Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

doi: 10.3791/51720 Published: October 23, 2014

Summary

Bu protokol oluşturulması ve vahşi tip ve insan INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleks mutant versiyon saflaştırılması için bir yöntem tarif etmektedir. Epitop INO80 alt birimlerinin versiyonları kararlı biçimde HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve alt birimlerinin kümelerini yoksun tam kompleksleri kompleksleri ve bağışıklık yakınlık kromatografisi ile etiketlenmiş.

Abstract

INO80 kromatin remodeling kompleksleri ATP-bağımlı nucleosome biçimlenme katalize ederek nucleosome dinamikleri ve DNA erişilebilirlik düzenler. İnsan INO80 kompleksleri Ino80, katalitik alt birim ve oluşan komplekslerin montajı için yapı iskelesi olarak hizmet, çok SnF2 gibi ATPaz'ın 14 de dahil olmak üzere protein alt birimlerinin oluşur. Diğer alt birimlerin İşlevleri ve INO80 Kompleksin kromatin remodeling etkinliğine katkıda hangi mekanizmalar kötü nedeniyle insan hücreleri veya heterolog ifade sistemlerinde INO80 altparçadan üretme meydan kısmen anlaşılamamaktadır. Bu protokol, JOVE alt birimi ya da alt üniteler bir alt eksik insan INO80 kromatin yeniden şekillenme subcomplexes saflaştırılmasını sağlayan bir prosedür tarif etmektedir. N-terminal FLAG epitopu Ino80 cDNA, kararlı bir şekilde insan embriyonik böbrek (HEK) Flp aracılı rekombinasyon kullanılarak 293 hücre hatları içine yerleştirilen etiketlendi. INO80 kompleksinin alt-birimden oluşan bir alt grup b olduğu takdirdeE olanların bir alt birimlerinin montajı için gerekli platformu eksikliği yerine mutant Ino80 proteinleri ifade, silindi. Durumunda bağımsız bir alt-birimi tükeneceği için, kararlı bir şekilde ifade eden bir FLAG HEK 293 hücre hattı, bu alt-birimini hedef bir transfects siRNA'lar Ino80 ATPaz etiketlendi. Nüklear özütler hazırlandı edilir ve FLAG immüno Ino80 türevlerini ihtiva eden protein fraksiyonları zenginleştirmek için gerçekleştirilir. Saflaştınldı INO80 subcomplexes bileşimleri daha sonra, immüno-lekeleme, gümüş boyama ve kütle spektrometrisi gibi yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Bu protokole uygun olarak elde edilen ve INO80 INO80 subcomplexes buradan sonra, ekteki JOVE protokolde tarif edildiği çeşitli biyokimyasal tahlilleri kullanılarak analiz edilebilir. Burada açıklanan yöntemler herhangi bir memeli çoklu alt birim kromatin yeniden yapısal ve fonksiyonel özellikleri ve değiştirme çalışmaları kompleksleri için adapte edilebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evrimsel olarak korunmuş SnF2 aile kromatin remodeling kompleksleri kromatin organizasyonu ve DNA erişilebilirlik 1 anahtar regülatörler. Bu kompleksler, remodeling, her zaman, bazı durumlarda, çeşitli yardımcı proteinleri ile toplanır ve çoklu alt birim makro-molekül yığınları oluşturan, merkezi bir SnF2 gibi ATPaz alt-birimi bulunmaktadır. ATP'ye bağımlı kromatin yeniden modelleme süreci molekül ayrıntılarını incelemek için, bu komplekslerin faaliyetlerine alt birimlerde ve / veya alan yapı belirli alt-katkılarını anlamak önemlidir. Bu tür analizler, belirli bir protein alt birimleri veya alan yapı yoksun yüksek düzeyde saflaştırılmış mutan kompleksler üretmek üzere yeteneğini gerektirir.

ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin mi yapı-fonksiyon çalışmalarını yaygın (ref 1-4, örneğin, bakınız) bağlı olarak maya genomuna üstün uygulanabılirliği için maya model sistem üzerine odaklanmıştır. Koruma verilmişortolog biçimlenme kompleksleri arasında birim bileşimi ve işlevsellik, yapısı ve maya yeniden şekillenme komplekslerinin işlevi çalışmalar yüksek ökaryotlar meslektaşlarıyla önemli bilgiler sağladı. Bununla birlikte, takdir türe özgü biçimlenme kompleksler arasında fark kazancı ya da korunmuş alt-birimlerinin korunmuş bölgeler içinde yer alan türe özel alt ünitesi, kazanç ya da korunmuş alt-birimlerinin türe spesifik etki kaybı ve dizi değişkenliğine kaybından kaynaklanan, mevcut. Bu tür farklılıklar prensipte yüksek ökaryotik hücreler yeni moleküler ve hücresel ortamlara uyum için ihtiyaç tarafından tahrik edilebilir. Değil, sadece mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir aynı zamanda ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme sürecinin temel mekanizmalarına ışık tutuyor, ama çünkü Böylece, daha yüksek ökaryotik yeniden şekillenme komplekslerinin alt birimleri nucleosome yeniden şekillenme sürecine nasıl katkıda anlamak, değerli olan kromatin yapısı tarafından HIG ve gen ekspresyonuOnun ökaryotlar düzenlenir.

Bugüne kadar, sadece biyokimyasal tanımlanan kromatin remodeling kompleksleri ve subcomplexes elde zorluklar nedeniyle kısmen çoklu alt birim memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve işlevsel çalışmalar, orada sınırlı kalmıştır. Bu kısmen immün afinite temizliği kararlı bir şekilde N-terminal FLAG epitopu yabani tip ya da mutant Ino80 5-7 sürümlerini etiketli ifade eden insan hücrelerinden sağlam INO80 veya INO80 subcomplexes hazırlamak için kullanıldığı aşağıda tarif edilen prosedürler ile, bu zorlukların şekilde alt (Şekil 1) . Insan hücrelerinden gelen sağlam INO80 kompleksleri elde etmek için, Flp aracılı rekombinasyon kararlı biçimde INO80 kompleksinin alt-birimleri kodlayan 8-10 FLAG epitopu etiketli cDNA'larını ifade eden transgenik HEK293 hücre soyları meydana getirmek için kullanılır. INO80 alt birimlerinin aşırı ifadesi biraz toksik olduğundan, izole ve seçici kılıfı altında klonal hücre hatları korumak için gerekli olanşulları büyük ölçekli hücre kültürleri genişlemesi için gerekli olan bir çok geçitler boyunca sabit transgen ekspresyonunu sağlamak. Alt birimlerin yalnızca bir alt kümesini içeren küçük INO80 subcomplexes elde etmek için, biz başarılı iki yaklaşım kullanılmıştır (Şekil 2A, B). İlk olarak, belirli bir stably alt birimden 5 ile etkileşim için gereken etki eksikliği Ino80 mutant sürümlerini ifade eden HEK293 Flp olarak hücre hatları oluşturmak. Seçenek olarak ise, siRNA aracılı yok etme, uygun bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini (yayınlanmamış veriler) ifade eden hücrelerden istenen alt birimi tüketmek için kullanılır. Son olarak, insan INO80 kompleksleri arıtmak için BAYRAK agaroz kromatografisi göre 11 etkili bir şekilde saflaştırılmış INO80 veya INO80 subcomplexes içeren son fraksiyon sitosolik proteinler kirletici varlığının azaltılması, nükleer ekstreler bir INO80 içeren fraksiyonun zenginleştirmek için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Üretim ve tam uzunluktaki veya FLAG işareti Mutant sürümleri ifade eden HEK293 Sabit bir Hücre Soylarının Kültür epitop Ino80 ya da diğer alt-birimleri INO80 Kompleks

  1. Tam uzunlukta ya da mutant insan Ino80 ATPaz ya da in-frame, N-terminal FLAG epitop etiketi olan memeli ifade vektörü pcDNA5 / FRT içine bir INO80 alt birimini kodlayan cDNA klonu.
  2. Devam etmeden önce, DNA dizilimi yolu ile eklenen cDNA dizisini doğrulamak.
  3. Transfeksiyon gerçekleştirmek için, DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı),% 5 glutamin ihtiva eden bir ortam içinde 10 cm doku kültür tabaklarında HEK293 hücrelerinde FLP-büyür ve% 10 FBS (fetal inek serumu).
  4. Hücreler,% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, toplam hacim içinde, her bir doku kültür tabağına FuGene ™ 6 Transfeksiyon ayıracı 40 ul, uygun pcDNA5 / FRT ekspresyon plazmidi, 0.5 ug, ve Flp rekombinaz kodlayan pOG44, 9.5 ug oluşan bir karışım eklemek 800 ul.
  5. 48 saat sonra, trypsinize ve s01:30 plit 10 cm çanaklara doğru bir oranda hücre ve% 5 glutamin,% 10 FCS içeren DMEM içinde onları büyümeye ve 3 için 100 ug / ml higromisin B - 4 hafta. (- 5 gün genellikle her 3) o sararmaya başlar her kültür ortamı değiştirin.
  6. FLAG-etiketli proteinin en yüksek seviyede ifade eden pozitif klonların belirlenmesi için, tek tek higromisin B-dirençli koloniler seçmek ve bir 24-çukurlu plaka tek bir kuyusuna transfer edin.
    1. Hücreler 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile ~ 1 ml PBS ve pelet içinde, her bir oyuktan% 80 ortak akışkanlığa, hasat hücrelere ulaşır.
    2. Süpernatanın ayrılmasından sonra, SDS-PAGE numune tampon maddesi, 60 ul hücre pelletini.
    3. SDS sayfa ve FLAG ifadesini izlemek için blot için yeniden süspanse hücre pelet Konusu yarısı yem proteini etiketlendi; gelecek analizleri için diğer yarısını kaydedin.
  7. Herhangi bir FLAG-etiketli insan Ino80 protein hücre lizatlarında tespit edilirse, başlangıç ​​klonal hücre popu genişletmek15 cm doku kültür kaplarına bir 24-çukurlu plaka tek kuyulardan hücreler kaplanarak daha da lasyon.
    1. 15 cm'lik kaplar, 50 ml'lik bir konik tüp buz gibi soğuk PBS ile kaynaşık hücrelerin yakınındaki tekrar süspansiyon ve transferi hücreleri hasat etmek.
    2. Ek PBS eklenerek 50 ml'lik bir son hacme getirmek.
    3. Pelet 5 dakika boyunca 1000 x g'de hücreleri ve süpernatan mümkün olduğu kadar çıkarın.
    4. Lys450, 1 ml tampon içinde hücre pelletini (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.9, 450 mM NaCI tekrar süspansiyon,% 0.5 Triton X-100, 10 mM KCI, 4 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA,% 10 gliserol, 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli).
      NOT: Burada ve başka yerlerde, her zaman hemen bir deney başlamadan önce tamponlar DTT, PMSF ve proteaz inhibitörü kokteyl ekleyin.
    5. İmmüno-çökelti, anti-Flag agaroz jeli 20 ul kullanılarak elde edilen bütün hücre lizatı proteinleri FLAG-etiketli ve Western lekeleme yolu ile FLAG sıvı kısımlar analiz eder. [Immun ayrıntıları içinoprecipitation prosedürü, adım 5. bakınız]
  8. İstediğiniz klonal hücre hatları 12 dondurulmuş stokları hazırlayın ve kullanılıncaya kadar sıvı azot içinde saklayın.

Rulo şişeler 2. Büyüyen HEK293 Hücre Hatları

INO80 komplekslerin büyük ölçekli hazırlanması için, hücreler kültür içinde 10 - 20 silindir şişeler; her yuvarlanır şişeye tipik bir verim paketlenmiş hücre ~ 1 ml'dir.

  1. Her bir silindir için bir şişe, higromisin B olmadan 200 mi DMEM,% 5 glutamin, ve% 10 dana serumu, ekleme
  2. Her silindir bir şişe içine tek Yakın-konfluen 15 cm'lik tabağı alınan hücrelerin tüm aktarma
  3. Yer rulo 37 ° C inkübatör içine silindir şişe şişeler, 0.2 rpm'de döndürün.
  4. Hücreler ~% 70 confluency ulaştığınızda, kapalı dökün ve orta atın.
  5. Her şişeye ~ buz 50 ml soğuk PBS ilave edin. Şişe Holding yatay, yavaşça hücre tek tabaka gevşetmek için girdap.
  6. 250 mi plast üzere yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarınic konik şişeleri ve buz üzerinde yer.
  7. Ek PBS ile silindir şişe durulayın biberon şişesi sırayla aktarma. Çalkalama solüsyonu, artık kesin (tipik olarak yaklaşık 5 şişe yıkamak için kullanılan sonra değil), hücre süspansiyonu ekleyin.
  8. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
  9. Yavaşça, PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon tek bir 250 ml'lik konik şişe içine bunları birleştirmek ve daha fazla işlem kadar buz üzerinde tutmak.

Başka bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini ifade eden hücrelerde INO80 Altbirimlerin 3. siRNA aracılı Nakavt

Tek bir alt birimini eksik INO80 subcomplexes elde etmek için, kullanım FLAG immünolojik stabil bir şekilde eksprese eden shRNA, siRNA ile muamele edilmiş hücreler ya da hücrelerden INO80 kompleksleri arıtılması kolaydır. (Küçük müdahale RNA) transfeksiyon protokolü burada açıklanan "ters" SiRNA 15 cm yemekleri büyüyen HEK293 hücreler için optimize edilmiştir. Protokol hücreler ve sho tek bir 15 cm çanak içinULD gereken hücre sayısına bağlı olarak buna göre ölçeklendirilebilir. SiRNA ile muamele edilmiş hücrelerden INO80 kompleks biyokimyasal olarak faydalı miktarlarda hazırlanması için, tek bir 40 15 cm tabaklarda büyüyen kültürlerden kadar büyütülebilir edilmelidir; paketlenmiş hücre peleti 4 ml - yaklaşık 2, bu verecektir.

  1. Stabil 15 cm yemekleri yakın confluency INO80 kompleksinin istenen alt birimi ifade HEK293 hücreleri büyümek.
  2. SiRNA yeniden süspansiyon tamponu hacmi ekleme (20 mM KCI, 6 mM HEPES pH 7.5, ve 0.2 mM MgCI2), yeterli liyofilize siRNA içeren bir tüpe siRNA bir 50 uM stok solüsyonu hazırlanır. Çözelti pipetle yukarı ve aşağı birkaç kez ve siRNA tamamen eritilir sağlamak için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe nutator.
  3. SiRNA'ları ve transfeksiyon ayıracı içeren bir transfeksiyon kokteyl hazırlayın. Çok hafif bir karıştırma ile İndirgenmiş Serum Ortamı 32 ul Lipofektamin RNAiMAX ile 50 uM siRNA stok çözeltisi 10 ul karıştırın ve Opti-MEM, 4 ml eklemek; alDüşük bütün maddeler kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini.
  4. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
  5. Stabil olarak transfeksiyon için, istenen alt-birimini eksprese INO80 Flp olarak HEK293 hücrelerinin hazırlayın.
    1. Aşama 3.4 İnkübasyon sırasında, RT kez PBS ile 15 cm tabaklarda hücreleri yıkayın.
    2. Onlar plakayı kaldırarak başlar sadece kadar PBS çıkardıktan sonra, 1 ml tripsin hücreleri davranın.
    3. Hemen hücreler tripsinize edildi ve hafifçe karıştırmak için, tam bir ortamda (DMEM +% 5 glutamin +% 10 FBS), 10 ml ilave ediniz. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır.
    4. ~ 4 mi, tam bir ortamda hücre pelletini ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı yeniden süspanse.
    5. ~ 5.4 x 10 6 / ml 'lik bir konsantrasyonda komple ortam hücreleri seyreltin.
  6. Her 15 cm çanak, 4 ml transfeksiyon kokteyl ardından 15 ml tam bir kültür ortamı ekleyin. Thoro olan orta ve transfeksiyon kokteyl sağlamak için yavaşça karıştırınızughly karıştırılır. Son olarak, eşit hücrelerini dağıtmak için hafifçe girdap tekrar hücre süspansiyonu ekleyin ve bir ml.
  7. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde kültür 60 saat sonra, yavaşça ortam, buz gibi soğuk PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak ve çekirdek özütleri hazırlamak için hemen devam edin.

Nükleer özler 4. hazırlanması

Bu prosedür, Dignam 13'teki protokole göre modifiye edilmiş ve hücre pelletleri başlangıç ​​boyutuna bağlı olarak da aşağı yukarı ölçekli edilebilir. Tipik haliyle, paketlenmiş hücre topağı verimi nihai nükleer ekstre 1 ml 1 ml. Tüm tamponlar buz soğuk olması ve uygun bir soğuk oda mevcut değilse, bütün aşamalar, soğuk bir odada veya buz üzerinde yapılmalıdır.

  1. Çekirdekler izole edilmesi:
    1. Yavaşça 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de (15 veya 50 mi) uygun boyutlu bir hücrelerin konik bir tüp içinde ve spin mezun aktarın.
    2. Süpernatantı ve paketlenmiş hücre pel hacmini ölçmeklet. Paketlenmiş hücre 1 mi, 3 x 10 ~ 8 HEK293 hücrelerine karşılık gelir.
    3. 5 paketlenmiş hücre Tampon A hacimleri (: 1.000 proteaz inhibitör kokteyl, 10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI ve taze 1 mM DTT, 200 uM PMSF ilave edildi ve 1) ekleyin. Nazik pipetleme hücre pelletini.
    4. Tam 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de, hücreleri topaklamak ve supernatant çıkarın.
    6. Hücre topağı büyüklüğü Tampon A'da inkübasyon sırasında 2 katı kadar artmalıdır
    7. Tampon A'nın iki paketlenmiş hücre hacimleri hücrelerin tekrar ve uygun büyüklükte bir Dounce doku homojenleştirici için hücre süspansiyonu aktarın. Paketlenmiş hücre az 2 ml ile başlanırsa, bir 7 ml homojenleştirici kullanılması; 2 - 4 ml dolu hücreler, 15 ml homojenleştirici kullanın; ve paketlenmiş hücreler 10 veya daha fazla ml, 40 ml homojenleştirici kullanılır.
    8. Dounce homojenleştirici un SERBEST cam havan eli ile hücre süspansiyonu homojenizeHücrelerin% 90 til% 1 tripan mavisi ile pozitif leke.
    9. JA-17 rotor içinde ya da benzer, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 25,000 xg'de 45 mi, yüksek hızlı santrifüj tüpüne ve spin süspansiyonu aktarın (Malzeme / donatım arasında Tablo).
    10. Nükleer pelet kaynaktan, sitosolik proteinler veya parçalama sırasında çekirdek dışarı sızmasını protein içeren süpernatant, kaldırın.
  2. Tuz ile çekirdekleri ayıklanıyor:
    1. Ekleme Tampon C (20 mM HEPES, pH 7.9,% 25 gliserol, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA ve taze eklenmiş 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli), nükleer pelet; paketlenmiş hücre hacmi (~ 1 x 10 9 hücre) başlayan her 3 ml 2.5 ml Tampon C kullanın.
    2. Bir cam çubuk ya da bir pipet kullanarak, borunun çeperinden nükleer pelet çıkarmak ve bir uygun büyüklükte bir Dounce homojenleştirici Karışımın tamamını aktarın.
    3. TH homojenleştirilmesiyle çekirdekleri yeniden süspanseBir SERBEST havan eli, iki vuruş ile e karışımıdır.
    4. Soğutulmuş bir behere yeniden süspansiyon haline getirilmiş çekirdek fraksiyonu aktarın. Süspansiyon derin en az 0.5 cm kabı dolduracak şekilde bir beher seçin.
    5. Yavaşça buz üzerinde, bir pipet veya cam çubuk ile süspansiyon karıştırılırken kromatin veya diğer bir çözünür yapıları nükleer proteinlerini ekstre etmek için, kademeli olarak 5 M NaCl damla damla 0.42 M NaCI süspansiyonun tuz konsantrasyonunu arttırmak; 5 M NaCl her eklendikten sonra, çözelti, çok zor akışlı ya da jel benzeri bir hale gelmelidir. M NaCI, aşağıdaki formüle göre, 0.42 M NaCI nihai konsantrasyon elde edilecek şekilde bir çözüm getirmek için gerekli 5 hacim hesaplanır:
      Denklem 1
    6. Dikkatle Tip 45 Ti o bir Tipi 70.1 Ti rotor için 10 ml'lik polikarbonat tüp içine viskoz süspansiyon aktarın (veya eşdeğeri) veya 70 ml polikarbonat şişelerbenzer rotor (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) r. 70 ml şişe kullanıyorsanız 10 ml tüpler kullanarak veya kapak takımı ile eğer parafilmle sıkıca kapatılmalıdır.
    7. Yavaş yavaş Nutator ile 30 dakika boyunca 4 ° C'de kapalı tüpler sallayın.
    8. 4 ° C'de 120,000 x g'de, Tip 45 Ti veya 30 dakika boyunca 70.1 Ti rotor içinde örnekleri dönerler.
    9. Tek bir plastik tüp veya şişe süpernatant aktarın. Bu yüzer madde çekirdek ekstraktı, ve topak kromatin ve diğer nükleer artıkları içerir.
    10. , Elverişli ölçülü kısma bölün nükleer ekstre sıvı azot içinde dondurularak ve -80 ° C'de saklayın.

İnsan ya da INO80 INO80 subcomplexes 5. immün afinite temizliği

  1. Dondurulmuş nükleer ekstre çözülme için, donmuş madde kadar el arasında tezgah üstü ya da hareket borular üzerindeki özü içeren bir yer tüpleri, bir bulamaç haline gelir. Özü tamamen t kadar Sonra buz üzerinde veya soğuk odada tüplerihawed.
  2. Donma-çözülme devresi sırasında oluşabilen çökeltinin ayrılması için bir Tip 70.1 Ti rotor veya eşdeğeri, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 100,000 x g'de 10 mi çözülmüş nükleer polikarbonat ultra santrifüj tüplerine çıkarma ve döndürme aktarın.
  3. 15 ml konik tüp süpernatant aktarın. 1000 Proteaz İnhibitörü Kokteyli: 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1 nihai konsantrasyonlarda taze DTT PMSF ve protease inhibitör karışımı ekleyin.
  4. , Immün-anti-FLAG agaroz hazırlamak uç temiz bir bisturi ile kesilip edilmiş olan bir ucu olan bir P200 ya da benzer bir pipet kullanılarak bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne anti FLAG agaroz taneleri% 50 bulamaç 200 ul aktarmak veya jilet.
  5. 30 saniye için 8000 x g hızında çalışan tezgah üstü bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile boncuk Pelet. Süpernatantı, Lys450 ve 1 ml tampon içinde süspansiyon haline getirilerek boncuk boncuk yıkayın ve 30 saniye boyunca 8000 x g'de boncuk pelet. B yıkayıniki kez daha EADS.
  6. Uç temiz bir bisturi ya jilet ve aynı ucu kullanılarak transfer ile kesilmiş olan başka bir ucu ile bir P200 ya da benzer bir ayarlanabilir hacimli bir pipet kullanarak nükleer ekstre yaklaşık 100 ul yıkanmış anti FLAG agaroz boncuk tekrar Ekstraktı içeren 15 ml'lik konik tüpe yeniden süspansiyon haline boncuk. Boncuklar her 15 ml'lik bir tüpe transfer edilmiştir kadar birkaç kez tekrarlanır.
  7. Laboratuar rotator yavaş dönme ile, 4 ° C de 4 saat boyunca özü / boncuk karışımı inkübe edin. İSTEĞE BAĞLI: DNA safsızlığı uzaklaştırmak için 25 ünite / ml arasında bir konsantrasyonda Benzonase Dahil.
  8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile FLAG agaroz toplayın.
  9. 10 mi Lys450 içinde süspanse yıkama, nazik bir nutator sallanarak 4 ° C'de 5 dakika inkübe etmek. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de boncuk Pelet.
  10. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Lys450 ve transfer boncuk 150 ul - 100 süspanse edin. Coher boncuk mikrosantrifüj tüpüne aktarılmış kadar Lys450 150 ul - ntinue 100 ile 15 ml konik tüp durulayın.
  11. Bir mikrosantrifüj içinde 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 8000 x g'de boncuk aşağı dönerler. 1ml EB100 tamponu (10 mM HEPES pH 7.9,% 10 gliserol, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCI2,% 0.05 Triton X-100 ve taze eklenmiş 1 mM DTT, 200 uM PMSF ile bir defa 1 mi Lys450 ile üç kat daha fazla yıkayın ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli).
  12. , Bağlı proteinleri elüte 0.25 mg / ml 1 x FLAG peptidi içeren 200 ul tampon EB100 ekleyin. Bir nutator 4 ° C'de her biri 30 dakika inkübe edin.
  13. Bir mikrosantrifüj içinde 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 8000 x g'de boncuk Pelet. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne, taşınan INO80 kompleksini içeren süpernatant aktarın.
  14. Elüsyon, dört kez daha tekrarlayın, ve tek bir tüpün içine tüm süpernatantlar bir araya getirirler.
  15. Ayrıştırılan protein fraksiyonundan kalan FLAG agaroz taneleri uzaklaştırmak için,Boş bir dönüşlü kolonu eluatının geçmektedir.
  16. Yıkanan protein fraksiyonu konsantre ~ 10 kat, ultra santrifüj filtre tertibatı (50,000 molekül ağırlıklı akış kesici) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
  17. FLAG peptidi uzaklaştırmak için, iki tuz giderme kolonlarından konsantre edilmiş protein fraksiyonu, sırasıyla geçer.
  18. Sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanır, 20 ul alikotları saflaştırılmış, tuzdan arındırılmış protein parçasının bölün.
  19. Gümüş lekeli jeller üzerinde veya western blotting ile INO80 veya INO80 subcomplexes altbirim kompozisyon analiz ve standartlar gibi bilinen konsantrasyonda rekombinant INO80 alt birimlerinden preparatlar kullanılarak yarı-niceliksel Western blotting ile bunların konsantrasyonlarını tahmin ediyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 1 oluşturmak arındırmak ve insan INO80 ATP'ye bağımlı kromatin yeniden şekillenme kompleksleri karakterize etmek için kullanılan prosedürleri özetleyen bir akış şemasını göstermektedir.

Şekil 2 ve 3'te gösterildiği gibi, bu işlemler böylece INO80 ait enzimatik aktivite için bu alt-birimlerin eksik katkı müteakip biyokimyasal analizler sağlayan çeşitli altbirimleri taşımayan vahşi tip INO80 ve INO80 subcomplexes üretilmesini sağlar. 2 elimizdeki iki strateji tarif Şekil INO80 karmaşık mimarisini tanımlamak ve INO80 subcomplexes oluşturmak için kullanılır. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, ilk olarak, sağlam kompleksler INO80 vahşi tip birimden (Ies2 veya INO80E) FLAG-etiketli versiyonları ile saflaştırılır. Subcomplexes alt birimlerinin farklı ayarlar assem üzerinde tek tek etki eksikliği, mutant proteinlerin Ino80 epitop etiketli versiyonları ile saflaştırılabilirble. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, elde edilen kompleksleri saflığı, gümüş iyonları ile değerlendirilir komplekslerinin bileşim çeşitli INO80 birimden (Şekil 3B) karşı ya da kütle spektrometrisi ile antikorlarla birlikte western lekelenmesi kullanılarak değerlendirilir sırasında veri (SDS-poliakrilamid jelleri lekelenmemiştir gösterilir). Bu yaklaşımı kullanarak, Şekil 2A'da gösterilen kırmızı alt-birimleri Ino80 NTD (N-terminal alanı) silinmesi ile yok olduğunu bulmuştur; mavi gösterilen alt birimleri Ino80 HSA (Helikaz SANT İlişkili) etki silinmesi üzerine kaybedildi; ve uzun yerleştirme bölgesine (beyaz) ile ayrılmış ve SNF2N HelicC bölgeleri (Mor) oluşan SnF2 ATPaz etki, mor renkle gösterilen alt birimlere bağlama için gerekli ve yeterli olduğu. Yoksundur Böylece INO80 subcomplexes (INO80ΔN.com veya INO80ΔNΔHSA.com), kırmızı ve mavi, kırmızı gösterilen ya da alt üniteler de gösterilen alt birimleri FLAG Ino80ΔN veya FLAG INO80ΔNΔHS yoluyla saflaştırılabilirA, sırasıyla, 5.

Bu, uygun bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini (yayınlanmamış sonuçlar) ifade eden hücreler tek tek alt-birimleri tüketerek subcomplexes meydana getirilmesi de mümkündür. Şekil 2B'de gösterildiği üzere, birinci örnekte, alt-birimi X siRNA aracılı yok etme INO80 herhangi bir başka alt-birimlerin montajı için gerekli değildir X işaret INO80 kompleksi sadece X artışa neden olmaktadır. İkinci ve üçüncü örnekler olarak, Y ya da Z ya da yok etme siRNA Y ve Z bir karşılıklı bağlı bir şekilde INO80 kompleksi içine montajını gösteren, co-tükenmesi Y ve Z'nin her ikisinin de alt birimlerinin yol açar.

Şekil 1
. Şekil 1. Akış şeması, insan INO80 ATP'ye bağımlı kromatin yeniden modelleme kompleksleri oluşturmak saflaştırmak ve tanımlamak için kullanılan prosedürleri tarif F, bir N-terminali, çerçeve içerisinde FLAG epitop etiket; GOI, Gen-of-inmenfaati arasında fark. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2
Alt biriminden oluşan bir alt kümesini içerir INO80 subcomplexes üretmek için kullanılan iki strateji gösteren Şekil 2. diyagramı. (A) Ino80 ATPaz alt-birimleri için diğer INO80 monte edildiği modüler yapı iskelesi işlev bölgeleri içerir. (B) siRNA aracılı yok etme, uygun bir FLAG- ifade eden hücrelerden istenen alt birimi (X ya da Y ya da Z) boşaltmak için kullanılabilir etiketli INO80 alt birimi (örneğin, BAYRAK-Ino80ΔN). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3, Immüno INO80 kompleksleri ve subcomplexes bileşimin Şekil 3. Analiz. (A), kompleksleri ya da INO80 subcomplexes stabil bir şekilde SDS-poliakrilamid jel elektroforezine tabi belirtilen FLAG-etiketli proteinleri eksprese eden hücrelerden saflaştırılmış ve gümüş lekeleme ile görselleştirilmiştir. En sağdaki şeritte örnek herhangi bir FLAG-etiketli proteini ifade 293 ebeveyn hücrelerden hazırlanmıştır; Bu kontrol şeritte görünen protein FLAG agaroza spesifik olmayan bir şekilde bağlanan kirletici maddelerdir. Soldaki etiketler çeşitli INO80 alt birimlerine karşılık gelen bantları gösterir ve sağ moleküler ağırlık işaretlerinin hareketliliği ile ilgili olanlar. Vahşi tip Ino80 konumu siyah dikdörtgen ile gösterilir ve Ino80 mutantlarının pozisyonları açık daireler tarafından gösterilmiştir. Siyah çizgi ile ayrılmış ayrı ayrı şerit jel elde edilmiştir. (B) 'INO80 kompleksleri ve subcomplexes western blotting ile analiz edilmiştirtemsilcisi NTD, HSA alt birimden ve SnF2 modülleri karşı antikor kullanarak. Bu araştırma aslında Biological Chemistry Dergisi'nde yayımlandı. Chen ve arkadaşları, İnsan kromatin INO80 Tadilat Kompleksinin Alt-birim organizasyonu. Evrimsel olarak muhafaza edilmiş Çekirdek Kompleksi ATP'ye bağımlı Nükleozom Modelleme katalize eder. Pp. 11.283-11.289: Biyolojik Kimya Vol 286 Dergisi. © 2011, Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Amerikan Derneği. Tarafından bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yüksek Ökaryotlardaki çok altbirimli memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar mutant birimlerini içeren veya tamamen belli altbirimden yoksun bu tür komplekslerin biyokimyasal yararlı miktarlarda hazırlanması zorluk tarafından engellenmiştir. İlk olarak, memeli hücrelerinde genetik manipülasyon teknik zorlu ve zaman alıcı olmuştur: teknik engellerin vardır. Genomu kolaylıkla Recombineering teknikler kullanılarak düzenlenebilir ve hedef olabilir, maya hücreleri, farklı olarak, memeli genom yapısal olarak daha karmaşık ve Recombineering müdahalelere daha az duyarlıdır. Bu nedenle, kültürlenmiş hücreler ya da silme ya da hayvanlarda memeli genlerinin modifikasyonu daha fazla zaman alır ve daha özel uzmanlık gerektirir. Bunun bir sonucu olarak, mutasyona uğramış bir memeli kompleksleri yapısal mutasyonlar taşıyan ya da alt birim (ler) in alt kümeleri eksik olan üretim oranı sınırlayıcı olmuştur. İkinci olarak, biyokimyasal rekonstitüsyon hetero kullanan yaklaşımlarotolog protein ekspresyon sistemleri çoğu zaman, tanımlanmış bir protein derlemeler oluşturmak için kullanılır. Ancak, bu tür yaklaşımlar olan alt birimleri gerekebilir anda düzgün stokiyometriye ifade edilmesi ve / veya belirli chaperones veya kofaktör yardımıyla, belli bir düzen içinde monte edilmesi çok büyük kompleksleri için teknik olarak zor hale gelir. Onun Ino80 ATPaz alt-birimi, böcek ya da E. coli 'de ifade etmek özellikle zordur, bu sorunları INO80 kompleks durumunda özellikle şiddetli biyokimyasal olarak faydalı miktarlarda E. coli hücreleri. INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleksinin çalışmalarda, bu protokolde tarif stratejileri kullanarak bu zorlukların bazılarını aşmak mümkün olmuştur.

Çeşitli biyokimyasal A kullanılarak test edilebilir, iyi tanımlanmış bir kromatin biçimlenme komplekslerinin saflaştırılmasını sağlayan sabit bir şekilde INO80 kompleksinin epitop alt birimlerini ifade eden insan hücre çizgileri oluşturma, bu prosedürde bir adımdırssays. Bu yeniden birleştirici protein üretimi için memeli hücre hatları halinde tasarlanmış cDNA'ları sağlamak için geçici transfeksiyon kullanımı çok stabil hücre hatları oluşturmak için daha fazla zaman alıcı ilke olmasına rağmen, geçici transfeksiyon bazı sakıncaları vardır. İlk olarak, DNA içinde geçici olarak transfekte ekstra-kromozomal şeklinde hücre döngüsü sırasında kendi kendine yayılamaz genellikle kısa ömürlü vektör-ve. İkinci olarak, transfeksiyon verimi hücre tipi ve büyüme şartlarına bağlı olarak büyük ölçüde değişir. Heterojen transfeksiyon hücre popülasyonu içinde seçici bir büyüme avantaj ya da dezavantaj kazandıran bir mozaik ifade desenini neden olabilir. Bu nedenle, geçici transgenler proteinin biyokimyasal olarak faydalı miktarlarda saflaştırılması için gerekli olan hücrelerin büyük miktarda üretmek için gerekli olan bir çok hücre geçişleri sırasında kaybolan eğilimindedir getirmiştir. Stabil hücre hatları, en yaygın olarak, bir proteini şifreleyen cDNA'ların rastgele entegrasyona neden yöntemler kullanılarak oluşturulacakilgi. Bununla birlikte, rasgele entegre cDNA'lar, endojen genlerin ekspresyonunu bölmek ve birden fazla hücre geçişleri ile gen susturma tabi tutulur. Bu nedenlerden dolayı, genellikle cDNA stabil olarak stabil şekilde genomu içine entegre tek bir FRT sahası içine Flp rekombinaz aracılı yerleştirilmesi ile belirli bir kromozomal konuma dahil edildiği Flp aracılı rekombinasyon teknolojisi kullanılarak hücrelere Ino80 cDNA'ların getirmektedir.

Stabil hücre hatlarının seçimi sırasında, harici olarak ifade edilen, FLAG-etiketli, vahşi tip veya mutant Ino80 proteinleri tespit edebilmek için gereklidir. FLAG-etiketli Ino80 protein çoğu zaman çok düşük seviyelerde sentezlendiği ve bu nedenle sabit ya da bir 24-yuvalı plaka tek bir oyuk içinde yetiştirilen hücreler Ham lizatlarda, batı lekeleme ile tespit etmek mümkün değildir, bunun nedeni ilk klonal genişletmek için çoğu zaman gerekli olan hücre popülasyonu Ino80 proteinin ifadesi için tarama öncesinde sona erer. FLAG-etiketli Ino80 proteini, daha sonra saflaştırılabilir ve yardımcı olabilirönce Western lekeleme yolu ile analiz BAYRAK immün-ile ncentrated.

SiRNA aracılı Nakavt etkinliği transfeksiyon zamanda hücre yoğunluğuna karşı oldukça duyarlıdır; Biz transfeksiyonları protokolde önerilenin dışında yoğunluklarda hücreleri ile gerçekleştirilmiştir zaman demonte verimliliği azaldığı bulundu. SiRNA transfeksiyonu için uygun zamanın uzunluğu değişkendir ve bu hedef proteinin, protein kompleksleri olarak, hedeflenen bir proteinin devir hızı stabilitesine bağlı olarak, her bir hedef protein için ampirik bir şekilde tespit edilmesi gerekir ve protein derecesidir hücre canlılığı için gereklidir. Bireysel alt birimleri tüketmek için siRNA'lar geçici transfeksiyon kullanımına bir alternatif olarak, bir daha kolay ve daha gerekebileceğinden bir selektif basınç altında stabil bir şekilde eksprese eden hücre çizgileri shRNAs üreten daha uygun olabilir maliyetli bu tip hücre çizgileri arasında biyokimyasal olarak faydalı miktarlarda büyür. Ancak, zor kanıtlayabilirimstabil hücre hatlarında shRNA aracılı demonte kullanmak yeterlidir demonte elde edildi.

Ayrıca prosedürün başarısı için önemli INO80 komplekslerinin saflaştırılması için başlangıç ​​malzemesi olarak nükleer ekstrelerin kullanımıdır. Bu bütün hücre ekstrelerinden immuno-saflaştırılmış INO80 kompleksleri çoğu zaman, ATP ve / veya Ino80 ATPaz bağımsız nükleozom yeniden modelleme faaliyetleri ile kirlenmiş olduğunu bulmuşlardır; kompleksleri çekirdek ekstraktlanndan saflaştırılır bu tür kirlilik önlenir.

Nükleer özler ve sağlam INO80 komplekslerinin izolasyonu hazırlanması kritik bir dizi faktöre bağlıdır. İlk olarak, nükleer ekstrelerini hazırlamak için, hücreler, sağlam ve sağlıklı olmalıdır. Hücre topağı yıkandı kadar şişebilir beklenen iki misli hücre şişer olmayan ve / veya üstte yüzenler hücre başlangıç ​​popülasyonu sağlıksız olabilir, bu aşamada bulanık hale gelmeye başladığı takdirde hipotonik tampon A içinde, inkübasyonu takiben. Alternatif, Hücreler yeniden süspansiyon haline getirme ya da hasat adımları sırasında çok yaklaşık ele olabilir, ya da A tamponu İkinci çok uzun süre inkübe edilmiş olabilir, bu kromatin ve kesme gibi, hücreleri ya da nükleer pelet over-homojenize etmek önemlidir çözünebilir fraksiyon DNA'yı serbest bırakın. Eriyebilir bölümündeki DNA daha sonra saflaştırma ve INO80 komplekslerinin deneyi engelleyebilir. Özellikle, DNA kirletici böylece de çamaşır yıkama ve elüsyon basamaklarının etkinliğini azaltan ve / veya nihai saflaştırılmış fraksiyonda, DNA-bağlayıcı proteinler kirletici bolluğu artırabilir, agaroz, anti-FLAG ekstrenin inkübasyon esnasında çökeltilerin miktarlarda oluşmasına yol açabilir . Buna ek olarak, DNA bağımlı olan alt baş biyokimyasal yöntemlerle ölçmek faaliyetleri, ekstreden DNA, bu olası aktarılma Bu tahlillerin yorumunu komplike edebilir. Aşırı homojenleştirme kaçınmak için, hücre erimesi esnasında tripan mavi-pozitif hücre yüzdesi kontrol edilmesi tavsiye edilirhomojenleştirici her inme sonrası s; homojenizasyon 6 - vuruş HEK293 hücreleri için, yakın komple hücre erimesi genellikle 4 gerektirir. Aynı zamanda, bir solüsyonuna eklenir hava kabarcıklarının katılmasının önüne geçmek için çok önemlidir. Aşama 4.2.8 'de 120,000 x g spin Süpernatan sadece çok az kromatin pelet yakın bulanık veya yapışkan madde miktarı ya da üstünde yüzen berrak, viskoziteli bir solüsyon olmayan olmalıdır. Süpernatantı toplarken kromatin ve / veya DNA içerebilir gibi, bir, bulutlu ya da viskoz malzemenin herhangi toplamak için değil dikkat etmelisiniz. Son olarak, donmuş hücrelerden hazırlanan kompleksler daha düşük bir spesifik aktivite sergilediği ve daha fazla kirletici DNA ve proteinler dahil etme eğilimi, çekirdek özütleri hazırlamadan önce hücreler, donma önlemek için daha iyidir.

Özü ve anti-FLAG agaroz başlangıç ​​değeri arasındaki optimum oran özü ve accessibi bulunan FLAG yem proteinin konsantrasyonuna bağlıdırFLAG epitopu ve ihtiyaçların vasıflı ampirik olarak tespit edilmesi. Genellikle anti-Flag agaroz taneleri, 100 ul yatak hacmi ve 3 immünolojik başlar - nükleer ekstre 14 ml; kullanılan ekstresinin miktarı deney ve özü kullanılabilirlik hedeflerine bağlıdır. Anti FLAG agaroz kullanılarak tek bir aşama genellikle immünolojik faaliyetlerinin güvenilir deneyleri için yeterli bir dereceye değin veya INO80 INO80 subcomplexes saflaştırmak için yeterlidir; Bununla birlikte, jel filtrasyonu, yoğunluk gradyanlı sedimentasyon, veya iyon değiştirme kromatografisi gibi ilave arıtma kademe (leri), diğer kompleksler saflaştırılması için gerekli olabilir veya biyokimyasal tahlillerin yorumlanması karmaşık hale kontamine edici etkinlikleri çıkartılmak üzere.

Burada tarif edilen stratejiler daha genel olarak yararlı olan diğer kromatin yeniden şekillenme enzimler üzerindeki çalışmalar, hem de diğer büyük multiprotein kompleksleri için olmalıdır. Diğer mu analizlerine Bu stratejilerin başarılı bir şekilde uygulanmasıltiprotein kompleksleri diğer alt-birimleri monte edildiği iskelesi (ler) ve alt birimlerinin spesifik alt monte hangi belirli alanlarda veya bölgelerin, (ii) olarak hizmet tanımı tek bir alt biriminin ya da alt birim (ler) (i) ile konur. Bu etki bilinen tanımı yapısal alanlarına tekabül evrimsel olarak korunmuş bölgeler ya da bölgeleri için çekirdek iskele alt birim (ler) in primer dizisini analiz edilerek kolaylaştırılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarların laboratuvar İş Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (GM41628) bir hibe ile ve Büyükşehir Kansas City Community Vakfı Helen Nelson Tıbbi Araştırma Fonundan Tıp Araştırma Enstitüsü Stowers bir hibe ile desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cellgro 10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine) Life Technologies 35050-079
Fetal Bovine Serum SAFC 12176C
FuGENE6 transfection reagent Promega E2312
Hygromycin B, sterile in PBS AG Scientific H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector Life Technologies V6010-20
Flp-In HEK293 cells Life Technologies R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector Life Technologies V600520
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma F2426
calf serum SAFC 12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool Dharmacon / Thermo Scientific various
5x siRNA resuspension buffer Dharmacon / Thermo Scientific #B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX Life Technologies 13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 51985-091
PBS Cellgro 45000 VWR
TrypLE (trypsin) Life Technologies 12604
1x FLAG Peptide Sigma F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column Bio-Rad 737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) Amicon UFC805024 Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns Thermo Scientific 89882
Anti-FLAG M2 antibody, mouse Sigma F3165
Anti-FLAG M2 antibody, rabbit Sigma F7425
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340
benzonase Novagen 70664
Equipment
JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge Beckman-Coulter 339080
JA-17 rotor Beckman-Coulter 369691
10 ml polycarbonate tubes Beckman-Coulter 355630
70 ml polycarbonate bottles Beckman-Coulter 355655
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter 339160
Type 70.1 Ti rotor Beckman-Coulter 342184
BD Clay Adams Nutator Mixer BD Diagnostics 15172-203 VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator Glas-Col 099A RD4512
PCR thermal cycler PTC 200 MJ Research PTC 200
roller bottle incubator Bellco biotechnology 353348
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 Millipore IPFL07810
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes Costar 3207

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
  2. Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15, (5), 469-476 (2008).
  3. Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406, (6795), 541-544 (2000).
  4. Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
  5. Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286, (13), 11283-11289 (2011).
  6. Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5, (5), 521-527 (1994).
  7. Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251, (4999), 1351-1355 (1991).
  8. Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280, (50), 41207-41212 (2005).
  9. Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14, (9), 872-874 (2007).
  10. Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31, (6), 909-917 (2008).
  11. Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16, (4), 730-735 (1994).
  12. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 207-245 (2005).
  13. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11, (5), 1475-1489 (1983).
Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, R. C., Conaway, J. W. Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes. J. Vis. Exp. (92), e51720, doi:10.3791/51720 (2014).More

Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, R. C., Conaway, J. W. Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes. J. Vis. Exp. (92), e51720, doi:10.3791/51720 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter