Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

Published: August 29, 2014 doi: 10.3791/51709
Automatic Translation
1, 1
1Energy, Mining and Environment, National Research Council Canada

Abstract

أحد الأسئلة الرئيسية في علم البيئة الميكروبية هو "من هناك؟" يمكن الإجابة على هذا السؤال باستخدام أدوات مختلفة، ولكن واحدة من معايير الذهب طويلة الأمد هو تسلسل amplicons 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الجينات التي تولدها مستوى المجال PCR ردود الفعل من تضخيم الحمض النووي الجيني. تقليديا، تم تنفيذ ذلك عن طريق الاستنساخ وسانجر (الكهربائي الشعرية) تسلسل amplicons PCR. ظهور الجيل التالي من التسلسل وتبسيط بشكل كبير وزيادة عمق التسلسل ل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين. إدخال التعاقب الفوق يسمح الآن مختبرات صغيرة لأداء لهم 16S الرنا الريباسي التسلسل في المنزل في غضون أيام. هنا، هو مفصل نهجا ل16S الرنا الريباسي amplicon الجين تسلسل باستخدام الفوق الجيل القادم من المنظم. يتم تضخيم الحمض النووي البيئي أولا بواسطة PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على محولات التسلسل والباركود. ثم تقترن لهم جسيمات كروية عبر مستحلب PCR. الجسيمات هي ليترoaded على رقاقة يمكن التخلص منها ويتم إدخال الشريحة في الجهاز التسلسل وبعد ذلك يتم إجراء التسلسل. يتم استردادها في شكل تسلسل fastq وتصفيتها ويتم استخدام الباركود لإنشاء عضوية عينة من يقرأ. وتصفيتها واهمال يقرأ ثم يتم تحليلها باستخدام الأدوات المتاحة علانية. تحليل المثال حيث يقرأ صنفت مع خوارزمية تقصي التصنيف ضمن حزمة البرامج وتعطى Mothur. الطريقة الموضحة هنا هو بسيطة وغير مكلفة واضحة وينبغي أن تساعد مختبرات صغيرة للاستفادة من الثورة الجينومية الجارية.

Introduction

التسلسل ميتاجينومية هي تقنية قوية جدا لأنها تستهدف مجمل المعلومات الوراثية الموجودة في عينة بيئية. هناك نكهات مختلفة من التسلسل ميتاجينومية، بما في ذلك التسلسل بندقية والمكتبات واسع إدراج وamplicon التسلسل. Amplicon تسلسل يوفر ميزة كونها غير مكلفة نسبيا وسريعة وقادرة على انتاج يقرأ من منطقة الجينومية واحدة يمكن الانحياز عموما. بالإضافة إلى ذلك، سير العمل لتحليل البيانات amplicon التسلسل وموحدة في الغالب. ولكن بما أنه يقوم على PCR، فإنه لديه كل التحيزات المتعلقة بخصوصية كاملة، تغطية ناقصة ويتحيز التمهيدي 1،2، مما يجعل هذا النهج شبه الكمي في أحسن الأحوال. العديد من المناطق الجينومية يمكن استهداف للالتسلسل amplicon بما في ذلك الجينات الوظيفية، ولكن الخيارات الأكثر شعبية هي استخدام الجينات علامة مثل الجينات 16S الرنا الريباسي لإنشاء ملف تعريف المجتمع. تقليديا، الجينات 16S الرنا الريباسي amplicon sequeوقد أجريت ncing خارج باستخدام تقنيات كثيفة العمالة التي شملت الاستنساخ في E. القولونية، قطف مستعمرة واستخراج بلازميد تليها سانجر تسلسل على البلازميدات معزولة، وبالتالي تحليلها معظم الدراسات أقل من 100 استنساخ لكل عينة. جلبت الجيل المقبل من التسلسل اثنين التقدم رئيسية: الموازاة الهائل من ردود الفعل التسلسل، والأهم من ذلك، فصل النسيلي من القوالب دون الحاجة لادخال شظايا الجينات في مضيف. وهذا تبسيط كبير تسلسل الجينات 16S الرنا الريباسي amplicons، الذي هو الآن يعود إلى ميزة الروتينية العديد من الدراسات علم الأحياء الدقيقة البيئي، مما أدى إلى "النهضة" ل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين amplicon 3.

منذ ظهور روش 454 تسلسل 4 في عام 2005، ظهرت عدة تقنيات الجيل القادم التسلسل الأخرى في السوق (على سبيل المثال، البورشيد، الصلبة، PacBio). في الآونة الأخيرة، وإدخال تسلسل مقعد بين كبارجلبت التمرير إلى مختبرات صغيرة القدرة التسلسل حكرا على مراكز التسلسل كبيرة. هي خمس آلات الفوق المتاحة حاليا: 454 GS جديد، وايون سيل آلة الجينوم الشخصية (PGM)، وبروتون، والبورشيد MiSeq وNextSeq 500. حين أن جميع هذه التعاقب تقدم أقل يقرأ في تشغيل وقواعد أقل لكل دولار من معظم بالدوام الكامل التعاقب النطاق، فهي أكثر مرونة، وسرعة، وانخفاض اقتناء وتشغيل تكاليفها يجعلها في متناول المختبرات الأكاديمية الصغيرة. بشكل خاص مناسبة التعاقب الفوق جيدا لamplicon، الجينوم صغيرة ومنخفضة التعقيد metagenome التسلسل في دراسات علم الأحياء الدقيقة البيئية، لأن هذا النوع من الدراسات عموما لا يحتاج إلى عمق المدقع من التسلسل. على سبيل المثال، فإنه من المتفق عليه عموما أن لل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين يدرس عدد من يقرأ لكل عينة ليست قصوى، و~ 1،000 يقرأ يمكن أن تولد نفس أنماط وعدة ملايين من يقرأ مجموعات البيانات 5. أما وقد قلت ذلك، الفوق المقبل generatio ن التعاقب تزال تولد كميات كبيرة من البيانات تسلسل، مع عائدات القصوى ل~ 35 م ب ب (454 GS جديد)، ~ 2 جنيها استرلينيا (ايون السيل PGM)، ~ 10-15 جنيها استرلينيا (ايون سيل بروتون)، ~ 10 جنيها استرلينيا (البورشيد MiSeq) و~ 100 جنيها استرلينيا (البورشيد التالي تسلسل 500)، والتي هي أكثر من كافية لمعظم دراسات علم الأحياء الدقيقة البيئية.

الجيل المقبل من تسلسل amplicons 16S الرنا الريباسي باستخدام التعاقب الفوق تم تطبيقها مؤخرا إلى مجموعة واسعة من البيئات. على سبيل المثال، تم استخدام ايون السيل PGM المجتمع لتحليل مخلفات منجم اليورانيوم الذي كان درجة الحموضة العالية والمنخفضة خاصة نفاذية 6، من إعادة تدوير نظم الاستزراع 7 من التربة الملوثة النفط والغاز في القطب الشمالي 8،9، التعدين رواسب الرمال النفطية المتضررة و الأغشية الحيوية من نهر أثاباسكا 10،11 من الجذور لالصفصاف المزروعة في التربة الملوثة 12، الهيئات الإنسان والحيوان و13-16 من الهضم اللاهوائي 17.

jove_content "> وفي هذه المساهمة التفاصيل نحن نهجنا في تسلسل الجينات 16S الرنا الريباسي amplicons في المنزل باستخدام الفوق الجيل القادم من المنظم (لايون السيل PGM)، وبعد استخراج الحمض النووي والجينات 16S الرنا الريباسي وتتضخم باستخدام بادئات البكتيرية مستوى المجال التي تحتوي على محولات التسلسل وفريدة من نوعها، متواليات عينة محددة (الباركود)، ويتم تنقية amplicons، كميا والمجمعة في نسبة متساوي المولية. ثم يتم تضخيم هذه العينات المجمعة clonally في مستحلب PCR والتسلسل. ويتم تحليل تسلسل الناتجة باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة للجمهور ( على سبيل المثال، Mothur).

Protocol

1. 16S الرنا الريباسي جين Amplicon مكتبة التحضير من قبل أسلوب الانصهار

  1. ذوبان الجليد الاشعال (مهاجم، F343-IONA-MIDXX: 5'- CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG الفريق الاستشاري GCA GCA G-3 '؛ عكس، R533-IonP1: 5'- CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 '؛ جريئة: محولات محددة ايون سيل، المائل: مفتاح التسلسل لمعايرة كثافة إشارة في بداية المدى التسلسل؛ الخط عادي: الاشعال قالب معين؛ X ... X: 10 BP الباركود، انظر الجدول رقم 1 لبعض متواليات الباركود)، ومزيج الرئيسي 2X HotStartTaq زائد والعينات. تخلط جيدا قبل الاستخدام، باستثناء مزيج الرئيسي الذي ينبغي أن تكون مختلطة بلطف.
  2. إعداد مزيج PCR (20 ردود الفعل ميكرولتر) مع 0.5 ميكرومتر من التمهيدي العكسي، 0.4 ملغ / مل من مصل بقري Albumine (BSA) و1X HotStartTaq زائد مزيج الماجستير. إضافة 18.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى البريدمنظمة العمل ضد الجوع PCR أنبوب.
  3. إضافة التمهيدي إلى الأمام (0.5 ميكرولتر في 20 ملم) مع الباركود مختلف لكل من العينات التي سيتم التسلسل معا. إضافة 1 ميكرولتر من العينة (1-10 نانوغرام / ميكرولتر) إلى أنبوب PCR.
  4. وضع أنابيب في جهاز PCR وتشغيل البرنامج التالي: تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. 25 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ استطالة النهائية في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يمكن أن تظل المنتجات PCR في 4 درجات CO / N أو المجمدة حتى استخدامها.

2. Amplicon تنقية، الكمي وتجميع

  1. إعداد agarose هلام 2٪ باستخدام أكبر أمشاط المتاحة. إضافة 5 ميكرولتر من هلام صبغ 6X تحميل للتفاعل والحمل على هلام، وفصل كل عينة من بئر فارغة. تشغيل هلام في 70 V لمدة 50 دقيقة.
  2. التقاط صورة من هلام وقطع العصابات (حجم المتوقع حوالي 250 BP: 190 المنتج بي بي بي بي زائد 63 محولات والباركود) باستخدام مشرط نظيفة.
    3. مثل Qiaquick جل استخراج عدة).
  3. تحديد كل منتج PCR مع PicoGreen وجعل التخفيفات للحصول على محلول المخزون في 5 × 10 9 جزيئات / ميكرو لتر (حوالي 1 نانوغرام / ميكرولتر). إذا أظهرت بعض العينات أقل التضخيم، وضبط التخفيفات إلى تركيز أقل، مع الأخذ في الاعتبار أن أقل تركيز مناسب لإجراءات لاحقة هو 1.57 × 10 7 الجزيئات / ميكرولتر (26 م).
  4. تجمع 10 ميكرولتر من كل منتج PCR المخفف للحصول على حمام سباحة متساوي المولية من العينات. تعد واحدة تجمع منفصل لكل من المدى تسلسل المخطط لها. يمكن أن تظل المنتجات PCR المجمعة في الثلاجة حتى استخدامها.

3. مستحلب PCR وتسلسلها

  1. أداء مستحلب PCR:
    1. تمييع المنتجات PCR المجمعة إلى 26 مساء في حجم التداول 25 ميكرولتر. الكواشف ذوبان الجليد من قالب مجموعة ايون PGM.
    2. تحضير مستحلب PCR مزيج (الكواشف المنصوص عليها في عدة) في غطاء PCR وإضافة منتجات PCR تجميع الجسيمات والمجال (المقدمة) على مقاعد البدلاء. تخلط جيدا ويضاف الخليط في خرطوشة فلتر وأعلى بعناية مع زيت مستحلب (المقدمة).
    3. عكس ببطء خرطوشة فلتر والحمل على مستحلب الآلي جهاز PCR (مثل ايون بلمسة واحدة 2 الصك). اختيار البرنامج المناسب والبدء في الإجراء.
  2. بعد مستحلب الآلي أكملت PCR، وإزالة طاف من أنابيب جمع واسترداد الجسيمات المجال في الجزء السفلي من الأنابيب. Resuspend والمجالات في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (المنصوص عليها في عدة) واتخاذ قسامة 2.0 ميكرولتر لمكتبة الكمي.
  3. أداء الكمي المكتبة.
    1. مزيج 100 ميكرولتر من SSPE العازلة (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 10MM نابو 4، 1MM نا 2 -EDTA) مع 2 ميكرولتر من محول B 'فام (5'- FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG AGG GAT-3 ') التحقيق و 2 ميكرولتر من محول A-Cy5 (5'- Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3') التحقيق. إضافة 52 ميكرولتر من هذا الخليط إلى قسامة 2.0 ميكرولتر اتخذت في الخطوة 3.2 وإضافة 2 ميكرولتر من محلول الغسيل (من عدة قالب) إلى 52 ميكرولتر المتبقية كما فارغة لالكميات.
    2. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. نقل الخلائط في 1.5 مل أنابيب.
    3. إضافة 1.0 مل من العازلة تكس (10 ملي تريس، 1 ملم EDTA، 0.01٪ تريتون X-100، ودرجة الحموضة 8.0)، ومزيج الطرد المركزي في 15،500 x ج لمدة 3 دقائق في RT. إزالة طاف وترك 20 ميكرولتر في كل أنبوب. كرر هذا الإجراء الغسيل مرتين.
    4. إضافة 180 ميكرولتر من العازلة تكس، resuspend والجسيمات مكعبات ونقل إلى أنابيب 500 ميكرولتر و qubit.
    5. قياس مضان لFAM وCy5 باستخدام جهاز و qubit وحساب نسبة من المجالات الإيجابية باستخدام آلة حاسبة المتاحة على موقع ايون المجتمع.
  4. إثراء تبقى من الجسيمات المجال للمجالات الإيجابية (التي تحتوي على الحمض النووي تضخيم) باستخدام نظام تخصيب الآلي (مثل ايون بلمسة واحدة نظام التخصيب).
    1. الكواشف الماصة في الآبار الملائمة للقدم الشريط 8 جيدا: حسنا 1: الجسيمات المجال من الخطوة 3.2. حسنا 2: قبل غسلها الخرز MyOne Streptavidin C1 (13 ميكرولتر). حسنا 3 و 4 و 5: حل غسل (المنصوص عليها في عدة القالب). حسنا 6: فارغة. حسنا 7: تذوب قبالة حل (125 ملي هيدروكسيد الصوديوم، 0.1٪ توين 20)؛ حسنا 8: فارغة.
    2. تثبيت طرف على الذراع وpipetting لأنبوب 0.2 مل لجمع العينات. بدء الصك. في نهاية التخصيب، إضافة 10 ميكرولتر من تحييد الحل (المقدمة). حبات المخصب يمكن أن تظل على 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 15 يوما.
  5. تهيئة أداة التسلسل:
    1. الاتصال الصك التسلسل وإعداد خطة المدى التسلسل، مع تحديد تفاصيل المدى التسلسل.
    2. تركيبهلتر من محلول الغسيل # 2 (المنصوص عليها في عدة التسلسل ايون PGM)، والحل غسل # 1 (350 ميكرولتر 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم) والحل عازلة لصناعة السيارات في درجة الحموضة (المقدمة).
    3. بدء إجراءات التهيئة وعند المطالبة بإضافة dATP، dGTP dCTP والنيوكليوتيدات dTTP (المقدمة) في كل منها 50 مل أنابيب. المسمار الأنابيب على الجهاز التسلسل والاستمرار في إجراء التهيئة. عند اكتمال التهيئة، بدء تشغيل الإجراء فورا.
  6. تحضير عينات للتسلسل وتحميل رقاقة:
    1. جمع المجالات المخصب من الخطوة 3.4 في الجزء السفلي من الأنبوب بواسطة الطرد المركزي في 15،500 x ج لمدة 1.5 دقيقة. إزالة طاف ترك بالضبط 3 ميكرولتر.
    2. إضافة 3 ميكرولتر من التمهيدي التسلسل (المنصوص عليها في عدة التسلسل)، مزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا ل resuspend الجسيمات. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من البلمرة (المقدمة)، تخلط جيدا وincubيأكلون في RT لمدة 5 دقائق. المضي قدما لتحميل خليط انزيم المجال على رقاقة التسلسل في غضون 30 دقيقة.
    4. أثناء الحضانة، تحميل رقاقة التسلسل على المنظم وإجراء فحص الجودة رقاقة. إزالة السائل من رقاقة بواسطة الطرد المركزي وتحميل العينة في الشريحة بواسطة pipeting ببطء مزيج انزيم المجال (7 ميكرولتر) وتجنب إدخال فقاعات في رقاقة.
    5. أجهزة الطرد المركزي رقاقة ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة في microcentrifuge. تغيير اتجاه الشريحة في كل الطرد المركزي وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا بين كل شوط.
    6. تحميل رقاقة في الصك وبدء التشغيل.

تحليل 4. الأساسية تسلسل البيانات

  1. الاتصال بخادم بيانات التسلسل وتحميل الملف fastq. إنشاء "oligos" ملف المفصول تحتوي على التمهيدي والباركود المعلومات (انظر المثال في الجدول رقم 1). تحميل الملفات المرجعية Greengenes من الفحص السنويحور الموقع ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
  2. إطلاق Mothur وإجراء تحليلات:
    1. تحويل الملف fastq إلى FASTA وملف الجودة باستخدام الأمر التالي: fastq.info (fastq = test.fastq)
    2. تحديد عضوية المجموعة من كل تسلسل وتقليم تسلسل باستخدام الأمر التالي: trim.seqs (FASTA = test.fasta، oligos = barcode.txt، qfile = test.qual، qwindowaverage = 20، qwindowsize = 50، minlength = 150، keepforward = T)
    3. مختلف الخيارات يمكن تعديلها وفقا لالتشدد المطلوب
    4. تصنيف متواليات في التصنيف greengenes باستخدام الأمر التالي: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta، طريقة = وانغ، مجموعة = test.groups، قالب = gg_99_otus.fasta والتصنيف = gg_99_otus.tax، قطع = 50)

Representative Results

بعد تنقية على هلام، مع 25 دورات PCR التضخيم، منتجات التضخيم عادة بتركيز 0،2 حتي 10،0 نانوغرام في 50 ميكرولتر من المياه. و يمكن أن يختلف على نطاق واسع اعتمادا على تركيز الحمض النووي بدءا، ونوع العينة وعدة تنقية المستخدمة. فمن المستحسن أن إبقاء عدد دورات PCR إلى ادنى حد ممكن لتجنب تشكيل الوهم وتقليل التحيز التضخيم، مع الأخذ في الاعتبار أن جميع العينات يجب تضخيم باستخدام نفس العدد من الدورات. لتقليل عدد بولكلونل يقرأ والمجالات الفارغة وزيادة عدد من يقرأ، يجب أن تكون نسبة و qubit بين 0.1 و 0.3 و يجب أن يكون FAM مضان فوق 200. باستخدام رقاقة 314 على ايون السيل PGM، وبلغ متوسط ​​الانتاج حوالي يقرأ 0.3-0.5 M ذات نوعية جيدة بعد تصفية النتائج في Mothur. ويبين الجدول 2 توزيع نموذجي لعدد من يقرأ بعد كل خطوة من الإجراءات لتشغيل تحتوي على 36 البيئى المضاعفةعينات العقلية ضخمت مع الاشعال تستهدف المنطقة V3-4 من 16S وتحليلها باستخدام Mothur. في Mothur، الإجراء trim.seqs تولد "* .trim.fasta" الملف الذي يحتوي على متواليات التي مرت المرشحات جودة و"* .scrap.fasta" الذي يحتوي على متواليات التي لم يمر على مرشحات الجودة جنبا إلى جنب مع السبب الرفض في رأس التسلسل. عند إمداده الباركود في "oligos" الملف، وهذا الأمر أيضا إنشاء ملف "* .groups" الذي يحتوي على عضوية مجموعة كل تسلسل على أساس تسلسل الباركود. الإجراء classify.seqs يولد ".tax.summary" التي يمكن فتحها في Excel. يحتوي هذا الملف على ملخص للانتماء التصنيفية (في خطوط) لكل من العينات (في الأعمدة). يمكن استخدام هذا الملف للتحليلات الإحصائية والمصب لتصور تركيبة المجتمع على المستويات التصنيفية المختلفة. يحتوي على ".taxonomy" ملف للتصنيف مفصلالانتماء لكل التسلسل. يظهر متوسط ​​تكوين المجتمع على مستوى بعائلة / فئة عبر جميع العينات 36 في الشكل رقم 1.

الشكل 1
الرقم 1. متوسط ​​تكوين المجتمع على مستوى بعائلة / فئة في جميع العينات.

الباركود
إلى الأمام TACGGRAGGCAGCAG
الباركود CTAAGGTAAC Sample01
الباركود TAAGGAGAAC Sample02
AAGAGGATTC Sample03
الباركود TACCAAGATC Sample04
الباركود CAGAAGGAAC Sample05
الباركود CTGCAAGTTC Sample06
الباركود TTCGTGATTC Sample07
الباركود TTCCGATAAC Sample08
الباركود TGAGCGGAAC Sample09
الباركود CTGACCGAAC Sample10

الجدول 1. مثال "oligos" ملف للاستخدام في Mothur.

# من يقرأ ٪ من الخطوة السابقة متوسط. لكل عينة
عدد الآبار 1262519 - 35،070
الآبار مع الخرز 1114108 88.20٪ 30،947
الخرز مع القوالب 1112746 99.90٪ 30،910
الخرز وحيدة النسيلة 826805 74.30٪ 22،967
يقرأ نوعية جيدة (إخراج من المنظم) 782204 94.60٪ 21،728
تمرير Mothur مرشحات (دقيقة. متوسط ​​درجة جودة 20 على نافذة 50bp، دقيقة. طول 150bp) 372168 47.60٪ 10،338
تصنف على مستوى بعائلة في GreenGenes (50٪ عتبة الثقة) 342171 91.90٪ 9،505
تصنف على مستوى الأسرة في GreenGenes (50٪ عتبة الثقة) 316512 92.50٪ 8،792
تصنف على مستوى جنس في GreenGenes (50٪ عتبة الثقة) 289899 91.60٪ 8،053

الجدول 2. عدد يقرأ تنتج من تشغيل نموذجي لمدة 36 العينات البيئية المضاعفة على واحد ايون سيل 314 رقاقة.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا واضح وصريح وغير مكلفة، ويجب أن تسمح العديد من المختبرات للوصول إلى السلطة من التسلسل ميتاجينومية. على الرغم من أنه يختلف تبعا لمنصة تسلسل المستخدمة، مرة واحدة هي التي شيدت المكتبات مطلوب القليل جدا من التدريب العملي في الوقت المحدد، مع أكثر من عملية يجري المؤتمتة. لمنصة تسلسل المستخدمة هنا (ايون السيل PGM)، يمكن تنفيذ الإجراء الكامل في غضون يومين من العمل. في لحظة الكتابة (سبتمبر) 2013، كانت تكاليف كاشف المتعلقة المثال المفصلة أعلاه كما يلي: PCR التضخيم من 36 عينة: 25 دولارا، تنقية جل وPicoGreen DNA الكميات من 36 عينة: $ 125، مستحلب PCR لعينة واحدة amplicon المجمعة : 150 دولار والكواشف التسلسل: 250 دولار، أي ما مجموعه 550 دولار أو 15 دولارا للعينة أو 0،0015 $ لكل تصفيتها جودة القراءة. هذا السعر لا يشمل العقد أداة الخدمة، وانخفاض قيمة الصك، راتب فني واستخدام مساحة المختبر.

خيمة "> واحدة من الخطوات الأكثر أهمية هو أن تجمع جميع المنتجات في نسبة متساوي المولية، من أجل استرداد عدد مماثل من يقرأ لكل من العينات. تم استخدام PicoGreen الكمي هنا، ولكن أساليب أخرى قد تكون مناسبة، وإن كان أقل دقة (على سبيل المثال، القياس الكمي للأشعة فوق البنفسجية، الكمي القائم على هلام)، وحتى عن طريق القيام بما الكمي الأكثر دقة وتجميع، هناك بعض التباين في عدد من يقرأ لكل عينة، وعلى المدى نموذجي مفصل في الجدول 2، ويتراوح من 4،380 إلى 32،750 يقرأ، بمتوسط ​​10،338 يقرأ، وإذا معالجة عدد كبير من العينات (أكثر من 40-50)، عمود واحد تنقية هلام يمكن الاستعاضة عن تنقية هلام في لوحة أو تنقية باستخدام الخرز مع قطع حجم صرامة (مثل حبات AMPure) .

حتى الآن، الجيل المقبل من تكنولوجيا التسلسل الأكثر استخداما لهذا الجين 16S الرنا الريباسي هي 454. وايون سيل تكنولوجيا التسلسل المستخدمة في هذا البروتوكول هو المفهوم مشابهة جداإلى 454 وكلا التقنيتين عرضة لنفس النوع من الأخطاء التسلسل. ليس من المستغرب، أنه قد تبين أنه ايون سيل التسلسل أسفرت نتائج التسلسل مشابهة جدا ل454 تسلسل 10. في الآونة الأخيرة، واستكشفت العديد من الباحثين استخدام التكنولوجيا البورشيد لل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين amplicon 18،19. في أي حال، سيكون من السهل على التكيف مع البروتوكول الحالي للالتعاقب الفوق أخرى مثل MiSeq البورشيد أو 454 GS جديد عن طريق تغيير تسلسل الانصهار التمهيدي لتتناسب مع المحولات والباركود اللازمة لهذه التقنيات التسلسل، كما في طريقة وصفها مؤخرا لالبورشيد MiSeq 19. بدلا من ذلك، يمكن للباحثين تتبع الخطوات 1 و 2 من بروتوكول مفصلة هنا وإرسال amplicons المجمعة إلى مركز التسلسل حيث سيتم تنفيذ مستحلب PCR وتسلسلها.

الجينات 16S الرنا الريباسي يقرأ وقلص وتصنيفها باستخدام Mothur، ولكن العديد من التحليلات الأخرى لا يمكن أن يؤديها علىamplicons الجين 16S الرنا الريباسي. على سبيل المثال، والتنوع بيتا يمكن تقييمها عن طريق حساب المسافات بين كل زوج Unifrac عينة باستخدام الإجراء المذكورة في http://unifrac.colorado.edu/ 20. ويمكن حساب مؤشرات التنوع ألفا وعدد الوحدات التصنيفية التشغيلية من كل عينة باستخدام أدوات داخل QIIME مثل AmpliconNoise 21 أو باستخدام الإجراء حددها HUSE آخرون 22 والمتاحة داخل Mothur.

الاشعال المستخدمة هنا ضخمت مناطق متغيرة 3 و 4 من الجينات 16S الرنا الريباسي، ولكن يمكن أن استهدفت العديد من المناطق الأخرى. في الدراسة الحالية، تم تضخيم الجينات 16S الرنا الريباسي من المواد النباتية وجاء اختيار التمهيدي لتجنب التضخيم من بلاستيدات الخضراء 16S الرنا الريباسي الجينات 23،24. هناك طائفة واسعة من الاشعال الأخرى المتاحة التي تختلف من حيث طول المنتج، والطاقة التصنيفية وفائدة 25،26. ولكن في جميع الحالات 200-400 BP يقرأ من الجينات 16S الرنا الريباسي لا يمكن تصنيفها بشكل موثوق على مستوى الأنواع، والتحليلات تقتصر على جنس والمستويات التصنيفية أعلى. جينات أخرى قد تكون أكثر ملاءمة إذا كانت هناك حاجة المعلومات على مستوى الأنواع، مثل cpn60 وrpoB الجينات 27،28. قطرات جذرية في المستقبل في تكلفة تسلسل وزيادة قوة الأدوات التحليلية قد تجعل من المجدي استبدال 16S الرنا الريباسي تسلسل الجين بواسطة metagenomics بندقية، ولكن حتى ذلك الحين يبقى 16S الرنا الريباسي تسلسل الجين المعيار الذهبي علم الأحياء الدقيقة البيئي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ion 314 Chip Kit v2 Life Technologies 4482261
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 Life Technologies 4482006
Ion PGM Template OT2 200 Kit Life Technologies 4480974
HotStarTaq Plus Master Mix Kit Qiagen 203646
Primers and probes IDT NA
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
BSA 20 mg/ml Roche 10,711,454,001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
  2. Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
  3. Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
  4. Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
  5. Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
  6. Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
  7. Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
  8. Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
  9. Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
  10. Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
  11. Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
  12. Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
  13. Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
  14. Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
  15. Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
  16. Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
  17. Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
  18. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
  19. Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
  20. Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
  21. Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
  22. Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
  23. Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
  24. Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
  25. Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
  26. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
  27. Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
  28. Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 90، Metagenomics، البكتيريا، 16S الريباسي الجينات RNA، Amplicon التسلسل، الجيل التالي من التسلسل، التعاقب الفوق
الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanschagrin, S., Yergeau, E.… More

Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons. J. Vis. Exp. (90), e51709, doi:10.3791/51709 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter