Modellering stroke hos möss: Permanent Koagulation av den distala Middle Cerebral Artery

Summary

Olika musmodeller av mellersta cerebral artär ocklusion (kortex) används ofta i experimentell hjärnforskning. Här visar vi en modell av transkraniell permanent distal kortex som producerar konsekvent kortikal infarkt av en storlek som motsvarar skador som tas ut av de flesta mänskliga ischemisk stroke.

Abstract

Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken och den huvudsakliga orsaken till förvärvad vuxen funktionshinder i utvecklade länder. Endast mycket begränsade terapeutiska alternativ är tillgängliga för en liten andel av strokepatienter i akutskedet. Aktuell forskning intensivt efter nya terapeutiska strategier och i allt högre grad fokuserar på subakut och kronisk fas efter stroke eftersom fler patienter skulle kunna vara berättigade till terapeutiska ingrepp i en längre tid. Dessa fördröjda mekanismer inkluderar viktiga patofysiologiska vägar såsom post-stroke inflammation, angiogenes, neuronal plasticitet och regeneration. För att analysera dessa mekanismer och att därefter utvärdera nya målproteiner, är experimentell stroke modeller med klinisk relevans, låg dödlighet och hög reproducerbarhet eftertraktade. Dessutom, möss är de minsta däggdjur, där en fokal stroke lesion kan induceras och för vilka ett brett spektrum av transgena modeller ärtillgängliga. Därför beskriver vi här musmodellen av transkraniell, permanent koagulering av den mellersta cerebrala artären via elektrokoagulation distala av de lenticulostriatal artärer, den så kallade "koagulation modell". Det resulte infarkt i denna modell ligger främst i cortex; den relativa infarktvolymen i förhållande till hjärnans storlek motsvarar de flesta mänskliga drag. Dessutom har modellen uppfyller de ovannämnda kriterierna för reproducerbarhet och låg dödlighet. I denna video visar vi de kirurgiska metoder för stroke induktion i "koagulering modellen" och rapportera histologiska och funktionella analysverktyg.

Introduction

Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken och en de viktigaste skälen för förvärvade vuxen funktionshinder i utvecklade länder ^1. Cirka 80% av denna akut neurologisk sjukdom orsakas av ischemi i hjärnan till följd av en förträngning i cerebralt blodflöde medan ca 15% orsakas av en intracerebral blödning ^2. Trots pågående forskning, är intravenös administrering av vävnadsplasminogenaktivator den enda godkända farmakologisk behandling för ischemisk stroke hittills och bara tillgänglig för en minoritet av strokepatienter på grund av den korta godkända tidsfönster på 4,5 timmar efter strokedebut ^3,4. Eftersom det inte finns några in vitro-modeller, som på rätt sätt kan modellera de komplexa sambanden mellan hjärnan, kärlsystemet och systemiska patofysiologiska mekanismer under stroke, djurmodeller är viktiga för preklinisk strokeforskning.

Därför har flera ischemisk stroke modeller utvecklats i en variabelhället av arter. En av de mest allmänt använda stroke-modeller är "filamentmodell", där en suturfilamentet transient införes i den inre halsartären och vidarebefordras till dess att spetsen ockluderar ursprunget av mellersta cerebrala artären (MCA), vilket resulterar i ett stopp av blodflödet och efterföljande hjärninfarkt av subkortikala och i händelse av långvarig ocklusion också kortikala regioner ^5,6. I photothrombotic modeller av ischemisk stroke, är en fotokemisk ocklusion av det bestrålade kortikala kärl uppnås efter injektion av ett fotoresulterar i små, lokalt avgränsade lesioner ^7. Den permanent ocklusion av MCA distala av de lenticulostriatal artärer kan uppnås genom en ligering av artären, dess övergående sammanpressning eller genom att permanent koagulering ^8,9. Det resulte infarkt i denna modell påverkar främst neocortex ¹⁰ eftersom ocklusion av MCA i denna modell är distalt om lenticulostriatal artärer, som förser de basala ganglierna.

Eftersom majoriteten av mänskliga stroke lesioner är belägna inom territoriet för den mellersta cerebral artär, alla de vanliga strokemodeller liknar ocklusioner av MCA eller en av dess grenar ^11. MCA är en av de större artärerna som ger blodtillförsel till hjärnan; den härrör från den inre halspulsådern, vägar längs den laterala sulcus där det då grenar och projekt till de basala ganglierna och sidoytorna på frontal, parietal och temporal lober, däribland den primära motoriska och sensoriska cortex. Den högra och vänstra MCA är anslutna till de främre hjärnans kärl och den bakre kommunicera artärerna, som ansluter till de bakre cerebrala artärer, skapar Circle of Willis (Figur 1).

Som tidigare rapporterats av Carmichael et al. ^11, infarkter modelleras av den distala Middle Cerebral Arbatteri ocklusion (kortex) modell hos möss omfattar ca 10-15% av halvklotet, och därigenom härma en majoritet av mänskliga stroke lesioner som är belägna i den kortikala MCA territorium ^11,12. År 1981 Tamura et al. Beskrev en permanent, transkraniell kortex koagulation modell på råttor ^8. Men den modell som beskrivs av Tamura involverade en proximal ocklusion av MCA för att kringgå de mer distala förgrening av artären. Således, den ursprungliga "Tamura-modellen" framkallar inte bara bark men även striatala lesioner, som liknar de skador som erhållits genom "glödtrådsmodellen" ^6. Här beskriver vi den permanenta distala MCAO-modell av transkraniell elektrokoagulation i möss. Dessutom rapporterar vi tillhörande histologiska och funktionella metoder för att analysera slag utfallet i denna modell. Alla metoder är baserade på standardrutiner som utvecklats och används i våra laboratorier.

Protocol

Ethics uttalande

Experimenten som redovisas i denna video har utförts i enlighet med nationella riktlinjer för användning av försöksdjur och protokollen godkändes av den tyska statliga kommittéer (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). 10 veckor gamla, hankön C57BL/6J möss användes i denna studie. Djuren hölls under kontrollerade temperatur (22 ± 2 ° C), med en 12 h ljus-mörker-cykel period och tillgång till pelleterat foder och vatten efter behag. Smärtlindring och sedering protokoll beskrivs som godkänts av den lokala statliga kommittén men kan skilja sig från protokoll som används i andra laboratorier.

1. Beredning av material och instrument

1. Anslut värmefilt för att upprätthålla arbetsområdet varmt och upprätthålla musen kroppstemperaturen under anestesi (37 ° C).
2. Förbered autoklaveras sax, pincett och bomull, dexpanthenol ögonsalva och suturmaterial. Bered en spruta med saltlösning (utan nål) för att upprätthålla arbetsområdet hydrerad. Förbered anestesi-gas (70% N ₂ O + 30% _O2 + isofluran).
3. Injicera analgetika intraperitonealt: Metamizol 200 mg / kg, Karprofen 4 mg / kg och buprenorfin 0,1 mg / kg.
4. Placera musen i induktionskammare med en isofluran flöde på 4% för att söva den tills spontan rörelse av kroppen och vibrissae stannar.
5. För över musen i sidoläge med nosen in i anestesi masken och hålla isofluran koncentration på 4% för ungefär en minut, sedan minska och den på approx.1.5% för att bibehålla lämplig anestesi.
6. Applicera dexpantenol ögonsalva på båda ögonen.

2. Distal kortex modell

1. Gör en 1 cm hud snitt mellan örat och ögat med hjälp av små drift sax efter aseptical beredning av operationsområdet using huden desinfektionsmedel.
2. Separera den hud och lokalisera den temporala muskeln.
3. Välj i högfrekvensgenerator koagulation funktionen, bipolärt läge väljer 12 W och anslut elektrokoagulering pincett med kabeln.
4. Tillsätt en droppe av saltlösning och använd pincett för att lösgöra den temporala muskeln från skallen i dess apikala och dorsala del, därmed, vilket gör en muskel klaff utan fullständigt avlägsnande av muskeln.
5. Identifiera den MCA nedanför den transparenta skalle, i den rostrala delen av det temporala området, dorsal till retro-orbitala sinus (Figur 2A). Om MCA bifurkationen är inte synlig (på grund av en anatomisk normal variation) identifiera fartyget mest rostral.
6. Lägg till lite saltlösning på skallen och tunna ut benet med borren precis ovanför MCA grenen tills den har en tunn och genomskinlig textur (Figur 2B).
7. Försiktigt dra benet över artären med en mycket tunn pincett.
8. Välj bipolärt läge in den högfrekventa generatorn vid 7 W. koagulera artären med elektrokoagulering pincett proximalt och distalt till bifurkationen (figur 2C). När förgreningen inte är synlig på grund av en anatomisk variant koagulera korrekt identifierats MCA gren (se ovan) vid två platser på ca. 1 mm avstånd. Det är inte nödvändigt att ta tag i artären med pincett för koagulering, röra artären försiktigt med pincett på båda sidor från ovan är tillräcklig och inducerar mindre mekaniska skador.
9. Vänta 30 sekunder och försiktigt röra artären med trubbiga pincett för att kontrollera om blodflödet på grund av spontan recanalization. Vid recanalization upprepa elektrokoagulering gång.
10. Flytta den temporala muskler till sin position, som omfattar borrhålet.
11. Sutur såret och placera djuret i en ammande låda vid 32 ° C för att återhämta sig från anestesi och returnera den till buren. I allmänhet tar det från 5 till 10 min för djuret att återhämta sig från AnesthESIA.
12. Injicera postoperativ smärtlindring (ip) efter 24 timmar och därefter dagligen tills den femte postoperativa dagen: Karprofen 4 mg / kg.

3. Sham Operation

Utför alla förfaranden identiskt med det sätt som beskrivs ovan - inklusive gallring av skallen och dess borttagning - med undantag för att inte koagulera den exponerade artären.

4. Cylinder Test ¹³

1. Placera djuret i en transparent akrylglascylinder (diameter: 8 cm, höjd: 25 cm) framför två speglar och videoband för 5 min. Justera kamerans centralt framför de två speglarna och cylindern för att erhålla en optimal video (figur 3A).
2. För bedömning av oberoende forelimb användning, värdering (1) kontakt av cylinderväggen med en forelimb under hela bak och (2) landning med bara ett framben på golvet efter full bak. Räkna minst 20 kontakter för en forelimb använda slow motion eller bild-för-framn funktion Video Lan Client (VLC) freeware programvara ( http://www.videolan.org/vlc ).
3. För baslinjen analys innan operationen: genomföra testet två gånger per mus, med en 1 tim paus mellan försöken. Forelimb användning är uttryckt som ett förhållande mellan höger / vänstersidig, oberoende forelimb användning.
4. Efter MCA koagulering: utföra testet igen två gånger per mus, med en 1 tim paus mellan försöken som anges ovan.

5. Perfusion

1. Söva djuren (t.ex. med ketamin och xylazin 120/16 mg / kg kroppsvikt, respektive).
2. Fixa djuret i ryggläge och öppna bukhålan med en median cut. Ta bort revor och bröstbenet. Gör ett litet snitt i höger förmak. Sätt i en perfusion kanyl i vänster kammare och långsamt BEGJUTA med 20 ml koksaltlösning.
3. Halshugg djuret öppnar calvaria och försiktigt dra av hjärnan från basen av skallen.

6. Infarkt volumetry

1. Kryosektionering: Skär hjärnorna i serie på en kryostat till 20 um tjocka sektioner var 400 nm på diabilder och lagra bilderna vid -20 ° C.
2. Kresylviolett (CV) färgning:
   1. Förbered färglösningen: Blanda 0,5 g CV acetat i 500 ml _H2O Rör om och värm (60 ° C) tills kristaller är upplösta. Låt lösningen svalna och förvara i en mörk flaska. Värm till 60 ° C och filtrering innan varje användning.
   2. Torka de glider vid RT under 30 min. Sedan placera dem i 95% etanol under 15 min och sedan i 70% etanol under 1 min och därefter i 50% etanol under 1 min.
   3. Placera glasen i destillerat vatten i 2 min, uppdatera destillerat vatten och placera dem i 1 min. Efteråt placera glasen i färglösningen (60 ° C) feller 10 min och tvätta dem två gånger i destillerat vatten under 1 min.
   4. Placera glasen i 95% etanol i 2 min. Sedan placera dem i 100% etanol i 5 min, uppdatera 100% etanol och placera dem i 2 min. Efteråt täcka glasen med monteringsmedel.
   5. Analys:
      Skanna diabilder och analysera indirekta infarktvolymen med Swansons metod ¹⁴ för att korrigera för ödem:
      (Ischemisk område) = (Cortex området kontralaterala sidan) - (icke-ischemisk cortex området ipsilateral sida) (Figur 4A).

Representative Results

På grund av den korta anestesi tid och måttlig hjärnskada, ca 10 min efter överföring till sina burar alla djur var vakna, fritt röra sig i buren och interagera med syskon. Dödligheten under kortex operation var mindre än 5%, främst till följd av oavsiktlig subaraknoidalblödning eller felaktig anestesi. Dödlighet under 7 dagar långa observationstiden efter stroke induktion uppträder mycket sällan hos cirka 1-2% av djuren. Vid drift serie av 10 djur för denna rapport alla djuren överlevde operationen och den 7 dagar långa observationsperioden, ingen av dem måste uteslutas på grund av uteslutningskriterier.

Beteendestörningar efter MCA koagulation bedömdes av cylindertestet ¹³ analysetassarna använda asymmetri. I detta test är förhållandet mellan oberoende vänster och höger framtassarna användning mäts vid de angivna tidpunkterna efter stroke induktion och jämfört med utgångsvärdena som erhålls 24h före MCAO (figur 3B). Djuren presenterade en betydande förändring i lem bruk asymmetri för kombinerad vägg prospektering i cylindertestet 24 tim (1,72 ± 0,326, p <0,05) och 3 dagar (1,36 ± 0,17, p <0,05) efter kortex. Även förhållandet förbättrades under 1 vecka observationstid, motor asymmetri var fortfarande signifikant 7 dagar efter kortex (1,35 ± 0,29, p <0,05) jämfört med utgångsvärden.

Vi utförde infarkt volumetry använder kresylviolett färgas serie koronala hjärnan sektioner 7 dagar efter stroke induktion (Figur 4B). Medelvärdet infarktvolymen var 15,4 mm ^3, och därmed representerar 12% av den ena hjärnhalvan (Figur 4C). Variabiliteten av detta slag modell är exceptionellt låg med en standardavvikelse av cirka 10%. Det skadade området omfattar somatosensoriska och motoriska cortex med endast mindre tillgivenhet av subkortikala strukturer. Dessutom lokalisering av infarktOmrådet är starkt förutsägbar med endast minimal variabilitet, såsom visas i den schematiska fördelningsdiagram (figur 4D).

Figur 1. Schematisk representation av Circle of Willis. Den arteriella Circle of Willis bildas av de mellersta cerebrala artärer (MCA) och de främre hjärnans kärl (ACA) vilken gren från den inre halspulsådern (ICA), samt av den posterior cerebral artärer (PCA) och den bakre kommunicera artärerna (PComA). MCA springer in i den laterala sulcus där den grenar till hjärnbarken. Den dominanta MCA gren levererar den större delen av den motoriska cortex och en del av den somatosensoriska cortex är permanent tilltäppt av den demonstrerade modellen (acoma = Anterior kommunicerande artären; BA = basilaris artär; Suca = Överlägsen cerebellar artär).

Figur 2. Transkraniell vy efter avlägsnande av den temporala muskeln och schematisk vy av MCA-ocklusion. (A) Efter att den temporala muskler de kortikala artärer kan ses genom den delvis genomskinliga musen skallen (i 8-12 veckor gamla möss). Den dominerande MCA grenen kan identifieras i den rostrala delen av den tidsmässiga syn, samt ytterligare kortikala artärer förgreningar från MCA och PCA i den näst sista delen. (B) Schematisk bild på den dominerande MCA filial i sitt övervägande variation med en bifurkation på sidotemporal cortex efter borrning av ett borrhål och avlägsnande av skallen. (C) Svarta fyrkanter representerar MCA koagulations ställen vid de proximala och distala sidorna av bifurkation.

Figur 3. Analys av beteendestörningar. (A) Cylinderprovuppställning: musen placeras i en vertikal cylinder och speglar är placerade bakom för att registrera alla rörelser med hjälp av en videokamera (B) Forelimb använda asymmetri analyserades med hjälp av cylindertestet.. Vänster / höger förhållanden av oberoende forelimb användning beräknades 24 timmar innan kortex och vid de angivna tidpunkterna efter stroke induktion. N = 10, * p <0,05 mellan angiven tidpunkt och baslinje (kontroll) värde.

Figur 4. Volumetric infarktanalys och infarkt resultatet efter distal kortex. (A) representant bild av en kresylviolett färgas coronal bhi avsnitt 7 dagar efter kortex. Den gula linjen indikerar val av kontra (höger) cortex och den röda linjen är att välja icke-infarkt (färgade) cortex av ipsilaterala hjärnan. Den bleka område i den vänstra hjärnhalvan visar infarktvävnadsområdet. (B) infarktvolymen analys av 10 hjärnor (varje punkt representerar en enskild hjärna) 24 tim, 3 dagar och 7 dagar efter distal MCA koagulation. Den horisontella röda linjen representerar medelvärdet, felstaplar visar standardavvikelse. (C) Representant kresylviolett färgade koronala hjärnan sektioner var 400 nm vid 7 dagar efter MCA koagulation. (D) Schematisk fördelning av infarkthjärnvävnad 7 dagar efter kortex. Varje bild visar den samlade informationen av infarkt utgåvan (färgkodade enligt vad som anges) vid den angivna sektionen i förhållande till bregma (modifierad bilder från:. Liesz A et al, Brain, 2011, med tillstånd av Oxford University Press). <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Föreliggande protokoll beskriver experimentell stroke-modell av distal, permanent MCAO av transkraniell elektrokoagulation - den så kallade "koagulering modellen". Denna modell har under tiden blivit en av de mest använda djurmodeller i experimentell stroke forskning ^12. Jämfört med andra fokala hjärnischemimodeller, modellen koagulation som presenteras i denna video har fördelen av en mycket kort driftstid på ungefär 10 min när de utförs av en utbildad vetenskapsman. Därför kan korta anestesi tider uppnås i denna modell, vilket är ett positivt inslag i en experimentell stroke modellen eftersom effekten av bedövningsmedel för neuroprotektion och stroke resultatet är välkänt ^15. Dessutom, såsom tidigare beskrivits av Carmichael et al. ^11, bekräftar vi att den resulterande infarktvolymen och lokalisering efter distala permanent MCA koagulation motsvarar ischemiska hjärnskador i majoriteten av humanaslag i förhållande till hjärnans storlek. Human stroke är huvudsakligen små i storlek med skador på cirka 5-15% av halvklotet, baserat på tidigare populationsstudier och kliniska avbildnings prövningar ^16-18, i motsats till omfattande stroke lesioner med tryckhjärnödem, som förekommer i mindre än 10% av klinisk stroke ^19. Därigenom kan stroke lesioner i MCA territorium på cirka 12% av halvklotet uppnås av presenterade modellen ses som ett translationellt relevant slagvolym. Emellertid måste man ta hänsyn till att olika musstammar eller begagnade anestesiprotokoll kan påverka den resulterande lesionen volym ^20.

Dödlighet under observationsperioden efter stroke induktion i denna modell är så gott som frånvarande. Den totala dödligheten på mindre än 5% utgörs främst av dödsfallen under drift på grund av anesthesiological komplikationer eller offer, eftersom att nå av uteslutningskriterier. För att motivera den låga variability av denna modell och dess utmärkta reproducerbarhet, föreslår vi följande exklusionskriterier: 1) Alla subaraknoidalblödning under operationen. 2) Drift tid längre än 15 minuter. 3) Recanalization av MCA efter två försök för elektrokoagulering med endast övergående kortex. Dessutom djur måste undersökas dagligen efter kortex (grundläggande fysiologiska beteende, päls utseende och kroppsvikt) för att kontrollera för smärta, obehag eller sjukdom beteende.

Flera åtgärder skulle kunna genomföras för analys av stroke utfall som laser speckle mätning, magnetisk resonanstomografi, beteendetester eller histologisk analys. I detta protokoll ger vi föredömliga metoder för beteendeanalys och infarktvolym analys. Flera test för beteendeanalys efter fokal hjärnischemi har utvecklats och använts i experimentell stroke forskning. Lämpliga tester för sensorimotor dysfunction tidigare använts av vår grupp i detta slag modell ^21,22 vire Rotarod testet ^23, Sticky etikettprov ^24, Corner testet ²⁵ och cylindertestet ^13, vilket visar sig i den här videon. Cylinder testet visar genomgående motor asymmetri i den akuta fasen efter distal permanent kortex och även upptäcker rad återfå av motorisk funktion.

Trots de uppenbara fördelar, vissa begränsningar av denna slaglängd modell måste beaktas. För det första behövs ett trepanation av skallen för att koagulera artären, varigenom en potentiell tillgång för peri-operativa infektioner i hjärnan, även om bakteriella infektioner i operationssår, temporal muskel eller hjärnan själv aldrig har upptäckts av oss själva eller dokumenteras av andra som använder denna modell. Dessutom kan mekaniska skador på hjärnbarken under beredning och koagulation inte uteslutas men kan begränsas genom noggrann borrning och borttagning av skallen, konstant fuktning av operationsområdet och minimal ne vändig elektrokoagulering (se uteslutningskriterier). Även om loppet av MCA som visas i figur 2 återfinns i de flesta C57BL / 6 möss, vi beskriver i protokollet hur man ska gå vidare i normala variationer av fartygets kurs för att minimera modell variabilitet. Dessutom föreslår vi att använda multipla (3 vid bifurkation, 2 utan bifurkation av MCA) ocklusion webbplatser för att minimera risken för partiell omkanalisering av MCA, som enligt vår erfarenhet är en viktig faktor för variationer i denna modell.

I termer av beteendetester, kan endast mindre beteendestörningar detekteras i de ovan nämnda beteendetester och funktionell regenerering kan observeras inom den första veckan efter stroke. Således kan mer avancerade testsystem med högre känslighet och kvalitativa testparametrar såsom skickliga nå testet ²⁷ vara mer lämpade för att upptäcka långsiktiga funktionella resultatet i denna modell.

ontent "> Slutligen ger dock en tidigare beskrivna tromboembolisk stroke modell ²⁶ på grund av den permanenta koagulering av MCA ingen reperfusion kan erhållas, vilket är en funktion som observerats i en betydande andel av strokepatienter på grund av spontan trombolys eller terapi ^28. alternativet för en gratis stroke-modell med reperfusion av kortikal hjärnischemi. Sammantaget hög reproducerbarhet, den möjliga långsiktiga observation på grund av minimal dödlighet och den jämförbara relativa infarktvolym och lokalisering i förhållande till människans stroke särskilja "koagulering-modellen" som en värdefull modell för grundforskning och translationell strokeforskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera Canon Eos 500D	Canon		Optics: 18-55 mm; 30 fps; 640 x 480 video function
Mirror	Kristallform	2677089	30 x 30 cm
Transparent acrylic glass cylinder	H&S Kunststofftechnik		Diameter: 8 cm,  height: 25 cm
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller
Fine Scissors	FST	15000-00
Mayo Scissors	FST	1410-15
Forceps	FST	11616-15
Cottons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Saline solution	Braun	131321
Bepanthen pommade	Bayer
Isoflurane	Abbot	B506
Anesthesia system for isoflurane	Drager
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Electrosurgical device	ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät
Drill	Proxxon	D-34343
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Xylacine	Albrecht
5ml Syringe	Braun
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Isopentane	Fluka	59070
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Acetic acid	Sigma Life Science	695092
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
C57Bl/6J mice	Charles River	000664