Summary

Generasjon og rensing av menneske INO80 Chromatin remodeling komplekser og Subcomplexes

Published: October 23, 2014
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for generering og rensing av villtype og muterte versjoner av det menneskelige INO80 kromatin ombygging kompleks. Epitop merket versjoner av INO80 subenheter blir stabilt uttrykt i HEK293-celler og komplett komplekser og komplekser som mangler spesifikke sett av underenhetene blir renset ved immunoaffinitets-kromatografi.

Abstract

INO80 kromatin remodeling komplekser regulere nucleosome dynamikk og DNA tilgjengelighet ved katalyserende ATP-avhengige nucleosome remodeling. Menneske INO80 komplekser består av 14 protein subenheter inkludert Ino80, en SNF2-lignende ATPase, som serverer både som den katalytiske subenheten og stillaset for montering av kompleksene. Funksjoner av de andre underenhetene og de mekanismer som bidrar de til INO80 kompleksets kromatin remodeling aktivitet forblir dårlig forstått, delvis på grunn av utfordringen med å generere INO80 underenheter i menneskeceller eller heterologe ekspresjonssystemer. Dette Jove protokollen beskriver en prosedyre som tillater rensing av menneskelige INO80 kromatin remodeling subcomplexes som mangler en underenhet eller et delsett av subenheter. N-terminalt FLAG-epitopen kodet Ino80 cDNA blir stabilt innført i human embryonisk nyre (HEK) 293 cellelinjer ved hjelp av Flp-mediert rekombinasjon. I det tilfelle at et delsett av subenheter av INO80 komplekset er å be slettes, en uttrykker i stedet mutant Ino80 proteiner som mangler plattformen som trengs for montering av disse underenhetene. I tilfelle en person subenhet er å bli tømt, en transfects sirnas rettet mot dette underenhet til en HEK 293 cellelinje stabilt uttrykte FLAG tagget Ino80 ATPase. Atom ekstrakter er forberedt, og FLAG immunoprecipitation er utført for å berike proteinfraksjoner som inneholder Ino80 derivater. Blandingene av renset INO80 subcomplexes kan deretter bli analysert ved hjelp av metoder som immunoblotting, sølvfarging, og massespektrometri. De INO80 og INO80 subcomplexes genereres i henhold til denne protokollen kan bli ytterligere analysert ved hjelp av ulike biokjemiske analyser, som er beskrevet i den medfølgende Jove protokollen. Metodene som beskrives her kan tilpasses for studier av de strukturelle og funksjonelle egenskaper av ethvert pattedyr multi-subenhet kromatin remodellering og modifiserende komplekser.

Introduction

Evolusjonært konserverte SNF2 familie kromatin remodeling komplekser er viktige regulatorer av kromatin organisasjon og DNA tilgjengelighet en. Disse ombygging komplekser omfatter alltid en sentral SNF2 lignende ATPase-subenhet, noe som, i noen tilfeller, setter sammen med forskjellige aksessoriske proteiner og danner multi-subenheten makro-molekylære sammenstillinger. For å studere de molekylære detaljer av ATP-avhengige kromatin remodelleprosessen, er det viktig å forstå bidragene fra gitte undergrupper av underenheter og / eller domenestrukturer i aktiviteter av komplekser. Slike analyser krever evnen til å generere høy-rene mutante komplekser som mangler spesielle protein subenheter eller domenestrukturer.

Tidligere studier struktur-funksjon av ATP-avhengige kromatin remodeling komplekser har allment fokusert på gjær modellsystem på grunn av den overlegne manipulability av gjær-genomet (se, for eksempel, refs 1-4). Gitt bevaring avsubenheten sammensetning og funksjonalitet blant ortologe remodeling komplekser, har studier av struktur og funksjon av gjær remodeling komplekser gitt viktig innsikt i sine kolleger i høyere eukaryoter. Likevel betydelige artsspesifikke forskjeller mellom remodeling komplekser eksisterer, som følge av gevinst eller tap av artsspesifikke subenheter, gevinst eller tap av artsspesifikke domener av konserverte subenheter, og sekvens variasjon innenfor konserverte domener av konserverte subenheter. Slike forskjeller kan i prinsippet være drevet av behovet for høyere eukaryote celler til å tilpasse seg nye molekylære og cellulære miljøer. Dermed forstå hvordan subenheter av høyere eukaryote remodeling komplekser bidra til nucleosome remodeling prosessen er verdifull, fordi den ikke bare belyser grunnleggende mekanismene i ATP-avhengige kromatin remodeling prosessen, men også kan gi verdifull innsikt i de mekanismer som kromatinstruktur og genuttrykk i highennes eukaryoter er regulert.

Så langt har det vært bare begrenset strukturelle og funksjonelle studier av multi-subenheten pattedyr kromatin remodeling komplekser, delvis på grunn av vanskelighetene med å skaffe biokjemisk definerte kromatin remodeling komplekser og subcomplexes. Vi har delvis omgå disse vanskelighetene med de prosedyrer som er beskrevet nedenfor, hvor immunoaffinitets-rensing blir anvendt for å frem intakte INO80 eller INO80 subcomplexes fra humane celler stabilt uttrykker N-terminalt FLAG-epitop merket villtype eller muterte versjoner av Ino80 5-7 (figur 1) . For å oppnå intakt INO80 komplekser fra humane celler, er Flp-mediert rekombinasjon brukes til å generere transgene HEK293-cellelinjer som uttrykker stabilt FLAG-epitop merket cDNA som koder subenheter av INO80 kompleks 8-10. Ettersom over-ekspresjon av INO80 subenheter kan være noe toksisk, er det nødvendig å isolere og opprettholde klonale cellelinjer i henhold til selektiv cold å sikre stabil transgene uttrykk i de mange passasjene som trengs for utvidelse av store cellekulturer. For å få mindre INO80 subcomplexes som bare inneholder et delsett av subenheter, har vi med hell brukt to tilnærminger (Figur 2A, B). I den første, genererer vi HEK293 Flp-I-cellelinjer stabilt uttrykker mutante versjoner av Ino80 som mangler domener som kreves for interaksjon med spesifikke subenheter 5. Alternativt siRNA-mediert knockdown brukes til å utarme den ønskede subenheten fra celler som uttrykker en passende FLAG-merket INO80 subenhet (upubliserte data). Til slutt, for å rense de humane INO80 komplekser, er FLAG agarose-basert kromatografi 11 benyttes for å berike en INO80-inneholdende fraksjon fra nukleære ekstrakter, for derved effektivt å redusere nærværet av forurensende cytosoliske proteiner i den endelige fraksjon inneholdende rensede INO80 eller INO80 subcomplexes.

Protocol

1. generasjon og kultur HEK293 Stable cellelinjer Uttrykke Full lengde eller Mutant Versjoner av FLAG Epitope-merket Ino80 eller andre INO80 Komplekse Underenheter Clone cDNA som koder for full lengde eller mutant menneskelige Ino80 ATPase eller annen INO80 subenheten inn i pattedyr ekspresjonsvektor pcDNA5 / FRT med en in-frame, N-terminal FLAG epitop tag. Bekreft sekvensen av de innsatte cDNAs ved DNA-sekvensering før du fortsetter. For å utføre transfeksjonen, vokser Flp-i HEK293-cel…

Representative Results

Figur 1 viser et flytdiagram som oppsummerer fremgangsmåten som brukes til å generere, rense og karakterisere humane INO80 ATP-avhengige kromatin remodeling komplekser. Som illustrert i figurene 2 og 3, er disse fremgangsmåter muliggjøre generering av både villtypen INO80 og INO80 subcomplexes som mangler forskjellige subenheter, og dermed muliggjør etterfølgende biokjemiske analyser av bidraget av disse mangler subenheter til INO80 s…

Discussion

Strukturelle og funksjonelle studier av multi-subenheten pattedyr kromatin remodeling komplekser fra høyere eukaryoter har vært hemmet av vanskeligheten med å forberede biokjemisk nyttige mengder av slike komplekser som inneholder mutant underenheter eller mangler visse subenheter helt. Det finnes en rekke tekniske hindringer: For det første har genetisk manipulering i pattedyrceller har vært teknisk krevende og tidkrevende. I motsetning til gjærceller, hvis genom lett kan redigeres og målrettet ved hjelp recombi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbeid i forfatternes laboratorium er støttet av et stipend fra National Institute of General Medical Sciences (GM41628) og ved en bevilgning til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelson Medical Research Fund i Greater Kansas City Community Foundation.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cellgro 10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine) Life Technologies 35050-079
Fetal Bovine Serum SAFC 12176C
FuGENE6 transfection reagent   Promega E2312
Hygromycin B, sterile in PBS AG Scientific H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector Life Technologies V6010-20
Flp-In HEK293 cells  Life Technologies R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector Life Technologies V600520
EZview  Red ANTI-FLAG  M2 Affinity Gel  Sigma F2426
calf serum SAFC 12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool Dharmacon / Thermo Scientific various
5x siRNA resuspension buffer  Dharmacon / Thermo Scientific #B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX  Life Technologies 13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium  Life Technologies 51985-091
PBS  Cellgro 45000 VWR
TrypLE (trypsin) Life Technologies 12604
1x FLAG Peptide Sigma F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column Bio-Rad 737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) Amicon UFC805024  Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns  Thermo Scientific 89882
Anti-FLAG M2 antibody, mouse Sigma F3165
Anti-FLAG M2 antibody, rabbit Sigma F7425
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340
benzonase  Novagen 70664
Equipment Company
Wheaton Dounce Tissue Grinders Wheaton 06-435C 
JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge  Beckman-Coulter 339080
JA-17 rotor Beckman-Coulter 369691
10 ml polycarbonate tubes  Beckman-Coulter 355630
70 ml polycarbonate bottles  Beckman-Coulter 355655
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter 339160
Type 70.1 Ti rotor  Beckman-Coulter 342184
BD Clay Adams Nutator Mixer BD Diagnostics 15172-203  VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator Glas-Col 099A RD4512
PCR thermal cycler PTC 200 MJ Research PTC 200
roller bottle incubator Bellco biotechnology 353348
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 Millipore IPFL07810
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes  Costar 3207

References

  1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
  2. Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
  3. Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
  4. Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
  5. Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
  6. Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
  7. Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
  8. Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
  9. Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
  10. Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
  11. Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
  12. Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
  13. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).

Play Video

Cite This Article
Chen, L., Ooi, S., Conaway, R. C., Conaway, J. W. Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes. J. Vis. Exp. (92), e51720, doi:10.3791/51720 (2014).

View Video