjernens utvikling trasé er begrenset 15. Til tross for disse begrensningene, vår ennalysis av nyre utvikling i haploid tilstand (figur 4) legger dette organet til listen over 'silbart' embryonale strukturer. Dette funnet understreker at en haploid skjerm metodikk kan brukes til å dissekere de genetiske komponenter av nedsatt stamfar mønster og legger vekt på følelser som genial skjerm tilnærminger kan omgå begrensningene i haploid embryo ontogenetiske å avdekke verdifulle nye muterte modeller for å studere virveldyr utvikling 15.
Figur 1. Skjematisk av diploide og haploide skjerm strategier i sebrafisk-modellen. Etter mutagenese av foreldregenerasjonen, kan F1-generasjonen heves og brukes enten til å generere F2 mutant familier som brukes til å skjerme F3 generasjon i en diploid tilstand (til venstre ) eller direkte skjermened i en haploid strategi (til høyre). I en haploid skjerm, er de kjønnsmodne F1 generasjon kvinner brukt til å samle haploide F2 clutcher for genetisk analyse. Kvinnelige heterozygote bærere identifiseres dersom omtrent halvparten av F2 haploids vise en mutant fenotype (røde embryoer) sammenlignet med villtype haploide søsken (gule embryo).
Figur 2. Haploid embryo produksjon flytdiagram. Den store skritt av in vitro fertilisering for å produsere haploide embryoer blir skjematisert som oppgaver utføres på Dag 1 (rosa bokser) for å forberede sperm løsninger og prime voksen sebrafisk hunner, oppgaver utføres på Dag 2 (oransje bokser ) for å samle inn og UV inaktivere sperm, for å samle inn egg, for å befrukte eggene med UV inaktivert sperm å generere haploids, og deretter for å gjenopplive den kvinnelige mor, og finally oppgaver utføres på påfølgende dager 3-5 (gul boks) når klørne inkuberes til ønsket tidspunkt (er) for observasjon og analyse.
Figur 3.. Sammenligning av diploide og haploide Tübingen belastning sebrafisk embryo. A) Diploide villtype embryoene ble produsert av naturlig gyting og deretter inkuberes inntil ca 30 HPF. B, ble C) Haploide villtype embryoer produsert av in vitro fertilisering av clutcher innhentet fra F1 generasjon mutageniserte hunner med UV-inaktivert sperm, og inkuberes inntil ca 30 HPF. Haploids utstilt en rekke avvik i utvikling sammenlignet med diploide villtype embryoer (svarte pilspisser, d for å indikere diploid). Relativt normale haploids hadde en forkortet, mer lager kroppen analogt til gradering ordningen meden A haploid 15 (rød pilspisser, merket A), mens haploids med brutto unormalt utstilt et sterkt avkortede kroppen aksen (lilla pilspisser, merket B) som tilsvarer karakteren B, og til slutt klasse C (blå pilspisser, merket C) basert på publiserte beskrivelser 15. Alle embryoene ble fotografert live på en 2.5x forstørrelse.
Figur 4. Developmental fordelingen av celletyper som utgjør pronephros embryonale nyre organ i haploid Tübingen belastning sebrafisk. Haploide vill typer vises et normalt mønster av celletyper i den embryonale nyre struktur (øverste rad). Den embryoniske nyre består av et par av segmenterte funksjonsenheter er kjent som nephrons. Den segmenterte mønster av diskrete celletyper som finnes i nephrons kan visualiseres basert på hele fjellet
Discussion
Haploid screening er en nyttig teknikk for å oppdage viktige gener nødvendige for tidlige utviklingsstadier. Videre har dyrkning av haploide celler fra medaka fisken blitt brukt for å isolere ES-lignende cellelinjer som har tallrike forskningsapplikasjoner og potensial, noe som viser at haploide celler kan gi en verdifull tidig sted for andre typer av virveldyr genetiske studier 20,21. Denne protokollen gir en demonstrasjon av de metodene som er involvert med å utføre produksjonen av haploide sebrafisk embryo gjennom in vitro fertilisering med UV inaktivert sperm. Denne metoden kan benyttes til å utføre frem haploide skjermer med mutageniserte F1 fisk, noe som kan gjøres ved hjelp av villtype, transgene eller mutante stammer til enhancer / suppressor screening.
Selv om screening tid ved hjelp av en haploid strategi er vesentlig forkortet i forhold til diploid screening, vil det likevel ta flere måneder å fullføre. Som vi descriseng tidligere, er det mange fordeler som finnes ved å utføre en skjerm ved hjelp av en haploid skjema, som alle kan hjelpe til med å lage nye bidrag til den nåværende kunnskap om en rekke utviklingsmessige hendelser. Den haploid skjermen metoden er mer effektiv for identifisering av recessive mutante alleler enn diploide baserte skjermer på grunn av reduksjon av tid, plass, og antallet av fisk som er nødvendig. Imidlertid er det flere fallgruver til en haploid skjerm. En haploid skjermen kan kun identifisere mutanter i gener som er aktive i løpet av de første dagene av utvikling, som fosteret kan bare overleve for en begrenset tid med en haploid genom. Gener som uttrykkes senere utvikling ville trenge å bli identifisert ved en annen fremgangsmåte, for eksempel en diploid skjerm. Også er det noen organer ikke utvikle ordentlig i en haploid organisme. Det kan være anatomiske abnormiteter, eller et forsinket tidspunkt for utvikling, noe som kan føre til at mutasjonen å bli savnet av den haploide screening teknikk. Jegn tillegg trenger noen stammer av fisk ikke utvikle så vel i en haploid tilstand 15. Haploids kan kategoriseres ved en gradering rekke gode, middels og dårlige embryonale funksjoner, med et embryo som er den mest vanlige, B å utpeke embryoer med defekter i aksen, men et klart hode og hale, og C / D for å utpeke embryoer med ugjenkjennelig funksjoner (masser av celler oppå eggeplomme baller) 15,17. Andelene av embryoer innenfor disse kategoriene varierer fra sebrafisk belastning, med økt antall bedre kvalitet haploids mer utbredt i bestemte genetiske bakgrunn 15,17. På grunn av disse faktorer, er det nødvendig å finne en passende stamme av sebrafisk for å utføre mutagenese og påfølgende kors. I vår siste erfaring, den villtype Tübingen belastning produsert levedyktige haploids for screening (som vist i figur 3 og 4) om historisk sebrafisk forskere har benyttet AB eller AB * påkjenningen for haploid experimentering 15.
I tillegg til disse nevnte utfordringene, vil ikke alle primet voksen sebrafisk hunner produsere en clutch ved å utføre klemme teknikk. For eksempel, i samarbeide med NOR-mutageniserte Tübingen strekk hunner, omtrent halvparten av kvinnene gitt en clutch ved å klemme, og en fraksjon av disse (vanligvis 10-30%) var dårlig embryo kvalitet eller ikke kunne bli befruktet. Således, for å utføre en haploid skjerm må man har tenkt å innhente minst to ganger så mange fisk som er nødvendig for å screene det ønskede antall genomer (hvert dyr representerer en genomet vist). Uavhengig av denne betraktning, er fordelene ved den haploid metoden for screening for å dekke et stort antall genomer uten en massiv dyrefasilitet er faktisk ganske betydelig dersom analysen er mottagelig for det haploide tilstand. Imidlertid bør det også bemerkes at den videre undersøkelse av mutasjon (er) som er identifisert i haploide clutchen er fullstendig avhengige av lykkes med å heve enn utkrysning fra den kvinnelige gründer. Som med hvilken som helst skjerm, 'hits' i utgangspunktet identifisert i løpet av screening prosessen må re-identifisert i diploid tilstand.
Til tross for de fallgruvene ved bruk av haploid skjermen, har det vist seg å være svært vellykket i å identifisere mutanter, som er blitt analysert i dybden med innsiktsfulle gevinster til det vitenskapelige felt 15. Haploide skjermer kan iverksettes for å undersøke andre dårlig forstått prosesser av virveldyr utvikling. Bruke haploids for Enhancer og suppressor skjermer er én måte å få mer innsikt i aktivitetene og regulatoriske nettverk av et gen av interesse. Den haploid screeningteknikk kan også brukes til å identifisere forsterkere og undertrykkere av mutanter som allerede er blitt isolert ved fremgangsmåter som for eksempel kjemisk eller innsettingen mutagenese eller revers genetikk tilnærminger som tilling eller Talens. Kort sagt, kan den tidligere isolerte mutant bli mutagenisert med ENU og skjermet for Forsterker eller suppressors av den opprinnelige mutant fenotype. Mutanten må være i stand til å nå adulte stadier, slik at det er nødvendig å ha en heterozygote dyr eller en svak homozygot mutant fisken for å utføre denne skjerm, men nylige fremskritt i transgenesis har tillatt forskere å skjørt dette problemet. Lære å manipulere veier i utviklingen kan føre til mange spennende muligheter, inkludert utsiktene til perturbasjonsinnretningen trasé å behandle sykdomstilstander.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler til RAW fra følgende: NIH tilskudd K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award # 5-FY12-75; starte opp midler fra University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences; og en sjenerøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne av Gallagher Family å fremme stamcelleforskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker staber av Department of Biological Sciences for deres støtte, og Center for sebrafisk Forskning ved Notre Dame for sin enestående engasjement i omsorg og velferd for våre sebrafisk koloni. Vi takker GF Gerlach for å ta bilder som er gitt i Figur 4.. Slutt, vi takker alle medlemmer av vår forskningslaboratorium for sine kommentarer, diskusjoner og Insights om dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
References
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genetics. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , Humana Press. (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
