Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

إجراء بأحجام صغيرة للتركيز الفيروسي من المياه

Published: February 3, 2015 doi: 10.3791/51744
Automatic Translation
1, 1
1U.S. EPA

Introduction

الفيروسات المعوية الإنسان هي العوامل المسببة هاما من الأمراض التي تنقلها المياه 1-3، ولكن عادة ما تكون موجودة بأعداد قليلة في المياه الملوثة البيئية، مما يجعل من الصعب الكشف عنها دون تركيز. الإجراءات المستخدمة للتركيز الفيروسات وعادة ما تشمل خطوة الترشيح، وتليها مرشح شطف، والتركيز الثانوي للشطافة التصفية. يعتمد إجراء الترشيح مشترك بشأن استخدام الأغشية المشحونة مثل مرشحات كهربي (استعرضت مؤخرا في 4،5). هذه الفلاتر تعتمد على التقاط الفيروسات العالقة في الماء باستخدام التفاعلات كهرباء بين سطح فلتر (موجبة) وجزيئات الفيروس المستهدفة (سالبة الشحنة). اثنين من المرشحات موجب الشحنة الكهربائية المتوفرة تجاريا تعتمد على هذه التكنولوجيا، والمرشحات الزجاج / السليلوز والنانو الألومينا / الألياف الزجاجية. تكاليف مرشح الزجاج / السليلوز ما يصل إلى 10 مرة من النانو الألومينا / الألياف الزجاجية، التي تحد من استخدام الزجاج / ممرشحات llulose لرصد فيروس الروتيني. وخلصت الدراسات التي أجريت مؤخرا الاختلافات الاسمية بين هذه الفلاتر اثنين في التعافي من الفيروسات المعوية من 6،7 المياه المحيطة، والتي تبرر استخدام مرشح بديل أرخص. وقد تم دراسة خيارات التصفية أخرى مثل مرشحات كهربية والزجاج والصوف، إلا أنها إما تتطلب المعالجة المسبقة لمصدر المياه (الفلاتر كهربية) أو ليست متاحة تجاريا (الفلاتر الزجاج الصوف). وضع إجراءات تركيز الفيروس قد ركزت في معظمها على تحسين تقنيات تركيز الابتدائية (الفلاتر) من أجل تحسين المستردة الفيروس من المياه. ومع ذلك، إجراءات تركيز الثانوية، والتي تقلل من حجم eluant عادة من 1 L لملليلتر مجلدات، ويمكن أيضا أن يكون لها تأثير كبير على المبالغ المستردة فيروس 8.

تركيز الثانوية من الفيروسات المعوية يعتمد عادة على وكيل المرسب مثل بعض أنواع من استخراج لحوم البقر (floccu العضويةlation) أو الحليب منزوع الدسم التلبد 9-12 لإزالة جزيئات الفيروس من الأسطح التصفية. مؤخرا، والإجراءات تركيز ثانوي آخر باستخدام مستخلص اللحم البقري إلى جانب إضافة celite (الجسيمات الدقيقة) وقد أظهرت الوعد لاستعادة اتش، المعوى، ونوروفيروس 8،13،14. Celite أعمال الاعتقال وفقا لمبادئ مماثلة لتلك التي من طريقة التلبد العضوي في أن جزيئات الفيروس نعلق على ويفرج من الجسيمات (الندف أو celite) عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني للمحلول تعليق. تم تقييم مقارنات بين هذه التقنيات تركيز الثانوية اثنين في استرداد اتش مسنبل (ADV) أنواع 40 و 41 8. وخلصت هذه الدراسة إلى أن اثنين من تقنيات تركيز الثانوية كانت مشابهة إحصائيا في التعافي من الفيروسات الغدية. ومع ذلك، يتطلب طريقة التلبد العضوية لمدة 30 دقيقة. حضانة في درجة الحموضة 3.5، في حين أن تقنية celite تتطلب الحضانة أقصر (10 دقيقة) في درجة الحموضة 4.0. وflocculat العضويةكما يتطلب أيون استخدام المعدات المختبرية المكلفة (أجهزة الطرد المركزي) لجمع الجسيمات الندف خلال التركيز العالي، والتقنية celite في المقابل تستخدم المعدات الأساسية فقط المختبر (الترشيح فراغ) لفصل الجسيمات celite من الايقاف.

تركيبات معينة من المرشحات وتقنيات شطف الثانوية يمكن أن يؤثر أيضا المستردة الفيروس. وخلصت إحدى الدراسات أن تركيبات معينة من الابتدائية (الفلاتر كهربي) وتقنيات تركيز الثانوية (celite أو التلبد العضوي) كان لها تأثير كبير على الانتعاش من اتش 13. وتشير هذه النتائج هو مطلوب أن الأمثل من أجل استرداد النحو الأمثل فيروس الهدف من مصفوفة المياه نظرا عند استخدام هذه التقنيات. الأمثل هو مضيعة للوقت، وتجنب عملية شاقة العديد من الباحثين بنشاط منذ سيتم تقييم العديد من المتغيرات (نوع مرشح / العلامة التجارية، ودرجة الحموضة حل شطف، celite / التلبد العضوي).

لهذا لياليtudy، تم وضع إجراءات لتحديد الظروف المثلى لتركيز الفيروس من المياه باستخدام اتش البشري مسنبل سلالات 40 و 41. ومن المفترض، لأن كل نوع الفيروس يعرض مورفولوجية قفيصة فريدة من نوعها ورسوم قفيصة معين، قد تحتاج بروتوكولات تركيز ليكون الأمثل لكل فيروس استهداف من أجل تحقيق الانتعاش الفيروسي الأمثل. وتقدم هذه الدراسة نهجا لADV 40 و 41 تركيز من قبل: 1) تقييم المبالغ المستردة الفيروس في ماء الصنبور باستخدام أقراص فلتر كهربي تليها 2) تقييم طريقة التلبد العضوي أنشئت مقابل تقنية celite بمثابة تركيز الثانوي، و 3) تقييم مخازن شطف للتركيز العالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد زجاجيات والتصفية مساكن

  1. ما لم يذكر خلاف ذلك، وتعقيم جميع الأواني الزجاجية، والمشاريع السكنية والحلول مرشح في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لضمان العقم، وتغطية جميع الفتحات أو الأسطح المكشوفة مع أي من رقائق الألومنيوم أو الورق تأمين الشريط قبل التعقيم.
  2. تجميع جهاز الترشيح عن طريق ربط السكن فلتر (47 مم) إلى 1 L الذراع الجانب مخروطي قارورة. جمع الفلاتر المطلوبة: 47 مم كهربي / كهربية مرشحات القرص.
  3. إعداد 1 L 1.5٪ مستخلص لحم البقر (المرسب، تنتج جزيئات الندف عندما يخفض الحموضة من الحل إلى 3.5، أو عدم المرسب؛ الذي لا الكلي في درجة الحموضة 3.5)، مع 0.05 M الجلايسين، عن طريق إذابة 15 غرام من لحم البقر في استخراج 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وإضافة 3.75 ز الجلايسين.
    ملاحظة: سوف مقتطفات لحم البقر غير المرسب تتطلب إضافة celite قبل التركيز العالي.
  4. إضافة شطف Polyph والصوديوم المضافةosphate لاستخراج لحوم البقر بتركيز 0.1٪.
  5. إضافة 1 M حل حمض الهيدروكلوريك، وانخفاض الحكمة، لخلط استخراج لحوم البقر، حل الرقم الهيدروجيني إلى درجة الحموضة المطلوبة. الأوتوكلاف استخراج لحوم البقر ل15-30 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
  6. قياس 0.1 غرام من غرامة والمتوسطة، أو celite الجسيمات كبير (للاستخدام مع غير المرسب استخراج لحم البقر فقط).
  7. إعداد الفراغ / شفط عن طريق ربط الأنابيب متوافق لمخروطي الجانب الذراع القارورة وبمأخذ التيار فراغ.

2. إعداد حلول والفيروسات المالية

  1. إعداد 1 لتر من 1 M حمض الهيدروكلوريك.
  2. إعداد 1 لتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
  3. يعد حل PBS 1X (137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 1.47 ملي K 2 PO 4، و 4.3 ملي ناه 2 PO 4).
    1. ضبط درجة الحموضة من برنامج تلفزيوني 1X إلى 9.0 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
  4. إعداد وتمييع الفيروس الأسهم إلى 10 -10 4 5 الرقم الأكثر احتمالا (MPN) مل -1 عن طريق خلط 1 مل من فيروس الأسهم مع 9 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني7)، كما هو موضح سابقا 8،13. متجر في -80 ° C في 1 مل مأخوذة.
    1. تعقيم المخزون الفيروس عن طريق تصفية حقنة (0.22 ميكرون حجم المسام) لإزالة الملوثات المحتملة.
  5. الكلور مياه الحنفية
    1. مقياس 1 لتر من ماء الصنبور معقمة باستخدام معقمة تخرج اسطوانة وتصب في كوب 2 L تحتوي على شريط مغناطيسي.
    2. إضافة 0.7 غرام من الصوديوم وحمض وتخلط حتى تذوب حبيبات. ضبط الرقم الهيدروجيني للمياه الصنبور ل7-7.5 إذا لزم الأمر باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك أو 1 M هيدروكسيد الصوديوم الحل.
    3. ارتفاع فيروس ذوبان الجليد (1 مل)، وإضافة حجم كامل من ارتفاع إلى 1 L من إزالة الكلور ماء الصنبور العقيمة. مزيج لمدة 10 دقيقة.
    4. إعداد طريقة فارغة (إزالة الكلور ماء الصنبور دون اتش) مع كل تجربة وعملية في نفس الطريقة كما العينة ارتفعت.

3. إعداد ميليبور تصفية (فلترة) جهاز

  1. إزالة غطاء معقم على السكن التصفية. ضمانصالح سليم بين الإسكان مرشح عاء العلوي والسفلي شاشة التصفية لتجنب تسرب عينة خلال الترشيح.
  2. إزالة غطاء معقم من 1 L مخروطي قارورة. تأكد من أن الفلين وحدة تصفية يلائم بشكل مريح في افتتاح قمة مخروطي قارورة، وخلق ختم جيدة.
  3. إزالة وعاء كبير من حدة مرشح من انخفاض شاشة التصفية، ووضع 47 ملم القرص فلتر كهربي مباشرة على الشاشة مع ملقط معقم. إرفاق مرشح عاء الإسكان إلى أسفل الشاشة والقفل في مكانه من قبل التواء عكس اتجاه عقارب الساعة.

4. مياه الحنفية الترشيح (تركيز الابتدائي)

  1. قياس 100 مل من فيروس ارتفعت مياه الصنبور باستخدام تخرج عقيمة الاسطوانة.
  2. صب 100 مل من فيروس ارتفعت مياه الصنبور في السكن فلتر تحتوي على إما 47 ملم الزجاج مطوي / فلتر السليلوز أو نانو الألومينا / الزجاج مرشح القرص الألياف.
  3. تسمح للماء بالمرور ببطء من خلال التصفية. تطبيق فراغ لطيف لإزالة المخلفات المتبقية سماء الصنبور و من سطح المرشح.
  4. إذا كان استخدام العلاج التربسين، إضافة 5 مل من 0.25٪ التربسين لتصفية السطح واحتضان لمدة 5 دقائق.
  5. غسل التربسين من سطح مرشح باستخدام 50 مل من الماء منزوع الأيونات معقمة.

5. الفيروسات شطف من تصفية (فلترة)

  1. إزالة المساكن مرشح من 2 L مخروطي قارورة، ومكان على 250 مل الجانب الذراع القارورة.
  2. قياس 100 مل من مستخلص اللحم البقري باستخدام اسطوانة تخرج. صب ببطء 100 مل من مستخلص اللحم البقري إلى مساكن التصفية.
  3. السماح استخراج لحوم البقر لتصب من خلال مرشح، واستولت على استخراج لحوم البقر في صغيرة (250 مل) مخروطي قارورة. تطبيق فراغ لسحب المتبقي من خلال استخراج لحوم البقر من التصفية.

6. Celite تركيز الثانوي

  1. قوارير نقل تحتوي على فيروسات مزال إلى لوحة ضجة. إضافة معقم شريط مغناطيسي ومكان على لوحة ضجة، وخلط لخلق دوامة طفيفة.
  2. إضافة 0.1 غرام من celiteمسحوق إلى 100 مل من مستخلص لحم البقر والسماح celite لتفريق. وضع معقم التحقيق درجة الحموضة في استخراج لحوم البقر.
  3. إضافة قطرة من الحكمة 1 M حمض الهيدروكلوريك لاستخراج لحوم البقر لتحقيق درجة الحموضة 4.0. السماح لخلط ببطء لمدة 10 دقيقة.
  4. وضع 47 ملم ما قبل التصفية على السكن فلتر (كما هو موضح سابقا) باستخدام قارورة 2 L مخروطي.
  5. صب 100 مل لحم البقر استخراج / خليط celite على ما قبل التصفية. السماح استخراج لحوم البقر لتصب من خلال. تطبيق فراغ طفيف لسحب المتبقي من خلال استخراج لحوم البقر من التصفية.
  6. وضع أنبوب معدني مشبك على نهاية صنبور الإسكان التصفية. نعلق معقمة 15 مل جمع البولي بروبلين أنبوب إلى أنبوب معدني كليب. وضع الإسكان مرشح مرة أخرى إلى دورق مخروطي سعة.
  7. إضافة 5 مل من العازلة 1X PBS، ودرجة الحموضة 9.0 على celite جمعها على ما قبل التصفية.
  8. السماح PBS بالتنقيط من خلال ما قبل التصفية. تطبيق فراغ طفيف لسحب من خلال برنامج تلفزيوني المتبقية إلى 15 مل أنبوب جمع.

7. العضوية التلبد تركيز الثانوي

  1. نقل الأكواب التي تحتوي على الفيروس مزال إلى لوحة ضجة. إضافة معقم شريط مغناطيسي إلى 100 مل من مستخلص لحم البقر وخلط لخلق دوامة طفيفة.
  2. وضع معقم التحقيق درجة الحموضة في استخراج لحوم البقر.
  3. إضافة 1 قطرة M حمض الهيدروكلوريك الحكمة لاستخراج لحوم البقر وضبط درجة الحموضة إلى 3.5. مزيج لمدة 30 دقيقة.
  4. صب شطافة إلى 250 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية والطرد المركزي في 2،500 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. تخلصي طاف مع الحرص على عدم عدم تعطيل بيليه. Resuspend وبيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 9.
  6. الطرد المركزي تعليق على 4،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تخلصي من طاف وتجاهل بيليه.
  7. ضبط درجة الحموضة إلى 7-7.5، فلتر تعقيم من خلال 0.22 ميكرون تصفية المحاقن وتجميد في -80 ° C.

8. الفيروسية نوكليك حمض استخراج

  1. استخراج الأحماض النووية الفيروسية باستخدام طقم التجارية المناسبة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
<ص الطبقة = "jove_title"> 9. ADV 40/41 QPCR

  1. استخدام الاشعال وتحقيقات، وكذلك مزيج رد فعل وملامح ركوب الدراجات الحرارية كما نشرت 8،13.
    ملاحظة: الحد الأقصى المقدر للكشف عن فحص ما يقرب من 5 وحدات QPCR في رد الفعل.
  2. إضافة مكونات مخاليط PCR التضخيم في تركيزات على النحو التالي: 10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.3)، 50 ملي بوكل، 4.5 ملي MgCl 2، 10 ملم dNTPs، 10 ميكرومتر الاشعال و 1 ميكرومتر التحقيق و 0.5 ميكرولتر من البلمرة بحيث أحجام النهائية من 45 ميكرولتر يمكن أن تضاف إلى العدد المناسب من الآبار ضمن 96-جيدا PCR لوحة رد فعل.
  3. تحميل 45 ميكرولتر من PCR خليط التضخيم إلى كل بئر المناسب ل96-جيدا، رد فعل سريع PCR لوحة.
  4. إضافة 5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المستخرج من الآبار المناسبة من لوحة PCR.
  5. تغطية لوحة مع حرارة ختم غطاء مقاومة، وتدور لوحة لنقل أي قطرات في قاع الآبار PCR لوحة.
  6. تعيين دورات التضخيم PCR كما الفلالدودة الحلزونية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.

10. تحليل البيانات

  1. تحليل القياسات ثلاث نسخ من مسلسل التخفيفات 5 أضعاف من العينات التي تغطي 1: 5-1: مجموعة 625 التخفيف من أجل تحديد عدد الأكثر احتمالا (MPN) من الجسيمات الفيروسية، كما هو موضح سابقا 8،13.
  2. تحليل مسلسل التخفيفات 5 أضعاف من المسامير التجريبية اتش تمتد 1: 5-1: النطاق 15625 التخفيف من أجل تحديد عدد الأكثر احتمالا (MPN) من الجسيمات الفيروسية.
  3. باستخدام آلة حاسبة وكالة حماية البيئة MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html)، وضبط آلة حاسبة لحساب نوع من التخفيف (1: 5 أو 1:10)، وعدد من التخفيفات القيام بها، وعدد من تكرار العينات في سلسلة التخفيف.
  4. أداء تسجيل 10 تحويل البيانات، تليها تطبيع إلى وحدة الحجم (على سبيل المثال، 1 مل، 100 مل، الخ
  5. تقييم تأثير المتغيرات التجريبية المختلفة (على سبيل المثال، أنواع مختلفة celite، ويتراوح الرقم الهيدروجيني، وأنواع مختلفة مرشح وتقنيات تركيز الثانوية مختلفة) على المبالغ المستردة ADV عن طريق إجراء الاختبارات الإحصائية المعلمية أو غير المعلمية (على سبيل المثال، تقرن اختبار t، واحد أو اثنين -way ANOVA) تبعا لتوزيع البيانات والتصميم التجريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Celite اختيار

تم اختبار ثلاثة أنواع مختلفة من celite قبل اختيار الخيار الأفضل أداء. Celites مع غرامة لجسيمات متوسطة الحجم تنتج أعلى المبالغ المستردة اتش. أدى استخدام celites أكبر في انخفاض المبالغ المستردة لكلا AdV40 و 41 (المدى 32٪ -100٪) (الشكل 1). كانت المبالغ المستردة متوسط ​​اتش 40 144٪ ± 52٪ (غرامة)، 115٪ ± 28٪ (وسط) و 82٪ ± 53٪ celites (كبير) الجسيمات وAdV41، 132٪ ± 39٪ (غرامة)، 83٪ ± 25٪ (وسط) و 50٪ ± 11٪ (كبير). في اتجاه واحد أشار ANOVA تقنية celite الأمثل استعادت مستويات مماثلة إحصائيا من AdV40 (P = 0.7920) و 41 (P = 0.1439) إلى أن الأسلوب التلبد العضوي، الذي تعافى 75٪ ± 19٪ و 109٪ ± 16٪، على التوالي . ويوضح الشكل 1 الفروق بين تقنيات تركيز الثانوية وبين ADV أنواع.

_content "> تقييم نوع تصفية (فلترة)

تركزت مائة حجم ملليلتر من-ارتفعت الفيروس، ماء الصنبور باستخدام إما مطوي الزجاج / السليلوز أو / الزجاج نانو الألومينا مرشح القرص الألياف وتم معالجتها باستخدام إما celite أو طريقة التلبد العضوي. ومزال المرشحات مع مقتطفات لحوم البقر في درجة الحموضة 7.5، 9.0، 9.5، 10، 11 و 12 لتحديد التي من شأنها أن تكون أكثر فعالية في جزيئات يبلغ حجمه ADV من المرشحات. مرشح الزجاج / السليلوز إلى جانب استخراج لحوم البقر في درجة الحموضة 10 و celite، أنتجت أعلى المبالغ المستردة (عن طريق QPCR / MPN) لAdV40 (52٪ ± 22٪) وAdV41 (64٪ ± 4٪) التي تظهر في أرقام 2 و 3. لحم البقر استخراج الرقم الهيدروجيني 10 تعافت AdV41 أعلى بكثير من كل القيم الرقم الهيدروجيني الأخرى (مجموعة قيمة P: ،0045-0،041)، بينما تبعه AdV40 مماثل، على الرغم من اتجاه أضعف إلى حد ما (مجموعة قيمة P: 0،025-0،042). تم تقييم مرشح الزجاج / السليلوز أيضا بالتزامن مع flocculatio العضويةطريقة ن. لAdV40، وقد اكتسبت المستردة أعلى بكثير باستخدام مستخلص لحم البقر الرقم الهيدروجيني 10 (40٪ ± 10٪) (مجموعة قيمة P: 0،010-0،027)، وAdV41، سواء درجة الحموضة 9.5 و 10 تفوقت كل اختبار آخر مستخلص لحم البقر الرقم الهيدروجيني (مجموعة قيمة P : 0،023-0،027) (أرقام 2 و 3). وعموما، تم العثور على تقنية celite مع استخراج لحوم البقر الرقم الهيدروجيني 10 لتكون متفوقة على طريقة التلبد العضوية في المقارنات المباشرة لاسترداد كل من سلالات ADV.

تحسينات من الإضافات استخراج لحوم البقر

تمت مقارنة الطريقة الأمثل (زجاج / فلتر السليلوز يستخدم مستخلص لحم البقر الرقم الهيدروجيني 10 إلى جانب celite تركيز الثانوي) لاثنين من العلاجات الأخرى: 1) إضافة 0.25٪ التربسين و2) المكمل لاستخراج لحم البقر مع 0.1٪ متعدد الفوسفات الصوديوم. لم إضافة التربسين لا تظهر لتحسين الانتعاش من ADV كنسبة مئوية فقط 16 ± 6٪ و 24٪ ± 14٪ من AdV40 و 41 المدخلات، على التوالي تم انتشال (< قوي الشكل> 4). استخراج اللحم البقري تستكمل مع 0.1٪ متعدد الفوسفات الصوديوم حقق أعلى المبالغ المستردة من AdV40 و 41 مقارنة بما كان عليه من الأسلوب الأمثل السابق. انتعاش AdV40 يبدو أن زيادة بنسبة 13٪، و ارتفع الانتعاش AdV41 7٪ خلال الطريقة السابقة، ولكن هذا لا يعتد به إحصائيا (قيمة P: 0.146). تم العثور على استخدام نسب أعلى من متعدد الفوسفات الصوديوم 1٪ و 3٪ و 5٪ (لا تظهر البيانات) لتكون غير فعالة، مما يتطلب كميات كبيرة من حمض لضبط درجة الحموضة من هذه الحلول إلى 4.0 خلال تركيز الثانوي.

الشكل (1)
الشكل 1: الانتعاش في المئة من ADV-40 و ADV-41 على أساس تقنية تركيز الثانوية (Celite مقابل العضوية الندف) ونوع Celite المستخدمة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (ن = 3) 8.

"FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 2
الشكل 2: الانتعاش في المئة من ADV-40 باستخدام نوعين من تقنيات تركيز الثانوية (Celite والندف العضوي) ونوعين من الفلاتر (زجاج / السليلوز ونانو الألومينا / الزجاج) عند مستويات مختلفة من درجة الحموضة من استخراج لحوم البقر. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (ن = 3) (13).

الشكل (3)
الشكل 3: الانتعاش في المئة من ADV-41 باستخدام نوعين من تقنيات تركيز الثانوية (Celite والندف العضوي) ونوعين من الفلاتر (زجاج / السليلوز ونانو الألومينا / الزجاج) عند مستويات مختلفة من درجة الحموضة من استخراج لحوم البقر. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (ن = 3) (13).

"> الشكل (4)
الشكل 4: تأثير المواد المضافة شطف على التعافي من ADV 40 و 41 ADV تتركز باستخدام Celite كأسلوب تركيز الثانوية والزجاج / السليلوز. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (ن = 3) (13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مرشحات كهربي مفيدة في التركيز الفيروسات من الماء. ولكن هذه الفلاتر يمكن أن تختلف في بنيتها وتكوينها والتي يمكن بدورها تغير فعاليتها. ومما يزيد هذه المشكلة، والهياكل قفيصة والرسوم تختلف بين سلالات الفيروس التي تتطلب تقنيات تركيز تكون مصممة لضمان استرداد الأمثل 15. من خلال تعديلات بسيطة من تقنيات تركيز القائمة (على سبيل المثال، والمرشحات كهربي، ولحم البقر استخراج شطف)، والتركيز أكثر فعالية من الفيروسات الهدف لا يمكن أن يتحقق 16،17.

وقد ركزت الأبحاث حتى الآن عادة على التعافي من الفيروس عن طريق تعديل التركيز الأساسي (الفلاتر) خطوات، ولكن تم إعطاء القليل من الاهتمام لإجراءات تركيز اللاحقة التي يمكن أيضا أن تؤثر على الانتعاش فيروس (18). وقد ثبت أن تقنيات تركيز الثانوية مختلفة يمكن أن تؤثر على المبالغ المستردة فيروس 6،13،19،20. CELIوقد تبين تركيز الشركة المصرية للاتصالات لاستعادة مستويات مماثلة من الفيروس إلى أن أساليب تركيز ثانوية أخرى 8،14 من مجموعة متنوعة من المصفوفات، أثناء استخدام أسرع وإجراءات تجهيز العينات أبسط.

بسبب الهياكل قفيصة الخارجية متفاوتة، بعض الفيروسات يمكن أن تصبح محاصرين جسديا داخل المصفوفة مرشح 21، مما يستلزم تقييم الإضافات المختلفة لتصفية بروتوكولات شطف. على سبيل المثال، إضافة السطحي، وتحسين متعدد الفوسفات الصوديوم الانتعاش البكتيرية والفيروسية على حد سواء خلال التركيز الأساسي 6،13،22-24. من ناحية أخرى، لوحظ انخفاض المبالغ المستردة بعد إضافة التربسين تشير إلى أن البروتياز لا تساعد في الانقسام من ألياف البروتين على قفيصة الفيروسية الخارجي. وعلاوة على ذلك، في حين ليس من غير المألوف 7،25،26، تجدر الإشارة إلى أن بعض المبالغ المستردة لدينا كانت في أكثر من 100٪. كما هو موضح سابقا 7،25،26، وهذا هو الأرجح بسبب تراكمها من مختبر إعداد السادسروس تستخدم ارتفاع.

حجم صغير (100 مل فيروس ارتفعت المياه) قدم نهج تركيز يمكن أن يكون وسيلة عملية لتطوير وتحسين أساليب تركيز الفيروس، نظرا لبساطته والاستهلاك المنخفض للموارد جنبا إلى جنب مع وقت سريع تجهيز العينات. باستخدام هذه كميات صغيرة من الماء، والتقليل أيضا من تركيز مثبطات PCR داخل العينة، ومع ذلك فمن المستحسن أن كل مصدر المياه يتم تقييم لوجود مثبطات PCR قبل التجريب. منذ العديد من الخيارات في كل من الفلاتر وتقنيات تركيز الثانوية موجودة، تقنيات تركيز حجم صغيرة تسمح للتقييمات سريعة للعديد من المتغيرات. ومن المؤمل أن هذه التقنيات يمكن نشرها قبل التجريب الترشيح على نطاق واسع للمساعدة في تحديد الشروط التي هي الأمثل لتركيز الفيروس الهدف في إعطاء المصفوفات المياه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenovirus 40 stock ATCC VR-931
Adenovirus 41 stock ATCC VR-930
Sodium Thiosulfate Fluka Chemical Co. 72051
Celites #577 Fluka Chemical Co. 22142
NanoCeram 47 mm Argonide N/A
1MDS 47 mm 3M 6408502
AP-20 Prefilter 47 mm Millipore Corp. AP2004700
Glycine  Sigma 50046-1KG
Sodium Polyphosphate Acros Organics 390930010
Trypsin Gibco 25200
PBS Sigma P5368
Hydrochloric Acid Fisher A481-212
BBL Beef Extract BD Biosciences 212303
Difco Beef Extract BD Biosciences 211520
ABI 7900 Real-time PCR system ABI N/A
Stainless Steel Filter Housing Millipore Corp. XX2004720
Blood DNA Extraction Kit Qiagen  51104
EPA MPN Calculator http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
  2. WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
  3. Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
  4. Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
  5. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
  6. Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
  7. Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
  8. McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
  9. Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
  10. Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
  11. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
  12. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
  13. McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
  14. Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
  15. Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
  16. He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
  17. Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
  18. Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
  19. Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
  20. Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
  21. Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
  22. Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
  23. Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
  24. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
  25. Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
  26. Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).

Tags

علم الفيروسات، العدد 96، اتش، Celite تركيز، عضوي التلبد، 1MDS فلتر، فلتر NanoCeram، QPCR
إجراء بأحجام صغيرة للتركيز الفيروسي من المياه
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMinn, B. R., Korajkic, A. A Small… More

McMinn, B. R., Korajkic, A. A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water. J. Vis. Exp. (96), e51744, doi:10.3791/51744 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter