Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes

doi: 10.3791/51720 Published: October 23, 2014

Summary

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het genereren en het zuiveren van wild type en mutante versies van de menselijke INO80 chromatin remodelling complex. Epitoop-gemerkte versies van INO80 subeenheden zijn stabiel tot expressie gebracht in HEK293-cellen en volledige complexen en complexen ontbreekt specifieke sets van subeenheden gezuiverd door immuno-affiniteitschromatografie.

Abstract

INO80 chromatine remodeling complexen reguleren nucleosomen en DNA bereikbaarheid door het katalyseren van ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling. Menselijke INO80 complexen uit 14 eiwitsubeenheden waaronder INO80 een SNF2-achtige ATPase, dat dient als de katalytische subeenheid en de matrix voor montage van de complexen. Functies van de andere subeenheden en de mechanismen waarmee zij een bijdrage leveren aan chromatine remodeling activiteit de INO80 complex blijft slecht begrepen, voor een deel te wijten aan de uitdaging van het genereren van INO80 bouwgroepen in menselijke cellen of heterologe expressie systemen. Deze JOVE protocol beschrijft een procedure die zuivering van menselijke INO80 chromatine hermodellering subcomplexen die ontbreken een subeenheid of een subset van subeenheden mogelijk maakt. N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte cDNA INO80 worden stabiel ingebracht in humane embryonale nier (HEK) 293-cellijnen met Flp-bemiddelde recombinatie. Indien een subset van subeenheden van de INO80 complex is be verwijderd, een expressie plaats INO80 mutante eiwitten die het platform te monteren onderdelen van deze subeenheden missen. In het geval een individu subunit is uitgeput te raken, een transfects siRNA gericht op deze subeenheid in een HEK 293 cellijn stabiel tot expressie FLAG tag INO80 ATPase. Kernextracten worden bereid, en FLAG immunoprecipitaties wordt uitgevoerd om proteïne fracties die INO80 derivaten verrijken. De samenstellingen van gezuiverde INO80 subcomplexen kan vervolgens worden geanalyseerd met methoden zoals immunoblotting, zilverkleuring en massaspectrometrie. De INO80 en INO80 subes gegenereerd volgens dit protocol kan verder worden geanalyseerd middels diverse biochemische assays die worden beschreven in de bijgevoegde JOVE protocol. De hier beschreven werkwijzen kunnen worden aangepast voor onderzoek van de structurele en functionele eigenschappen van elke zoogdierlijke meerdere subeenheden chromatine remodeling en modificerende complexen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evolutionair geconserveerd SNF2 familie chromatine remodeling complexen zijn belangrijke regulatoren van chromatine organisatie en toegankelijkheid van DNA 1. Deze remodeling complexen altijd een centrale SNF2-achtige ATPase subeenheid, die in sommige gevallen, assembleert diverse toe eiwitten en vormt meerdere subeenheden macro-moleculaire assemblages. De moleculaire details van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling te bestuderen, is het belangrijk om de bijdrage van bepaalde subsets van subeenheden en / of domein structuren begrijpen activiteiten van de complexen. Dergelijke analyses vereisen de mogelijkheid om zeer gezuiverde mutant complexen die bepaald eiwit subeenheden of domein structuren missen genereren.

Vorige structuur-functie studies van ATP-afhankelijke chromatine hermodellering complexen sterk gericht op de gist modelsysteem vanwege de superieure maakbaarheid van de gist genoom (zie bijvoorbeeld refs 1-4). Gezien het behoud van desubunit samenstelling en functionaliteit tussen orthologe remodeling complexen, hebben studies van de structuur en functie van gist remodeling complexen belangrijke inzichten in hun tegenhangers in hogere eukaryoten. Toch merkbare soortspecifieke verschillen tussen remodeling complexen bestaan, als gevolg van winst of verlies van soortspecifieke subeenheden, winst of verlies van de soort-specifieke domeinen van geconserveerde subeenheden en sequentievariabiliteit binnen geconserveerde domeinen van geconserveerde subeenheden. Dergelijke verschillen kunnen in principe gedreven door de behoefte aan hogere eukaryote cellen aan te passen aan nieuwe moleculaire en cellulaire omgevingen. Zo begrijpen hoe subeenheden van hogere eukaryote remodeling complexen bijdragen aan het nucleosoom remodeling proces is waardevol, want het werpt niet alleen licht op de basismechanismen van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling proces, maar ook kan waardevolle inzichten verschaffen in de mechanismen die chromatine structuur en genexpressie in highaar eukaryoten worden gereguleerd.

Tot nu toe zijn er slechts beperkte structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen, mede als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van biochemisch gedefinieerd chromatine remodeling complexen en subes. We hebben gedeeltelijk omzeild deze moeilijkheden met de hieronder beschreven procedures, waarbij immunoaffiniteitszuivering wordt gebruikt om intact INO80 of INO80 subcomplexen van humane cellen die stabiel tot expressie N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte wild type of mutante versies van INO80 5-7 bereiden (figuur 1) . Om intact INO80 complexen van menselijke cellen te verkrijgen, is Flp-bemiddelde recombinatie wordt gebruikt om transgene HEK293 cellijnen die stabiel FLAG epitoop-gemerkte cDNA's die coderen voor subeenheden van het INO80 complex 8-10 genereren. Omdat overexpressie van INO80 subeenheden enigszins giftig zijn, is het noodzakelijk te isoleren en klonale cellijnen onder selectieve co handhavennditions stabiele transgene expressie waarborgen tijdens de vele passages nodig zijn voor uitbreiding van grootschalige celkweken. Voor kleinere INO80 subcomplexen dat slechts een subset van subeenheden bevatten verkrijgen, hebben we succes twee methoden (figuur 2A, B). In de eerste genereren we HEK293 Flp-In cellijnen die stabiel mutant versies van INO80 die domeinen voor de interactie met specifieke subeenheden 5 ontbreken. Alternatief wordt siRNA-gemedieerde knockdown gebruikt om de gewenste subeenheid van cellen die een geschikt FLAG gelabeld INO80 subeenheid (ongepubliceerde gegevens) afbreken. Tot slot, om het menselijk INO80 complexen te zuiveren, is FLAG agarose gebaseerd chromatografie 11 gebruikt om een-INO80 bevattende fractie een verrijking van nucleaire extracten, waardoor de effectieve vermindering van de aanwezigheid van verontreinigende cytosole eiwitten in de laatste fractie die gezuiverd INO80 of INO80 subes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1 Generatie en Cultuur van HEK293 Stabiel cellijnen die Full Length of Mutant Versies van FLAG epitoopgemerkte INO80 of andere INO80 Complex Subeenheden

  1. Clone cDNA dat de volledige lengte of mutant humaan INO80 ATPase of een andere INO80 subeenheid in de zoogdierlijke expressievector pcDNA5 / FRT met een in-frame, N terminale FLAG epitoop tag.
  2. Bevestig de sequentie van het ingevoegde cDNA met DNA sequencing voordat.
  3. Om de transfectie uit te voeren, groeien Flp-In HEK293 cellen in 10 cm weefselkweekschalen in een medium met DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 5% glutamine en 10% FBS (foetaal runderserum).
  4. Wanneer cellen bereiken ~ 70% confluentie aan elke weefselcultuurschaal een mengsel van 40 pl FuGENE6 transfectie reagens, 0,5 ug van de geschikte pcDNA5 / FRT expressieplasmide, en 9,5 ug pOG44, waarvan Flp recombinase codeert, in een totaal volume 800 pl.
  5. 48 uur later, trypsinize en split cellen bij een verhouding van 1:30 in 10 cm schalen en ze groeien in DMEM met 5% glutamine, 10% FBS, en 100 ug / ml hygromycine B voor 3 - 4 weken. Verander het kweekmedium wanneer het begint te geel (meestal om de 3-5 dagen).
  6. Om positieve klonen die het hoogste-FLAG gelabeld eiwit expressie te identificeren, selecteert individuele hygromycine B-resistente kolonies en overbrengen naar een enkel putje van een 24-well plaat.
    1. Wanneer de cellen 80% confluentie bereikt, oogst cellen uit elk putje in ~ 1 ml PBS en pellet door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten.
    2. Na verwijdering van het supernatant, resuspendeer de celpellet in 60 pl SDS-PAGE monsterbuffer.
    3. Betreft helft van de geresuspendeerde cel pellet aan SDS PAGE en Western blotting om expressie van de FLAG controle hebben lokaas eiwitten; sparen de andere helft voor toekomstige analyses.
  7. Als no-FLAG tag menselijk INO80 eiwitten worden aangetroffen in cellysaten, vouwt u de eerste klonen cel populatiesning verder door uitplating cellen uit enkele putjes van een 24-wells plaat in 15 cm weefselkweekschalen.
    1. Om cellen te oogsten vanaf 15 cm schalen, resuspendeer buurt samenvloeiende cellen in ijskoude PBS en overbrengen in een 50 ml conische buis.
    2. Breng een eindvolume van 50 ml door toevoeging van extra PBS.
    3. Pellet cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant.
    4. Resuspendeer de cel pellet in 1 ml van Lys450 buffer (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail).
      OPMERKING: hier en elders, altijd DTT, PMSF, en proteaseremmercocktail toevoegen aan buffers onmiddellijk voor het begin van een experiment.
    5. Immuno-precipitaat FLAG-gemerkte eiwitten van het resulterende totaal cellysaat met 20 pl anti-FLAG agarose gel, en het FLAG eluaten met Western blotting geanalyseerd. [Voor meer details van immunityoprecipitation procedure, zie stap 5]
  8. Bereid bevroren voorraden gewenste klonale cellijnen 12 en bewaar ze in vloeibare stikstof tot gebruik.

2 Groeiende HEK293- cellijnen in Roller Flessen

Bij bereiding op grote schaal van INO80 complexen, cellen in kweek 10 - 20 rolflessen; Een typische opbrengst uit elke rolfles is ~ 1 ml gepakte cellen.

  1. Aan elke rolfles, voeg 200 ml DMEM, 5% glutamine en 10% kalfserum, zonder hygromycine B.
  2. Breng alle cellen van een bijna samenvloeiende 15 cm schaal in elke rolfles
  3. Plaats rolflessen in een 37 ° C incubator rolfles en roteren bij 0,2 rpm.
  4. Zodra cellen te bereiken ~ 70% samenvloeiing, giet af en het medium te verwijderen.
  5. Voeg ~ 50 ml ijskoude PBS aan elke fles. Houdt flessen horizontaal, draai voorzichtig aan de cel monolaag los.
  6. Breng de cellen geresuspendeerd tot 250 ml plastic conische flessen en plaats op ijs.
  7. Spoel rolkolven met extra PBS, de overdracht van het sequentieel van fles tot fles. Als spoeling oplossing is niet meer duidelijk is (meestal na gebruik af te spoelen ongeveer 5 flessen), voeg het toe aan de celsuspensie.
  8. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 minuten.
  9. Voorzichtig resuspendeer de cellen in PBS, te combineren tot een enkele 250 ml conische fles, en bewaar op ijs tot verdere verwerking.

3-siRNA gemedieerde Knockdown van INO80 Subeenheden in cellen die ander-FLAG tag INO80 Subunit

Om INO80 subes ontbreekt een enkele subunit verkrijgen, gebruiken FLAG-immuunzuivering naar INO80 complexen van siRNA behandelde cellen of cellen stabiel tot expressie shRNA zuiveren. De "reverse" siRNA (kleine interfererende RNA) transfectieprotocol hier beschreven is geoptimaliseerd voor HEK293 cellen groeien in 15 cm schalen. Het protocol is voor een enkele 15 cm schotel van cellen en shoULD worden opgeschaald derhalve afhankelijk van het aantal cellen nodig. Om biochemisch nuttige hoeveelheden INO80 complexe uit-siRNA behandelde cellen te bereiden, dient men op te schalen naar culturen gegroeid in 40 15 cm schalen; 4 ml gepakte celpellet - dit neemt ongeveer 2 opleveren.

  1. Groeien HEK293 cellen die stabiel tot expressie het gewenste subeenheid van de INO80 complex bijna confluentie in 15 cm schalen.
  2. Voeg een hoeveelheid van siRNA resuspensie buffer (20 mM KCl, 6 mM HEPES pH 7,5 en 0,2 mM MgCl2) volstaan ​​om een 50 uM stockoplossing van siRNA een buis met gelyofiliseerd siRNA bereiden. Pipet de oplossing op en neer een paar keer en broeden op een nutator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om ervoor te zorgen de siRNA volledig is opgelost.
  3. Bereid een transfectie cocktail met siRNA's en transfectiereagens. Meng 10 ul van de 50 uM siRNA stockoplossing met 32 ​​pi Lipofectamine RNAiMAX toevoegen aan 4 ml Opti-MEM Verminderde Serum Medium met zeer voorzichtig mengen; allaag alle reagentia in evenwicht te RT voor gebruik.
  4. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  5. Bereid Flp-in HEK293 cellen die stabiel tot expressie het gewenste INO80 subeenheid voor transfectie.
    1. Tijdens de incubatie van stap 3.4, wassen cellen in de 15 cm schalen eenmaal met PBS RT.
    2. Na het verwijderen PBS behandelen cellen met 1 ml trypsine enkel tot ze beginnen te tillen van de plaat.
    3. Voeg onmiddellijk 10 ml compleet medium (DMEM + 5% glutamine + 10% FBS) cellen getrypsiniseerd en meng voorzichtig. Verzamel cellen door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Resuspendeer de celpellet in ~ 4 ml compleet medium en tel de cel resuspensie behulp van een hemocytometer.
    5. Verdun cellen met compleet medium tot een concentratie van ~ 5,4 x 10 6 / ml.
  6. Aan elk 15 cm schotel, voeg 15 ml compleet kweekmedium, gevolgd door 4 ml transfectie cocktail. Roer voorzichtig tot het medium en transfectie cocktail waarborgen thoroughly gemengd. Tenslotte, voeg een ml celsuspensie en weer schud zachtjes om cellen gelijkmatig te dispergeren.
  7. Na 60 uur van de cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator, verwijder voorzichtig medium, resuspendeer cellen in ijskoude PBS, en meteen overgaan tot de nucleaire extracten te bereiden.

4 Voorbereiding van kernextracten

Deze procedure is een modificatie van het protocol van Dignam 13 en kunnen worden vergroot of verkleind afhankelijk van de grootte van het starten celpellets. Typisch, 1 ml gepakte celpellet opbrengst 1 ml uiteindelijke nucleair extract. Alle buffers moeten ijskoud en alle stappen worden uitgevoerd in een koude kamer of op ijs indien een geschikte koude kamer is niet beschikbaar.

  1. Isolatie van kernen:
    1. Zacht overdracht cellen om een ​​geschikte grootte (15 of 50 ml) studeerde conische buis en centrifugeren bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    2. Verwijder de supernatant en het volume van het gepakte cel pel metenlaten. 1 ml gepakte cellen overeenkomt met ~ 3 x 10 8 HEK293 cellen.
    3. Voeg 5 verpakt celvolumes buffer A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail). Resuspendeer de cel pellet door voorzichtig pipetteren.
    4. Incubeer op ijs gedurende precies 10 minuten.
    5. Pellet de cellen bij 1000 g gedurende 10 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant.
    6. De afmeting van de cel pellet moet tijdens incubatie in buffer A. verhoogd tot 2-voudig
    7. Resuspendeer de cellen in twee hematocriet volumina van buffer A, en breng de celsuspensie tot een geschikte afmeting Dounce weefselhomogenisator. Als u met minder dan 2 ml packed cells, gebruik dan een 7 ml homogenisator; voor 2 - 4 ml packed cells, gebruik maken van een 15 ml homogenisator; en voor 10 of meer ml packed cells, gebruik maken van een 40 ml homogenisator.
    8. Homogeniseren van de celsuspensie met de losse glazen stamper van de Dounce homogenisator until 90% van de cellen positief te kleuren met 1% trypan blauw.
    9. De suspensie in een 45 ml high-speed centrifuge buis en draaien bij 25.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een JA-17 rotor of dergelijke (zie tabel of Materials / Apparatuur).
    10. Van de nucleaire pellet, de bovenstaande vloeistof, die cytosolische eiwitten of eiwitten die tijdens de fractionering lekken van de kern bevat.
  2. Extraheren kernen met zout:
    1. Voeg Buffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1000 Protease Inhibitor Cocktail) aan de nucleaire pellet; Gebruik 2,5 ml buffer C per 3 ml conferentie hematocriet (~ 1 x 10 9 cellen).
    2. Met behulp van een glasstaaf of een pipet, los nucleaire pellet van de wand van de buis en breng het gehele mengsel een Dounce homogenisator van geschikte grootte.
    3. Resuspendeer de kernen door homogeniseren the mengsel met twee slagen van een losse stamper.
    4. Breng de geresuspendeerd nucleaire fractie in een gekoeld beker. Kies een bekerglas zodat de suspensie de beker vult ten minste 0,5 cm diep.
    5. Nucleaire eiwitten van chromatine of andere onoplosbare structuren extraheren, geleidelijk verhogen van de zoutconcentratie van de suspensie tot 0,42 M NaCl door druppelsgewijze toevoeging van 5 M NaCl onder zacht roeren van de suspensie met een pipet of glazen staafje op ijs; Zodra alle 5 M NaCl werd toegevoegd, dient de oplossing zeer viskeus of gelachtig worden. Bereken het volume van 5 M NaCl nodig oplossing tot een eindconcentratie van 0,42 M NaCl met de volgende formule te brengen:
      Vergelijking 1
    6. Breng zorgvuldig de viskeuze suspensie over in 10 ml polycarbonaat buizen voor een Type 70.1 Ti rotor (of gelijkwaardig) of 70 ml polycarbonaat flessen voor een Type 45 Ti or soortgelijke rotor (zie tabel van materialen / apparatuur). Goed af met parafilm bij gebruik van 10 ml buizen of met dop montage bij gebruik van 70 ml flesjes.
    7. Langzaam rock de afgesloten buizen bij 4 ° C gedurende 30 min met een nutator.
    8. Spin de monsters in een type 45 Ti of 70.1 Ti rotor gedurende 30 min bij 120.000 xg bij 4 ° C.
    9. Breng de bovenstaande om een ​​plastic buis of fles. Dit bovenstaande is de nucleaire extract, en de pellet bevat chromatine en andere nucleaire afval.
    10. Verdeel de kernextract in handig formaat porties, invriezen in vloeibare stikstof, en op te slaan bij -80 ° C.

5 immunoaffiniteitszuivering van de Human INO80 of INO80 subes

  1. Op bevroren kernextract ontdooien, plaats buisjes met het extract van de stationaire of rol buizen tussen de handen totdat het bevroren materiaal wordt een slurry. Plaats dan de buizen op ijs of in de koude kamer tot het extract is volledig thawed.
  2. Breng de ontdooide nucleair extract tot 10 ml polycarbonaat ultracentrifuge buizen en rotatie bij 100.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een Type 70.1 Ti rotor of gelijk aan een neerslag dat tijdens de vorst-dooi cyclus kunnen gevormd hebben.
  3. Breng de supernatant een 15 ml conische buis. Voeg verse DTT, PMSF, en proteaseremmercocktail tot de uiteindelijke concentratie van 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail.
  4. Om anti-FLAG agarose bereiden voor immunozuivering overdragen 200 ul van 50% suspensie van anti-FLAG agarose kralen om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis met een P200 of dergelijke met een pipet tip waarvan de punt afgesneden met een schone scalpel of scheermesje.
  5. Pellet de korrels door centrifugeren in een microcentrifuge benchtop bij 8000 xg gedurende 30 sec. Verwijder de supernatant en was de kralen door resuspenderen van de korrels in 1 ml buffer Lys450 en pellet de korrels bij 8000 xg gedurende 30 sec. Was de beads nog twee keer.
  6. Resuspendeer de gewassen anti-FLAG agarose in 100 pl van nucleair extract met een P200 of dergelijke regelbaar volume pipet met een punt waarvan de punt afgesneden met een schone scalpel of scheermesje en met dezelfde tip, overdracht de geresuspendeerde kralen om de 15 ml conische buis met het extract. Herhaal dit een paar keer totdat alle kralen zijn overgedragen aan de buis van 15 ml.
  7. Incubeer het extract / kraal mengsel gedurende 4 uur bij 4 ° C onder langzame rotatie op laboratoriumschaal rotator. OPTIONEEL: Inclusief Benzonase bij een concentratie van 25 eenheden / ml te verwijderen verontreinigend DNA.
  8. Verzamel de FLAG agarose door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  9. Resuspendeer in 10 ml Lys450 te wassen, incubeer 5 min bij 4 ° C onder zacht schommelen op een nutator. Pellet de kralen aan 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  10. Resuspendeer in 100 - 150 ul Lys450 en overdracht kralen aan een 1,5 ml microcentrifugebuis. Continue aan de 15 ml conische buis met spoelen 100 - 150 gl Lys450 totdat alle korrels zijn overgedragen aan de microcentrifugebuis.
  11. Spin down de kralen bij 8000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C in een microcentrifuge. Was drie keer met 1 ml Lys450 en eenmaal met 1 ml EB100 buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,05% Triton X-100, en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF , en 1: 1.000 proteaseremmercocktail).
  12. Om gebonden eiwitten elueren, voeg 200 ul EB100 buffer die 0,25 mg / ml 1x FLAG-peptide. Incubeer 30 min bij elke 4 ° C op een nutator.
  13. Pellet de beads bij 8000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C in een microcentrifuge. Breng de bovenstaande, die de geëlueerd INO80 complex bevat, om een ​​frisse microcentrifugebuisje.
  14. Herhaal de elutie nog vier keer, en bundelen alle bovenstaande vloeistoffen in een enkele buis.
  15. Om het resterende FLAG-agaroseparels van de geëlueerde eiwit fractie te verwijderen,langs het eluaat door een leeg spinkolom.
  16. Concentreer de geëlueerde eiwitfractie ~ 10-voudig met een dun centrifugale filterinrichting (50.000 molecuulgewicht cutoff).
  17. Om de FLAG-peptide te verwijderen, passeren de geconcentreerde eiwit fractie achtereenvolgens door twee ontzouten kolommen.
  18. Verdeel het gezuiverde ontzoute eiwitfractie in 20 ul aliquots ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C.
  19. Analyseer de subunit samenstelling van INO80 of INO80 subes op-zilver gekleurde gels of door western blotting, en schatten de concentraties door semi-kwantitatieve western blotting het gebruik van preparaten van recombinant INO80 subeenheden van bekende concentratie als standaarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuur 1 toont een stroomdiagram overzicht van de procedures die voor productie, zuiveren en karakteriseren menselijke INO80 ATP-afhankelijke chromatine hermodellering complexen.

Zoals weergegeven in figuren 2 en 3, deze procedures kan de generatie van zowel wildtype INO80 en INO80 subes dat verschillende eiwitten missen, waardoor het mogelijk verdere biochemische analyse van de bijdrage van deze ontbrekende subeenheden enzymatische activiteiten INO80's. Figuur 2 beschrijft twee strategieën we gebruikt om de architectuur van de INO80 complex definiëren en INO80 subes genereren. In de eerste, in figuur 2A, intact INO80 complexen gezuiverd door FLAG-tag versies van wild type subeenheden (Ies2 of INO80E). Subcomplexen kan worden gezuiverd door epitoop-gemerkte versies van mutante eiwitten die INO80 afzonderlijke domeinen waarop verschillende sets subeenheden Assem missenble. Zoals getoond in figuur 3A, wordt de zuiverheid van de resulterende complexen beoordeeld met zilver gekleurde SDS-polyacrylamide gels, terwijl de samenstelling van de complexen wordt beoordeeld met Western blotting met antilichamen tegen diverse INO80 subeenheden (Figuur 3B) of massaspectrometrie (data niet getoond). Met deze aanpak, vonden we dat het in rood in figuur 2A subeenheden werden verloren na deletie van de INO80 NTD (N-terminale domein); subeenheden in blauw weergegeven gingen verloren na het verwijderen van de INO80 HSA (Helicase SANT Associated) domein; en dat de SNF2 ATPase-domein, samengesteld SNF2N en HelicC gebieden (purple) gescheiden door een lange invoeggebied (wit), noodzakelijk en voldoende is voor binding aan subeenheden weergegeven in paars. Zo INO80 subes (INO80ΔN.com of INO80ΔNΔHSA.com) dat ontbreekt ofwel de in rood aangegeven of subeenheden subeenheden getoond in rood en blauw kan worden gezuiverd door middel van FLAG-Ino80ΔN of FLAG-INO80ΔNΔHSA, respectievelijk 5.

Het is ook mogelijk om subcomplexen genereren door het afbreken afzonderlijke subeenheden van cellen die een geschikt FLAG gelabeld INO80 subeenheid (ongepubliceerde resultaten). In het eerste voorbeeld getoond in figuur 2B, siRNA-gemedieerde knockdown van subunit X put slechts X van de INO80 complex, wat suggereert X is niet vereist voor assemblage van andere subeenheden in INO80. In de tweede en derde voorbeelden, siRNA knockdown van beide Y of Z leidt tot co-depletie van zowel de Y en Z subeenheden suggereert Y en Z samen tot de INO80 complex in een onderling afhankelijke wijze.

Figuur 1
. Figuur 1 Stroomdiagram beschreven procedures gebruikt voor het genereren, zuiveren en karakteriseren menselijke INO80 ATP-afhankelijke chromatine remodeling complexen F, een N-eindstandige in-frame FLAG epitoop tag; Indiase overheid, Gene-van-inlangstelling. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 Schematische weergave van de twee strategieën gebruikt om INO80 subes dat een subset van subeenheden bevatten genereren. (A) De INO80 ATPase bevat gebieden die modulaire steigers waarop de overige INO80 subeenheden monteren functioneren. (B)-siRNA gemedieerde knockdown kan worden gebruikt om de gewenste subeenheid (X of Y of Z) van cellen die een geschikt VLAG afbreken tagged INO80 subunit (bijvoorbeeld FLAG-Ino80ΔN). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3 Figuur 3 Analyse van de samenstelling van immuungezuiverd INO80 complexen en subes. (A) INO80 complexen of subcomplexen werden gezuiverd uit cellen die stabiel de aangegeven FLAG-gemerkte eiwitten, onderworpen aan SDS-polyacrylamide gelelektroforese en gevisualiseerd door zilverkleuring. Het monster in de meest rechtse rijstrook werd bereid uit ouderlijke 293-cellen die niet-FLAG gelabeld eiwit tot expressie brengen; eiwitten die in deze controle rijstrook verschijnen zijn verontreinigingen die niet-specifiek binden aan FLAG-agarose. Labels op de linkerzijde wijzen banden die overeenkomen met verschillende INO80 subeenheden, en die op het recht van de mobiliteiten van molecuulgewichtmerkers. De positie van wildtype INO80 wordt aangegeven door de zwarte rechthoek en posities van INO80 mutanten worden aangegeven door open cirkels. De rijstroken gescheiden door de zwarte lijn zijn van afzonderlijke gels. (B) INO80 complexen en subes werden geanalyseerd door western blottingbehulp van antilichamen tegen representatieve subeenheden van de NTD, HSA en SNF2 modules. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Biological Chemistry. Chen et al, Subunit Organisatie van de Human INO80 chromatine remodeling Complex. Een Evolutionarily Behouden Core Complex Katalyseert ATP-afhankelijke Nucleosome Verbouwing. Het Journal of Biological Chemistry Vol 286: pp. 11.283-11.289. © 2011, door de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen van hogere eukaryoten werden gehinderd door de moeilijkheid van de voorbereiding van biochemisch nuttige hoeveelheden van dergelijke complexen met mutant subeenheden of ontbreken bepaalde subeenheden helemaal. Er zijn een aantal technische hindernissen Enerzijds, is genetische manipulatie in zoogdiercellen technisch ingewikkeld en tijdrovend geweest. Unlike gistcellen, waarvan het genoom kan gemakkelijk worden bewerkt en gericht met recombineering technieken het zoogdiergenoom is structureel complexer en minder gevoelig voor recombineering interventies. Aldus, deletie of modificatie van zoogdiergenen in gekweekte cellen of dieren is tijdrovend en vereist meer expertise. Bijgevolg heeft de generatie van mutante zoogdieren complexen dragen structurele mutaties of ontbreken subsets van subunit (s) snelheidsbeperkende geweest. Tweede, biochemische reconstructie waarbij gebruik wordt gemaakt heterologous eiwitexpressie worden vaak gebruikt om bepaalde multi-eiwit samenstellingen genereren. Dergelijke benaderingen worden technisch uitdagend voor zeer grote complexen, waarvan de subeenheden moeten gelijktijdig worden uitgedrukt in geschikte stoichiometrie en / of voor assemblage in een bepaalde volgorde, met behulp van specifieke chaperones of cofactoren. Deze problemen zijn bijzonder ernstig in het geval van de INO80 complex, omdat de INO80 ATPase subeenheid bijzonder moeilijk in insect of E. coli-cellen in biochemisch bruikbare hoeveelheden. In studies van de INO80 chromatine remodeling complex, is het mogelijk geweest om een ​​aantal van deze uitdagingen met behulp van de in dit protocol beschreven strategieën te omzeilen.

Het genereren van humane cellijnen die stabiel epitoopgelabelde subeenheden van de INO80 complex is een belangrijke stap in deze procedure omdat het daardoor mogelijk de zuivering van goed gedefinieerde chromatine remodeling complexen die kunnen worden getest met behulp van een verschillende biochemischessays. Hoewel het in principe meer tijd om stabiele cellijnen dan transiënte transfectie om gemanipuleerde cDNA brengen in zoogdierlijke cellijnen voor de productie van recombinant proteïne te genereren, transiënte transfectie enkele nadelen. Eerst DNA in de vorm van een tijdelijk getransfecteerd extra-chromosomale vector-korte duur en meestal niet zelf verspreiden tijdens de celcyclus. Tweede, transfectie-efficiëntie varieert sterk afhankelijk van het type cel en de groeiomstandigheden. Heterogene transfectie kan een mozaïek expressie patroon dat een selectieve groei voordeel of nadeel verleent binnen de cel bevolking veroorzaken. Aldus transient geïntroduceerd transgenen vaak verloren tijdens de vele cel passages nodig zijn om de grote hoeveelheid cellen die nodig zijn voor zuivering van biochemisch bruikbare hoeveelheden eiwitten te genereren. Stabiele cellijnen worden meestal gegenereerd middels werkwijzen die resulteren in willekeurige integratie van cDNA's die coderen voor een eiwitvan belang. Echter, kan willekeurig geïntegreerd cDNA expressie van endogene genen verstoren en zijn onderhevig aan gene silencing met meerdere mobiele passages. Daarom stellen wij doorgaans INO80 cDNA in cellen middels Flp-gemedieerde recombinatie technologie, waarbij het cDNA stabiel wordt opgenomen in een specifieke chromosomale locatie via Flp recombinase gemedieerde insertie in een FRT plaats stabiel geïntegreerd in het genoom.

Bij selectie van stabiele cellijnen, is het essentieel om te kunnen exogeen uitgedrukt,-FLAG gelabeld wildtype of mutant INO80 eiwitten te detecteren. Omdat FLAG-tag INO80 eiwit wordt vaak uitgedrukt zeer gering en is daarom moeilijk of onmogelijk te detecteren zijn door Western blotting in ruwe lysaten van cellen die in een enkel putje van een 24-well plaat, is het vaak noodzakelijk de oorspronkelijke klonale uitbreiding celpopulatie voorafgaand aan screening op expressie van INO80 eiwit. -FLAG gelabeld INO80 eiwit kan vervolgens worden gezuiverd en concentrated door FLAG immuunzuivering voorafgaand aan analyse door Western blotting.

De efficiëntie van siRNA-gemedieerde knockdown nogal gevoelig is celdichtheid op het moment van transfectie; vonden we dat knockdown efficiëntie daalde toen transfecties werden uitgevoerd met cellen op andere dan aanbevolen in het protocol dichtheden. De optimale duur van siRNA transfectie is variabel en moet empirisch worden bepaald voor elke doelwiteiwit, aangezien het afhangt van de stabiliteit van het doeleiwit, de omzetsnelheid van het beoogde eiwit in eiwitcomplexen, en de mate waarin het eiwit essentieel is voor cellevensvatbaarheid. Als alternatief voor het gebruik van transiënte transfectie van siRNA individuele subeenheden afbreken kan men kunnen overwegen genereren van cellijnen die stabiel shRNAs onder selectieve druk het gemakkelijker en kan kosteneffectief biochemisch bruikbare hoeveelheden van dergelijke cellijnen groeien. Het kan echter moeilijk blijkenvoldoende knockdown via shRNA gemedieerde knockdown in stabiele cellijnen te verkrijgen.

Ook sleutel tot het succes van onze werkwijze is het gebruik van nucleaire extracten als het uitgangsmateriaal voor de zuivering van INO80 complexen. Wij hebben gevonden dat immuungezuiverd INO80 complexen gehele celextracten vaak verontreinigd met ATPase en / of nucleosoom remodeling activiteiten die onafhankelijk van de INO80 ATPase zijn; dergelijke verontreinigingen grotendeels vermeden complexen worden gezuiverd uit kernextracten.

Bereiding van nucleaire extracten en isolatie van intacte INO80 complexen hangt af van een aantal kritische factoren. Ten eerste moet de gebruikte cellen nucleaire extracten bereid intact en gezond. De gewassen celpellet wordt verwacht zwellen twee maal na incubatie in hypotone buffer A. Als cellen niet zwellen en / of de supernatant troebel bij deze stap, de start celpopulatie kan ongezond zijn. Alternatief, Cellen kunnen zijn te ruw behandeld tijdens de oogst of resuspensie stappen, of ze hebben te lang zijn geïncubeerd in buffer A. Ten tweede is het belangrijk om niet te over-homogeniseren van de cellen of de nucleaire pellet, omdat dit het chromatine zal scheren en vrij DNA in de oplosbare fractie. DNA in de oplosbare fractie kan interfereren met de daaropvolgende zuivering en analyse van INO80 complexen. Vooral verontreinigend DNA verhoogde vorming van neerslagen leiden tijdens incubatie van het extract met anti-FLAG agarose, waardoor de efficiëntie van de wasstappen en elutie verminderen en / of kan de abundantie van verontreinigend DNA-bindende eiwitten in de uiteindelijke gezuiverde fractie vergroten . Verder stroomafwaarts biochemische assays maatregel activiteiten die afhankelijk DNA, waardoor de mogelijke overdracht van DNA uit het extract interpretatie van deze assays bemoeilijken. Om te voorkomen dat over-homogenisering tijdens cellysis dienstig is het percentage van trypan blue-positieve cel checks na elke slag van de homogenisator; voor HEK293 cellen, vrijwel volledige cellyse vereist meestal 4-6 slagen van homogenisering. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat er luchtbellen onder homogeniseren. Het supernatant van de 120.000 xg draai in stap 4.2.8 moet een duidelijke, niet-viskeuze oplossing, met slechts een zeer minimale hoeveelheid troebel of viskeuze stoffen in de buurt van het chromatine pellet of drijvend op de top zijn. Bij het verzamelen van de bovenstaande vloeistof, moet men oppassen om niet aan een van de bewolkte of viskeuze materiaal te verzamelen, als het kan omvatten chromatine en / of DNA. Tenslotte is het beter om te voorkomen vriescellen voor de voorbereiding nucleaire extracten, aangezien complexen bereid uit bevroren cellen gewoonlijk minder specifieke activiteit vertonen en meer verontreinigende DNA en eiwitten omvatten.

De optimale verhouding tussen de hoeveelheid uitgangsmateriaal extract en anti-FLAG agarose afhankelijk van de concentratie van de FLAG aas eiwit aanwezig in de extracten en accessibiteit van het FLAG-epitoop en behoeften empirisch worden bepaald. We beginnen doorgaans immunozuivering met 100 ul bedvolume anti-FLAG agarose kralen en 3-14 ml nucleair extract; de hoeveelheid extract hangt af van de doelstellingen van het experiment en de beschikbaarheid van extract. Een enkele stap immunozuivering met anti-FLAG agarose is meestal voldoende om INO80 of INO80 subcomplexen zuiveren tot een mate voldoende voor betrouwbare testen van hun activiteiten; echter kunnen aanvullende zuiveringsstap (s), zoals gelfiltratie, dichtheidsgradiënt sedimentatie of ionenuitwisselingschromatografie vereist voor zuivering van andere complexen of contaminerende activiteiten uitlegging van biochemische assays kunnen bemoeilijken verwijderen.

De hier beschreven strategieën algemeen nuttig voor studies van andere chromatine remodeling enzymen en andere grote multiprotein complexen. Succesvolle toepassing van deze strategieën voor de analyse van andere multiprotein complexen is afhankelijk van (i) de identificatie van een individu subunit of subunit (s) die dienen als steiger (s) waarop andere subeenheden monteren en (ii) een omschrijving van specifieke domeinen of regio's waarmee specifieke subsets van subeenheden monteren. De definitie van dergelijke domeinen kan worden vergemakkelijkt door analyse van de primaire sequentie van de kern steiger subeenheid (s) evolutionair geconserveerde gebieden of gebieden die overeenkomen met bekende structurele domeinen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Het werk in het laboratorium van de auteurs 'wordt ondersteund door een subsidie ​​van de National Institute of General Medical Sciences (GM41628) en door een subsidie ​​aan de Stowers Instituut voor Medisch Onderzoek van het Helen Nelson Fonds Medisch Onderzoek aan de Greater Kansas City Community Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cellgro 10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine) Life Technologies 35050-079
Fetal Bovine Serum SAFC 12176C
FuGENE6 transfection reagent Promega E2312
Hygromycin B, sterile in PBS AG Scientific H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector Life Technologies V6010-20
Flp-In HEK293 cells Life Technologies R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector Life Technologies V600520
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma F2426
calf serum SAFC 12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool Dharmacon / Thermo Scientific various
5x siRNA resuspension buffer Dharmacon / Thermo Scientific #B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX Life Technologies 13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 51985-091
PBS Cellgro 45000 VWR
TrypLE (trypsin) Life Technologies 12604
1x FLAG Peptide Sigma F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column Bio-Rad 737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) Amicon UFC805024 Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns Thermo Scientific 89882
Anti-FLAG M2 antibody, mouse Sigma F3165
Anti-FLAG M2 antibody, rabbit Sigma F7425
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340
benzonase Novagen 70664
Equipment
JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge Beckman-Coulter 339080
JA-17 rotor Beckman-Coulter 369691
10 ml polycarbonate tubes Beckman-Coulter 355630
70 ml polycarbonate bottles Beckman-Coulter 355655
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter 339160
Type 70.1 Ti rotor Beckman-Coulter 342184
BD Clay Adams Nutator Mixer BD Diagnostics 15172-203 VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator Glas-Col 099A RD4512
PCR thermal cycler PTC 200 MJ Research PTC 200
roller bottle incubator Bellco biotechnology 353348
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 Millipore IPFL07810
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes Costar 3207

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
  2. Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15, (5), 469-476 (2008).
  3. Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406, (6795), 541-544 (2000).
  4. Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
  5. Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286, (13), 11283-11289 (2011).
  6. Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5, (5), 521-527 (1994).
  7. Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251, (4999), 1351-1355 (1991).
  8. Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280, (50), 41207-41212 (2005).
  9. Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14, (9), 872-874 (2007).
  10. Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31, (6), 909-917 (2008).
  11. Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16, (4), 730-735 (1994).
  12. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 207-245 (2005).
  13. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11, (5), 1475-1489 (1983).
Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, R. C., Conaway, J. W. Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes. J. Vis. Exp. (92), e51720, doi:10.3791/51720 (2014).More

Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, R. C., Conaway, J. W. Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes. J. Vis. Exp. (92), e51720, doi:10.3791/51720 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter