Generasjon og rensing av menneske INO80 Chromatin remodeling komplekser og Subcomplexes
Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for generering og rensing av villtype og muterte versjoner av det menneskelige INO80 kromatin ombygging kompleks. Epitop merket versjoner av INO80 subenheter blir stabilt uttrykt i HEK293-celler og komplett komplekser og komplekser som mangler spesifikke sett av underenhetene blir renset ved immunoaffinitets-kromatografi.
Abstract
INO80 kromatin remodeling komplekser regulere nucleosome dynamikk og DNA tilgjengelighet ved katalyserende ATP-avhengige nucleosome remodeling. Menneske INO80 komplekser består av 14 protein subenheter inkludert Ino80, en SNF2-lignende ATPase, som serverer både som den katalytiske subenheten og stillaset for montering av kompleksene. Funksjoner av de andre underenhetene og de mekanismer som bidrar de til INO80 kompleksets kromatin remodeling aktivitet forblir dårlig forstått, delvis på grunn av utfordringen med å generere INO80 underenheter i menneskeceller eller heterologe ekspresjonssystemer. Dette Jove protokollen beskriver en prosedyre som tillater rensing av menneskelige INO80 kromatin remodeling subcomplexes som mangler en underenhet eller et delsett av subenheter. N-terminalt FLAG-epitopen kodet Ino80 cDNA blir stabilt innført i human embryonisk nyre (HEK) 293 cellelinjer ved hjelp av Flp-mediert rekombinasjon. I det tilfelle at et delsett av subenheter av INO80 komplekset er å be slettes, en uttrykker i stedet mutant Ino80 proteiner som mangler plattformen som trengs for montering av disse underenhetene. I tilfelle en person subenhet er å bli tømt, en transfects sirnas rettet mot dette underenhet til en HEK 293 cellelinje stabilt uttrykte FLAG tagget Ino80 ATPase. Atom ekstrakter er forberedt, og FLAG immunoprecipitation er utført for å berike proteinfraksjoner som inneholder Ino80 derivater. Blandingene av renset INO80 subcomplexes kan deretter bli analysert ved hjelp av metoder som immunoblotting, sølvfarging, og massespektrometri. De INO80 og INO80 subcomplexes genereres i henhold til denne protokollen kan bli ytterligere analysert ved hjelp av ulike biokjemiske analyser, som er beskrevet i den medfølgende Jove protokollen. Metodene som beskrives her kan tilpasses for studier av de strukturelle og funksjonelle egenskaper av ethvert pattedyr multi-subenhet kromatin remodellering og modifiserende komplekser.
Introduction
Evolusjonært konserverte SNF2 familie kromatin remodeling komplekser er viktige regulatorer av kromatin organisasjon og DNA tilgjengelighet en. Disse ombygging komplekser omfatter alltid en sentral SNF2 lignende ATPase-subenhet, noe som, i noen tilfeller, setter sammen med forskjellige aksessoriske proteiner og danner multi-subenheten makro-molekylære sammenstillinger. For å studere de molekylære detaljer av ATP-avhengige kromatin remodelleprosessen, er det viktig å forstå bidragene fra gitte undergrupper av underenheter og / eller domenestrukturer i aktiviteter av komplekser. Slike analyser krever evnen til å generere høy-rene mutante komplekser som mangler spesielle protein subenheter eller domenestrukturer.
Tidligere studier struktur-funksjon av ATP-avhengige kromatin remodeling komplekser har allment fokusert på gjær modellsystem på grunn av den overlegne manipulability av gjær-genomet (se, for eksempel, refs 1-4). Gitt bevaring avsubenheten sammensetning og funksjonalitet blant ortologe remodeling komplekser, har studier av struktur og funksjon av gjær remodeling komplekser gitt viktig innsikt i sine kolleger i høyere eukaryoter. Likevel betydelige artsspesifikke forskjeller mellom remodeling komplekser eksisterer, som følge av gevinst eller tap av artsspesifikke subenheter, gevinst eller tap av artsspesifikke domener av konserverte subenheter, og sekvens variasjon innenfor konserverte domener av konserverte subenheter. Slike forskjeller kan i prinsippet være drevet av behovet for høyere eukaryote celler til å tilpasse seg nye molekylære og cellulære miljøer. Dermed forstå hvordan subenheter av høyere eukaryote remodeling komplekser bidra til nucleosome remodeling prosessen er verdifull, fordi den ikke bare belyser grunnleggende mekanismene i ATP-avhengige kromatin remodeling prosessen, men også kan gi verdifull innsikt i de mekanismer som kromatinstruktur og genuttrykk i highennes eukaryoter er regulert.
Så langt har det vært bare begrenset strukturelle og funksjonelle studier av multi-subenheten pattedyr kromatin remodeling komplekser, delvis på grunn av vanskelighetene med å skaffe biokjemisk definerte kromatin remodeling komplekser og subcomplexes. Vi har delvis omgå disse vanskelighetene med de prosedyrer som er beskrevet nedenfor, hvor immunoaffinitets-rensing blir anvendt for å frem intakte INO80 eller INO80 subcomplexes fra humane celler stabilt uttrykker N-terminalt FLAG-epitop merket villtype eller muterte versjoner av Ino80 5-7 (figur 1) . For å oppnå intakt INO80 komplekser fra humane celler, er Flp-mediert rekombinasjon brukes til å generere transgene HEK293-cellelinjer som uttrykker stabilt FLAG-epitop merket cDNA som koder subenheter av INO80 kompleks 8-10. Ettersom over-ekspresjon av INO80 subenheter kan være noe toksisk, er det nødvendig å isolere og opprettholde klonale cellelinjer i henhold til selektiv cold å sikre stabil transgene uttrykk i de mange passasjene som trengs for utvidelse av store cellekulturer. For å få mindre INO80 subcomplexes som bare inneholder et delsett av subenheter, har vi med hell brukt to tilnærminger (Figur 2A, B). I den første, genererer vi HEK293 Flp-I-cellelinjer stabilt uttrykker mutante versjoner av Ino80 som mangler domener som kreves for interaksjon med spesifikke subenheter 5. Alternativt siRNA-mediert knockdown brukes til å utarme den ønskede subenheten fra celler som uttrykker en passende FLAG-merket INO80 subenhet (upubliserte data). Til slutt, for å rense de humane INO80 komplekser, er FLAG agarose-basert kromatografi 11 benyttes for å berike en INO80-inneholdende fraksjon fra nukleære ekstrakter, for derved effektivt å redusere nærværet av forurensende cytosoliske proteiner i den endelige fraksjon inneholdende rensede INO80 eller INO80 subcomplexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strukturelle og funksjonelle studier av multi-subenheten pattedyr kromatin remodeling komplekser fra høyere eukaryoter har vært hemmet av vanskeligheten med å forberede biokjemisk nyttige mengder av slike komplekser som inneholder mutant underenheter eller mangler visse subenheter helt. Det finnes en rekke tekniske hindringer: For det første har genetisk manipulering i pattedyrceller har vært teknisk krevende og tidkrevende. I motsetning til gjærceller, hvis genom lett kan redigeres og målrettet ved hjelp recombi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeid i forfatternes laboratorium er støttet av et stipend fra National Institute of General Medical Sciences (GM41628) og ved en bevilgning til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelson Medical Research Fund i Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
