Generation og oprensning af human INO80 Chromatin Remodeling komplekser og Subcomplexes
Summary
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til generering og oprensning af vildtype og mutant-versioner af humane INO80 kromatin remodellering kompleks. Epitop taggede versioner af INO80 underenheder stabilt udtrykt i HEK293-celler, og komplette komplekser og komplekser mangler specifikke sæt af underenheder oprenses ved immunaffinitetskromatografi.
Abstract
INO80 kromatin remodeling komplekser regulerer nukleosom dynamik og DNA tilgængelighed ved at katalysere ATP-afhængig nukleosom remodeling. Menneskelige INO80 komplekser består af 14 proteinunderenheder herunder Ino80, en SnF2-lignende ATPase, der tjener både som den katalytiske underenhed og stilladset til samling af komplekserne. Funktioner af de andre underenheder og de mekanismer, som de bidrager til INO80 kompleksets kromatin remodellering aktivitet forbliver dårligt forstået, delvis på grund af den udfordring, at skabe INO80 delkomponenter i humane celler eller heterolog ekspression systemer. Denne JOVE protokol beskriver en procedure, der tillader oprensning af humane INO80 kromatin remodeling subcomplexes, der mangler en underenhed eller en delmængde af underenheder. N-terminalt FLAG-epitop-tagget Ino80 cDNA stabilt indført i human embryonisk nyre (HEK) 293-cellelinjer under anvendelse Flp-medieret rekombination. I tilfælde af, at en delmængde af underenheder af INO80 komplekset er til be slettet, man udtrykker i stedet mutant Ino80 proteiner, der mangler platformen nødvendig til samling af disse underenheder. I tilfælde af en individuel underenhed er at være udtømt, én transfects siRNA'er målrettet mod denne subunit i en HEK 293 cellelinje stabilt udtrykker FLAG tagget Ino80 ATPase. Kerneekstrakter fremstilles, og FLAG immunoprecipitation udføres for at berige protein fraktioner indeholdende Ino80 derivater. Præparaterne rensede INO80 subcomplexes kan derefter analyseres under anvendelse af fremgangsmåder, såsom immunoblotting sølvfarvning og massespektrometri. De INO80 og INO80 subcomplexes tilvejebragt efter denne protokol kan analyseres yderligere ved anvendelse af forskellige biokemiske analyser, som er beskrevet i den ledsagende JOVE protokollen. De her beskrevne metoder kan tilpasses til studier af de strukturelle og funktionelle egenskaber ved et pattedyr multi-subunit kromatin remodellering og ændring komplekser.
Introduction
Evolutionært bevaret SnF2 familien kromatin remodeling komplekser er vigtige regulatorer af kromatin organisation og DNA tilgængelighed 1. Disse remodeling komplekser indbefatter altid en central SnF2-lignende ATPase-underenhed, som i nogle tilfælde samles med forskellige accessoriske proteiner og danner multi-subunit makro-molekylære samlinger. For at undersøge de molekylære detaljer af ATP-afhængig chromatin remodeling proces, er det vigtigt at forstå bidragene af givne delmængder af underenheder og / eller domænestrukturer aktiviteter af komplekserne. Sådanne analyser kræver evnen til at generere højt oprensede mutant komplekser, der mangler bestemte proteinunderenheder eller domæne strukturer.
Tidligere struktur-funktionsundersøgelser af ATP-afhængige chromatin remodeling komplekser har vidt fokuseret på gærmodel system på grund af den overlegne manipulabilitet af gær-genomet (se for eksempel ref 1-4). I betragtning af bevarelsen afunderenhed sammensætning og funktionalitet blandt ortologe remodeling komplekser, har undersøgelser af struktur og funktion af gær remodeling komplekser forudsat vigtig indsigt i deres modparter i højere eukaryoter. Ikke desto mindre mærkbare artsspecifikke forskelle blandt remodeling komplekser, der findes, som følge af gevinst eller tab af artsspecifikke subunits, gevinst eller tab af artsspecifikke domæner af konserverede underenheder, og sekvensvariabilitet inden konserverede domæner af bevarede underenheder. Sådanne forskelle kan i princippet være drevet af behovet for højere eukaryote celler til at tilpasse sig nye molekylære og cellulære miljøer. Således at forstå, hvordan underenheder af højere eukaryote remodeling komplekser bidrager til nukleosom remodeling processen er værdifuld, fordi det ikke kun kaster lys over de grundlæggende mekanismer i ATP-afhængig kromatin remodellering proces, men også kan give værdifuld indsigt i de mekanismer, som kromatin struktur og genekspression i highendes eukaryoter reguleres.
Hidtil har der kun været begrænset strukturelle og funktionelle studier af multi-subunit pattedyr kromatin remodeling komplekser, dels på grund af de vanskeligheder med at opnå biokemisk definerede kromatin remodeling komplekser og subcomplexes. Vi har delvist omgået disse vanskeligheder med de procedurer, der er beskrevet nedenfor, hvor immunaffinitetsoprensning anvendes til at fremstille intakte INO80 eller INO80 subcomplexes fra humane celler stabilt udtrykker N-terminalt FLAG epitopmærket vildtype eller mutant versioner af Ino80 5-7 (figur 1) . For at opnå intakte INO80 komplekser fra humane celler, er Flp-medieret rekombination anvendes til at generere transgene HEK293 cellelinjer, der stabilt udtrykker FLAG epitop-tagget cDNA'er, der koder underenheder af INO80 kompleks 8-10. Da overekspression af INO80 underenheder kan være noget giftigt, er det nødvendigt at isolere og opretholde klonale cellelinjer under selektiv cold at sikre en stabil transgenekspression i løbet af de mange passager, der er nødvendige til ekspansion af store cellekulturer. For at opnå mindre INO80 subcomplexes, der kun indeholder en delmængde af underenheder, har vi med succes anvendt to fremgangsmåder (figur 2A, B). I den første, vi genererer HEK293 Flp-In-cellelinier stabilt udtrykker mutant versioner af Ino80 der mangler domæner, der kræves for samspil med specifikke underenheder 5. Alternativt er siRNA-medieret knockdown anvendes til at udtømme den ønskede subunit fra celler, der udtrykker en passende FLAG-mærkede INO80 underenhed (upublicerede data). Endelig, for at rense de menneskelige INO80 komplekser FLAG agarose baseret chromatografi 11 anvendes til at berige en brøkdel INO80 indeholdende fra kerneekstrakter, derved effektivt at reducere tilstedeværelsen af kontaminerende cytosolproteiner i den endelige fraktion med rensede INO80 eller INO80 subcomplexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strukturelle og funktionelle studier af multi-subunit pattedyr kromatin remodeling komplekser fra højere eukaryoter er blevet vanskeliggjort af vanskeligheden ved at fremstille biokemisk nyttige mængder af sådanne komplekser, der indeholder mutant underenheder eller mangler visse underenheder helt. Der er en række tekniske forhindringer: For det første har genmanipulation i pattedyrceller været teknisk udfordrende og tidskrævende. I modsætning gærceller, hvis genom kan let redigeres og målrettet anvendelse af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejde i forfatternes laboratorium er støttet af en bevilling fra National Institute of General Medical Sciences (GM41628) og et tilskud til Stowers Institut for Medicinsk Forskning fra Helen Nelson Medical Research Fund ved Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
