Introduction
人类肠道病毒是水源性疾病1-3中重要病原体，但一般存在于被污染的环境水低的数字，使得它们的检测困难而不浓度。用于浓缩病毒程序通常包括一个过滤步骤中的过滤器的洗脱液中，接着过滤洗脱，和仲浓度。一个常见的过滤方法依赖于使用荷电膜，如正电的过滤器（最近在4,5审查）的。这些过滤器依赖于捕捉的病毒悬浮在水中使用的过滤表面（正电荷）和靶向的病毒颗粒之间的静电相互作用（带负电）。两个正电的过滤器是商业上可用的依赖于该技术中，玻璃/纤维素和纳米氧化铝/玻璃纤维过滤器。该玻璃/纤维素滤器成本高达10倍，该纳米氧化铝/玻璃纤维的，其限制使用的玻璃/ CE的llulose过滤器进行例行病毒监控。最近的研究已经得出结论差异是名义在从室温水中6,7肠道病毒的恢复这两个滤波器之间，证明使用一种更便宜的过滤器的替代。其他过滤选项，例如带负电和玻璃毛过滤器进行了研究，然而，他们要么需要源水（电负性过滤器）的预处理或没有市售的（玻璃毛过滤器）。的病毒浓度程序的发展主要集中在以提高病毒回收率从水优化初级浓缩技术（过滤器）。然而，次级浓度程序，其中降低洗脱液的体积通常为1升至毫升卷，也可对病毒回收率8显著影响。
的肠道病毒次要浓度通常依赖于絮凝剂如一些类型的牛肉提取物（有机floccuLATION）或脱脂奶絮凝9-12从过滤器表面除去病毒颗粒。最近，利用再加上另外硅藻土（细颗粒）的牛肉膏另一二次浓度过程已表明承诺回收腺病毒，肠道病毒，诺如病毒和8,13,14。根据相似的原理，以在该病毒颗粒中的有机絮凝方法的硅藻土的浓度的作品附加到并通过改变悬浮液的pH释放从粒子（絮凝物或硅藻土）。这两个次级浓缩技术之间的比较中尖刺腺病毒（ADV）类型40和41 8的恢复已被评估。该研究的结论是，两个次级浓缩技术人腺病毒的回收统计学相似。然而，有机絮凝方法需要30分钟。孵育在pH 3.5，而硅藻土技术需要一个较短的温育（10分钟），在pH 4.0。有机flocculat离子也需要使用昂贵的实验室设备（离心机）叔浓缩过程中收集的絮凝物颗粒，与此相反的硅藻土技术仅使用基本的实验室设备（真空过滤），以硅藻土颗粒从悬浮液中分离出来。
过滤器和二次洗脱技术的某些组合也可影响病毒的回收率。一项研究的结论是，初级（正电的过滤器）的某些组合和次级浓缩技术（硅藻土或有机絮凝）的 腺病毒13的回收的显著影响。这些结果表明，优化使用这些技术时，需要以最佳地从给定的水基质回收靶病毒。优化是一个耗时的，艰苦的过程许多研究者积极避免，因为无数的变量进行评估（过滤器类型/品牌，pH值洗脱液，硅藻土/有机絮凝）。
对于这种Study，一个步骤，开发了使用加标人腺病毒株40和41可以推测，以确定病毒浓度的最佳条件，从水，由于每个病毒类型显示了独特的衣壳形态和特定的衣壳电荷浓度的协议可能需要对每个病毒进行优化目标，以达到最佳的病毒回收。本研究为腺病毒40和41浓度的方法：1）评估病毒回收率自来水使用阳电过滤盘之后2）建立有机絮凝法对硅藻土技术作为辅助的浓度评价，以及3）评估洗脱缓冲液为大专浓度。
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Protocol
1.准备玻璃器皿和过滤器外壳
- 除非另有说明，所有消毒玻璃器皿，过滤器外壳和溶液在121℃下进行15分钟。为了保证无菌，覆盖所有开口或暴露的表面或者用铝箔或胶带固定前消毒纸。
- 通过将过滤器壳（47毫米直径）以1 L侧臂Erlenmeyer烧瓶装配过滤装置。收集所需的过滤器：直径47 mm正电/负电盘式过滤器。
- 制备1L的1.5％牛肉提取物（凝聚;产生的絮凝物颗粒时溶液pH值降低至3.5，或不絮凝;其中不聚集在pH 3.5），用0.05M甘氨酸，溶解15克牛肉提取物中的1升的去离子水并加入3.75克甘氨酸。
注：非絮凝牛肉提取物将需要叔胺浓度，然后加入硅藻土。 - 加入洗脱添加剂钠polyphosphate牛肉提取物在0.1％的浓度。
- 添加1M盐酸溶液，逐滴，以混合牛肉提取物，pH值溶液至所需的pH值。蒸压牛肉提取物在121℃15-30分钟。
- 衡量0.1克精细，中型或大型粒子硅藻土（与唯一的非絮凝牛肉膏使用）的。
- 通过附加兼容油管锥形侧臂烧瓶中，并于真空出口准备真空/抽吸。
2.准备解决方案和病毒股票
- 制备1升的1M HCl中。
- 制备1升的1M NaOH处理。
- 制备的1×PBS溶液（137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，1.47毫K 2 PO 4，和4.3毫摩尔的NaH 2 PO 4）。
- 调节pH的1×PBS的9.0使用1M的NaOH。
- 准备和稀释股票的病毒，以10 4 -10 5最可能数（MPN）毫升-1混合1毫升股票病毒的9毫升的PBS（pH值7），如先前所描述的8,13。储存在-80℃下在1ml等分试样。
- 消毒病毒的股票通过注射器过滤（0.22微米孔径），以消除潜在的污染物。
- 脱氯自来水
- 措施1升用无菌无菌自来水量筒并倒入含有磁性搅拌棒的2升烧杯中。
- 加入将0.7克的硫代硫酸钠并混合直到颗粒溶解。如果使用1M HCl或1M的NaOH溶液根据需要调整pH值的自来水至7-7.5。
- 解冻的病毒刺突（1毫升）中，并添加穗总体积为1升的无菌脱氯自来水。混合10分钟。
- 制备方法空白（无腺病毒脱氯自来水）与每个实验和过程中相同的方式加标样品。
3.制备微孔过滤装置
- 删除无菌占地过滤器外壳。保证过滤器外壳上碗，下滤网之间适当的配合在过滤过程中，避免样品泄漏。
- 从1升锥形瓶中取出无菌覆盖。确保过滤器单元的软木紧密地配合在锥形瓶中的顶部开口，创造了良好的密封。
- 从较低的过滤网拆下顶部碗过滤单元，并将47毫米阳电滤盘正视屏幕上用无菌镊子。安装过滤器外壳碗底部的屏幕并锁定到位逆时针扭动。
4.自来水过滤（主浓度）
- 取100mL病毒的尖刺用无菌量筒自来水。
- 倒入百毫升病毒飙升自来水到含有无论是47毫米折叠玻璃/纤维素过滤器或纳米氧化铝/玻璃纤维盘滤清器滤芯外壳。
- 让水慢慢穿过过滤器。适用于温和真空去除剩余的残留物Ø从过滤面F的自来水。
- 如果使用胰蛋白酶处理，加入5 ml 0.25％胰蛋白酶的过滤表面并孵育5分钟。
- 从用50毫升无菌去离子水过滤表面清洗胰蛋白酶。
从过滤器5.病毒洗脱
- 从2升Erlenmeyer烧瓶中除去过滤器壳体，并放置到250毫升侧臂烧瓶中。
- 取100mL牛肉膏的使用量筒。慢慢倒入100毫升牛肉膏进入过滤器外壳。
- 允许牛肉提取倒通过过滤器，捕获牛肉提取在一个小的（250毫升）的Erlenmeyer烧瓶中。运用真空过滤从通过残余的牛肉膏拉。
6.硅藻土二级浓度
- 传输瓶中含有洗脱病毒的轰动板。加灭菌磁力搅拌棒并将其放置在搅拌盘，搅拌创造轻微的漩涡。
- 添加0.1克的硅藻土粉末至100毫升牛肉提取物，并允许硅藻土分散。将无菌的pH探头放入牛肉膏。
- 添加逐滴1 M盐酸至牛肉膏实现pH值4.0。允许缓慢混合10分钟。
- 放置使用的2L Erlenmeyer烧瓶47毫米预过滤到过滤器外壳（如前所述）。
- 在预过滤倒入百毫升牛肉膏/硅藻土混合。让牛肉膏倒过。适用于轻微的真空过滤器，从通过剩余牛肉膏拉。
- 将金属管夹上的过滤器外壳喷结束。附加的无菌15mL的聚丙烯管中收集到金属管夹。放置过滤器壳体回Erlenmeyer烧瓶。
- 加入5毫升的1×PBS缓冲液，pH 9.0经硅藻土上收集的预过滤器。
- 让PBS滴通过预过滤器。适用于轻微的真空通过残余的PBS拉成15个ml收集管。
7.有机絮凝二级浓度
- 传输含病毒洗脱的烧杯，以小的轰动板。加灭菌磁力搅拌棒至100毫升牛肉提取物和混合创造轻微的漩涡。
- 将无菌的pH探头放入牛肉膏。
- 添加1M的HCl滴至牛肉提取物和调节pH值至3.5。拌30分钟。
- 倾洗脱液于250毫升的离心锥形管和离心机在2500×g离心15分钟，在4ºC。
- 倒掉上清，注意不要不要破坏沉淀。重悬在5ml的1×PBS，pH值9的颗粒。
- 离心该悬浮液在4000×g离心10分钟，在4ºC。倒掉上清弃沉淀。
- 将pH调节至7-7.5，过滤消毒通过0.22微米注射器式滤器并冷冻在-80℃。
8.病毒核酸提取
- 提取根据制造商的说明，用适当的市售试剂盒的病毒核酸。
- 使用引物和探针，以及反应混合物和热循环曲线所公布8,13。
注：检测化验的估计上限是每反应约5 qPCR的单位。 - 添加的PCR扩增混合物组分的浓度如下：10毫摩尔Tris（pH值8.3），50mM的氯化钾，4.5毫的MgCl 2，10毫的dNTPs，10μM引物和1μM的探针和0.5微升聚合酶以便在45最终卷微升可以加入到孔中的适当数量的96孔PCR反应板内。
- 负载45微升的PCR扩增混合物中，96孔，快速反应的PCR板的每个相应井。
- 加入5微升DNA提取样本的PCR板的合适的孔中。
- 捂盘与耐热盖密封，旋转盘移动任何液滴PCR板孔底部。
- 设置PCR扩增循环的FOLL流入的：95℃10分钟，随后为15秒的40个循环的95℃和60℃进行1分钟。
10.数据分析
- 为了确定病毒颗粒的最大可能数（MPN）625稀释范围，如前所述8,13：分析跨越1的样本的序列5倍稀释液的一式三份测量：5至1。
- 为了确定病毒颗粒的最大可能数（MPN）15625稀释范围：腺病毒实验尖峰跨越1的串行5倍稀释液分析：5到1。
- 使用的EPA MPN计算器（http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html），调整计算器占稀释的类型（1：5或1:10），进行稀释的数量，以及数复制样品连续稀释。
- 执行日志中的数据，随后归一体积的单位（ 例如 1毫升，100毫升， 等 10变换
- 评估不同实验变量的影响（ 例如，不同的硅藻土的类型，pH值范围，不同的滤波器类型和不同的次级浓缩技术）上的AdV回收率通过执行参数或非参数统计测试（ 例如 ，配对t检验，一个或两个往来港澳ANOVA），根据数据的分布和实验设计。
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Representative Results
硅藻土选择
三种不同类型的硅藻土进行之前表现最好的变体的选择进行测试。 Celites细到中等大小的粒子产生的最高腺病毒回收率。使用较大celites导致较低的回收率为AdV40和41（范围为32％-100％）（ 图1）。腺病毒40的平均回收率为144％±52％（精细），115％±28％（中）和82％±53％（大）颗粒celites和AdV41，132％±39％（精细），83％±的25％（培养基）和50％±11％（大）。单向ANOVA指示的优化硅藻土技术回收AdV40（P = 0.7920）和41（P = 0.1439）的统计学上相似的水平，以使有机絮凝方法，该方法分别回收75％±19％和109％±16％，对图1示出了其中的二次浓度的技术和腺病毒类型之间的差异。
_content“>过滤器类型评价病毒-飙升，自来水加100毫升体积使用一个折叠玻璃/或纤维素纳米氧化铝/玻璃纤维盘式过滤浓缩，并用无论是硅藻土或有机絮凝法处理。滤膜洗脱牛肉提取物，在pH 7.5，9.0，9.5，10，11和12，以确定这将是最有效的从过滤器洗脱的AdV颗粒。再加牛肉提取，在pH 10和硅藻土的玻璃/纤维素滤器，产生的最高回收率（通过qPCR / MPN）为AdV40（52％±22％）和AdV41（64％±4％），其示于图2和3。牛肉提取物的pH 10回收比所有其它的pH值显著更高AdV41（P值范围：0.0045-0.041），而AdV40遵循类似，虽然稍差的趋势（P值范围：0.025-0.042）。玻璃/纤维素滤器还评价结合有机絮凝N法。对于AdV40，显著更高的回收率用牛肉膏pH为10（40％±10％）（P值范围：0.010-0.027）获得，以及用于AdV41，无论pH为9.5和10优于所有其他牛肉浸膏pH值测试（P值范围：0.023-0.027）（ 图2和3）。总体而言，与牛肉提取pH为10的硅藻土技术被认为是优越的，以在两个腺病毒株的恢复直接比较有机絮凝方法。
在牛肉膏添加剂的优化
优化的方法（使用玻璃/纤维素滤器牛肉提取pH为10加上硅藻土次级浓度）相比，其他两个处理：1）添加0.25％胰蛋白酶和2）补充的牛肉膏，0.1％聚磷酸钠。加入胰蛋白酶并未以提高腺病毒的回收率，因为只有16％±6％和24％±AdV40的14％和41的输入，分别回收（< STRONG>图4）。牛肉提取物补充有0.1％的多聚磷酸钠，得到最高回收率AdV40和41相比，在以前的最优化方法。 AdV40复苏出现了13％的增加，而AdV41恢复了以前的方法增加了7％，但也有统计学显著（P值：0.146）。使用多磷酸钠更高的百分比为1％，3％和5％（数据未示出）被认为是无效的，因此需要大量的酸的次级浓缩过程中以调节pH这些解决方案，以4.0。
图1：ADV-40和ADV-41基于次级浓缩技术（硅藻土与有机絮），并用硅藻土的类型回收率。误差棒代表标准偏差（n = 3）8。
图2：使用两种类型的次级浓缩技术（硅藻土和有机絮）和两种类型的滤波器（玻璃/纤维素和纳米氧化铝/玻璃），在牛肉提取物的不同pH水平ADV-40％的恢复。误差棒代表标准偏差（n = 3）13。
图3：在使用两种类型的次级浓缩技术（硅藻土和有机絮）和两种类型的滤波器（玻璃/纤维素和纳米氧化铝/玻璃），在牛肉提取物的不同pH水平ADV-41的回收率。误差棒代表标准偏差（n = 3）13。
图4：使用硅藻土作为二次浓缩技术和玻璃/纤维素洗脱添加剂对腺病毒40和腺病毒41的恢复的影响浓缩。误差棒代表标准偏差（n = 3）13。
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Discussion
阳电过滤器是集中在水的病毒有效;然而，这些过滤器可以在它们的结构和组合物，其可以反过来改变其效力不同。私了这个问题，衣壳的结构和收费病毒株需要浓缩技术进行定制，以确保最佳恢复15之间变化。通过对现有的浓度的技术（ 例如，正电性的过滤器，牛肉提取物洗脱），靶病毒更有效浓度可以达到16,17简单的修改。
研究迄今为止通常集中于病毒的回收，通过修改主浓度（过滤器）的步骤，但很少有人注意给予随后浓缩程序，这可能也影响病毒回收18。已经证明，不同的仲浓度的技术可以影响病毒回收率6,13,19,20。侧立德的浓度已显示回收病毒的相似水平到的从各种基体的其他次级浓缩方法8,14，采用更快和更简单的样品处理过程的同时。
由于不同的外衣壳结构，某些病毒可以成为物理过滤器矩阵21内被困，因此需要不同的添加剂的评估筛选洗脱协议。例如，加入表面活性剂，多聚磷酸钠提高主浓度6,13,22-24中细菌和病毒的回收。另一方面，低的回收率观察下列添加胰蛋白酶表明蛋白酶不要在蛋白质纤维的切割在外病毒衣壳帮助。此外，虽然不常见7,25,26，值得注意的是，我们的一些回收率均超过100％。如前所示7,25,26，这可能是由于实验的结团制备六作为秒杀RUS。
小体积（100毫升病毒掺入水）的浓度的方法提出了可以开发和优化的病毒浓缩方法，由于它的简单性和资源消耗低连同快速样品处理时间的实际可行的方法。使用这种小体积的水，在样品内PCR抑制剂的浓度也被最小化，但是，建议每个源水进行PCR抑制剂的前实验的存在进行评估。因为这两个过滤器和二次浓缩技术的众多的选择存在，小体积浓度技术允许众多变量的快速评估。希望这些技术能之前大规模的过滤试验部署确定哪些条件是最适合每个给定的水基质中目标的病毒浓度，以帮助。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
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